UPLC-MSMS法同時測定配合飼料中9種藥物

趙健，付巖，王全勝

(寧波市農業科學研究院 寧波市農產品質量檢測中心，浙江 寧波 315040)

配合飼料是由糧谷和不同營養組分等按特定配比配制而成，是畜禽的食物。飼料的質量決定了畜產品的質量，畜產品的質量問題可以從飼料質量檢驗中找出。糧谷生長過程中，農藥被用來防治病蟲草害[1]；真菌毒素、嘔吐毒素等產生于糧谷種植和貯藏過程[2]；抗生素被一些飼料生產企業和養殖企業在飼料中違規使用[3]。因此，配合飼料存在3類有毒有害物質超標的風險，對畜禽產品造成污染，最終通過食物鏈轉移到人體內，所以對飼料中3類有毒有害物質的監測非常必要。3類藥物，目前檢測儀器主要有液相色譜[4-6]、氣相色譜[7-8]、UPLC-MSMS[9-11]、氣質聯用(GC-MS)[12-15]等，但仍以單類農藥殘留、獸藥殘留和真菌毒素為主，同時檢測配合飼料中3種有毒有害物質的方法仍少見。本文擬開發配合飼料中農藥殘留、獸藥殘留和真菌毒素等3大類，共9種(黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素、磺胺間甲氧嘧啶、恩諾沙星、金剛烷胺、三唑磷、多菌靈、甲草胺)同時檢測方法。旨在為配合飼料樣品快速檢測3類有毒有害物質提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲酸、甲醇、乙腈，色譜純；超純水；多壁碳納米管、N-丙基乙二胺、C18購于上海安譜；黃曲霉毒素B1(AFB1)、嘔吐毒素(DON)、玉米赤霉烯酮購于加拿大Toronto Research Chemicals(TRC)，磺胺間甲氧嘧啶、恩諾沙星、金剛烷胺購于德國Dr.Ehrenstorfer公司，三唑磷、多菌靈、甲草胺購于天津環保，固標均大于95%，液標含量為1 000 mg·L-1；仔豬配合飼料。

Milli-QADVA10超純水儀；Waters UPLC/XEVO TQ MS；SIGMA 離心機；Mettler-Toledo 電子天平(XPE205、PL3002)；IKA控溫搖床；Organomation 氮吹儀；IKA T25 digital勻漿機。

1.2 溶液配制

1.2.1 儲備和工作標液配制

乙腈溶解適量AFB1、DON、玉米赤霉烯酮、磺胺間甲氧嘧啶、恩諾沙星等固標，得到100 mg·L-1儲備液；三唑磷、多菌靈、甲草胺轉移并稀釋至乙腈相中，得到100 mg·L-1儲備液；乙腈配制5 mg·L-1工作液。

1.2.2 基質標液配制

按1.3節前處理，得到的空白樣液，將5 mg·L-1工作液稀釋至系列基質標液，隨配隨用。

1.2.3 提取溶液配制

按照體積比，將乙腈、水、甲酸混合配制成提取液：90∶9∶1、80∶19∶1、70∶29∶1等3種。

1.2.4 定溶液

按9∶1體積比，將0.1%甲酸水溶液、乙腈配制成定溶液。

1.3 樣品前處理

準確稱飼料2.00 g于塑料離心管中，添加10.00 mL提取液，勻漿機10 000g勻漿1 min，搖床振蕩30 min，10 000g離心5 min。分取4.00 mL提取液到含40 mg多壁碳納米管的離心管，渦旋1 min后再10 000g離心5 min；移2.50 mL上清液在水浴40 ℃條件下氮吹近干，用1 mL定溶液溶解殘液，轉移至2 mL離心管中15 000g離心5 min，UPLC-MSMS測定。

1.4 液相色譜條件

柱子為Waters BEH C18，1.7 μm；樣品室20 ℃，柱溫40 ℃；進樣量5 μL。流動相∶乙腈(A)和0.1%(V∶V)甲酸水溶液(B)；梯度洗脫：0～1.5 min，維持10%A；1.5～2.5 min，10%A線性變化至90%A；2.5～7.0 min，維持90%A；7.0～7.1 min，90%A線性變化至10%A；7.1～10 min，維持10%A。

1.5 質譜條件

ESI源(正負同時掃描，MRM)，毛細管電壓2.5 KV/-2.0 KV，霧化氣1 000 L·h-1，錐孔氣50 L·h-1；源溫150 ℃；霧化溫度500 ℃。各化合物的質譜條件如表1。

表1 MRM質譜采集參數

2 結果與分析

2.1 前處理方法的優化

2.1.1 提取溶劑的優化

飼料含豐富的蛋白質等營養物質、含水量較低，9種藥物中恩諾沙星和金剛烷胺等含酸堿性基團。所以有機相選用乙腈，以沉淀樣品中蛋白質等雜質，水相選用加入適量甲酸的水溶液，以提高回收率。本文采用1.2.3節中列出的，乙腈、水、甲酸等按照不同體積配比配制出的3種提取液，對3大類9種藥物提取效果進行考察。結果表明，3種提取液，對9種藥物的回收率均可達到75%～120%，考慮到樣品中藥物含量較低，為提高靈敏度便于濃縮，選擇體積比90∶9∶1為提取液。

2.1.2 凈化材料的選擇

飼料提取液中雜質復雜，顏色深黃。為減少儀器基質效應，更好保護儀器，減少污染，篩選了N-丙基乙二胺、C18、多壁碳納米管等凈化材料。以2.1.1優化得到的提取液空白，加入適量濃度9種藥物，用不同質量的3種材料進行凈化，篩選其凈化效果。經過試驗證明，4.00 mL提取液3種凈化填料在適當質量下，回收率均控制在80%～120%，但是多壁碳納米管能更有效地去除色素，所以選為凈化材料，使用40 mg。

2.2 色譜條件的優化

文中比對了甲醇和乙腈作為有機相，純水和0.1%甲酸水溶液作為水相，共4組流動相，并對梯度進行了優化。水相為純水時，恩諾沙星、金剛烷胺和磺胺間甲氧嘧啶等藥物峰形均較差，其他藥物均可得到滿意的靈敏度和峰型；但若水相加入0.1%甲酸時，9種藥物均得到滿意峰型和靈敏度，乙腈做流動相時大多藥物靈敏度優于甲醇，故選擇乙腈/0.1%甲酸水作流動相。

2.3 質譜條件的優化

配置成2 mg·L-1的9種藥物標液，流動相按照2.2節色譜條件優化所得的流動相。標液通過儀器蠕動泵泵入質譜，電噴霧離子源(ESI)(正負同時掃描)得到母離子，玉米赤霉烯酮為ESI-，得到穩定母離子[M-H]-；其他藥物為ESI+，得到穩定母離子[M+H]+。確定母離子之后，再使用waters質譜自帶的IntelliStart技術，自動對9種藥物子離子及其參數進行優化，得到錐孔電壓、碰撞能力等，建立完整的質譜多反應監測(MRM)方法。

2.4 方法學驗證

2.4.1 基質效應

配合飼料富含多種營養成分，提取液雖經過多壁碳納米管凈化，但剩余雜質仍可能影響藥物靈敏度。文中為了評估樣液中雜質對藥物靈敏度的影響，用流動相起始比例溶液和基質空白，分別配制系列標準溶液，濃度范圍為2～100 μg·L-1，計算得到標準曲線和相關系數；并計算得到2個標準曲線的斜率比，見表2?；前烽g甲氧嘧啶、三唑磷、甲草胺、玉米赤霉烯酮為基質增強，嘔吐毒素為基質抑制，均超出斜率比0.8～1.2的閾值，樣液中含有雜質對藥物靈敏度仍有較大影響，所以選擇基質標定量。

表2 溶劑標液和基質標液的線性回歸方程和斜率比

2.4.2 定量限

由2.4.1節所做基質空白標準曲線，可知9種藥物在線性范圍內具有良好線性關系(r>0.99)。配合飼料以定量限進行添加，計算均大于10倍信噪比，最終定量限在0.2～3.0 μg·kg-1。

2.4.3 回收率與精密度

對配合飼料進行5、20、80 μg·kg-1添加回收試驗，重復5次，提前6 h添加標液。表3、圖1表明，9種藥物的回收率在74.7%～119.0%，相對標準偏差(RSD)為0.5%～12.0%。

表3 9種藥物的回收率、精密度及定量限

圖1 標液MRM的色譜

3 小結

根據本試驗結果，建立黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素、磺胺間甲氧嘧啶、恩諾沙星、金剛烷胺、三唑磷、多菌靈、甲草胺等9種藥物同時提取、凈化、檢測的分析方法，該方法簡單、快速、重現性好，可滿足配合飼料中9種藥物的快速定性定量分析。