球形芽孢桿菌轉化豬去氧膽酸為3β-豬去氧膽酸的研究

盛 敏，謝小國，李國軍，鄧家國，歐陽文凱，萬里平，李躍忠

（常德云港生物科技有限公司，湖南 常德 415001）

1 背景介紹

甾體化合物（steroids）也稱類固醇，是一類以環戊烷多氫菲為母核的化合物，側鏈上有不同的基團。環戊烷多氫菲母核包含3個六元環（A、B、C）和1個五元環（D），結構式如圖1所示[1]。幾乎所有甾體化合物母核的第C10和C13位都含有角甲基、伯醇或醛基等，C3、C11、C17位可能連接羥基或酮基，A環和B環在不同位置上含有多個雙鍵，C17位上連接結構不同的側鏈等[2]。當甾體母核上的取代基團和雙鍵位置不同時，甾體的生理活性差異明顯，據此形成了一系列生理功能各異的甾體化合物。豬去氧膽酸（3α,6α-二羥基膽烷酸，HDCA）是由3個六元環、1個五元環組成的甾體骨架和1個脂肪側鏈共24個碳原子構成的甾體化合物，結構式如圖2所示[3]。

圖1 環戊烷多氫菲核

圖2 豬去氧膽酸結構式

HDCA經由豬膽汁提取、加工制成，具有降血脂、祛痰、鎮咳的作用。HDCA對百日咳桿菌、白喉桿菌、金黃色葡萄球菌等有一定的抑制作用，可用作消炎藥，治療慢性支氣管炎、小兒病毒性上呼吸道炎癥等。HDCA還是人工牛黃配方的重要原料，也是清開靈等其他中藥制劑的成分[4]。3β-豬去氧膽酸（3β,6α-二羥基膽烷酸，3β-HDCA）是HDCA的同分異構體，在豬膽汁中天然存在，能在HDCA的合成、提取中作為雜質影響HDCA的純度。目前，市面上有3β-HDCA出售，可作為標準品使用。3β-HDCA主要通過化學法合成，由于化學方法存在污染環境、合成工藝復雜等不足，研究人員致力于尋找更加快捷簡便、穩定高效并且對環境友好的甾體化合物（如3β-HDCA）的生產方式，如生物轉化法。

生物轉化是利用生物體系（包括植物、微生物或動物組織的培養體系）或生物體系相關酶制劑對外源有機底物某一特定部位或功能基團進行特異性結構修飾，以獲得有價值產物的生理、生化反應。甾體化合物的微生物轉化類型包括氧化、還原、異構化、縮合、水解、引入雜原子等反應[5]。甾體化合物的微生物轉化過程一般由兩個階段組成：第一階段是培養菌體，以獲得足量的菌體和酶；第二階段是向培養液中加入甾體化合物，完成生物轉化的過程[6]。

早有研究表明，HDCA可以作為底物進行微生物轉化。Owen R W[7]在1983年發表論文，表明假單胞菌在厭氧條件下可將HDCA轉化為6-羥基-3-氧膽-4-烯-24膽烷酸，然而并無相關文獻或專利發現HDCA轉化為3β-HDCA的方法。本研究的目的在于通過反復篩選獲得能對HDCA進行轉化的菌株，并對其產物結構進行確證，證明其轉化產物為3β-HDCA。研究內容包括針對前期研究篩選獲得球形芽孢桿菌AKU218，并進行發酵擴大培養，以HDCA為底物進行轉化培養，在培養過程中通過高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）檢測確定能否發生轉化及轉化時間，提取轉化產物，進行結構確證，通過與3β-HDCA標準品的HPLC、液相色譜-質譜聯用（Liquid Chromatograph-Mass Spectrometer，LC-MS）、氣相色譜-質譜聯用（Gas Chromatograph-Mass Spectrometer，GC-MS）對比分析，證明球形芽孢桿菌AKU218可將HDCA轉化為3β-HDCA。

2 材料與方法

2.1 菌種

球形芽孢桿菌AKU218由株式會社Chitose研究所提供。

2.2 主要試劑

HDCA為常德云港生物科技有限公司產品，純度在98.0%以上，其他試劑均為市售分析純試劑。

2.3 培養基

本研究所用培養基包括馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA培養基）、細菌培養基和無機鹽培養基，配方如下：（1）PDA培養基：馬鈴薯200.00 g/L、葡萄糖20.00 g/L、瓊脂15.00～20.00 g/L，自然pH。（2）細菌培養基：胰蛋白胨5.00 g/L、酵母膏5.00 g/L、葡萄糖1.00 g/L、磷酸氫二鉀1.00 g/L。（3）無機鹽培養基：酵母膏0.25 g/L、磷酸氫二鉀1.00 g/L、磷酸二氫鉀1.00 g/L、硫酸銨1.00 g/L、氯化鈉0.10 g/L、硫酸鎂0.20 g/L、氯化鈣0.02 g/L、硫酸亞鐵0.01 g/L。

2.4 實驗步驟

2.4.1 孢子和種子制備

將配制好的PDA培養基分裝倒入500 mL錐形瓶中，包扎好并標明名稱、配制日期和配制人；在滅菌鍋內115 ℃滅菌30.00 min，待培養基冷卻至50 ℃左右后，無菌操作倒平板（每皿約倒15 mL），室溫平置，待凝后制得PDA平板；用接種環挑取球形芽孢桿菌AKU218的菌絲體在PDA平板上劃線，置于28 ℃恒溫培養箱中培養3 d，得到球形芽孢桿菌AKU218平板。

2.4.2 菌種發酵培養

向玻璃試管中倒入4 mL滅菌后的細菌培養基，細菌培養基配方：用接種環挑取球形芽孢桿菌AKU218的菌絲體接種于細菌培養基中，在28 ℃、120 r/min條件下振蕩培養24 h，再將其倒入裝有細菌培養基的200 mL錐形瓶中，培養24 h后，3 000 r/min離心10.00 min分離回收菌體。

2.4.3 HDCA轉化培養

將所得菌體分散于1 000 mL無機鹽培養基中，培養基配方：向培養基中加入5 g HDCA及10.0 μL β-氧化抑制劑2,2’-Bipyridyl，放入有脫氧劑的密閉容器中，于厭氧條件下28 ℃、120 r/min培養36 h。2.4.4 轉化產物的分離提取

過濾發酵培養液，濾液用等體積的乙酸乙酯萃取3次。合并萃取有機相，真空減壓濃縮至干，得轉化殘渣。取30 mg樣品加2 mL甲醇溶解后，流動相定容至20 mL，HPLC檢測，對照品用相同方法檢測。

2.4.5 轉化產物結構解析

另取2.5 μL乙酸乙酯抽提液與50.0 μL含0.1%脂肪酸分析用熒光試劑ADAM甲醇溶液混合后，再添加47.5 μL甲醇，于室溫下靜置60.00 min，形成熒光標記，然后對樣品進行HPLC分析。新購入標準樣3β-HDCA用同一方法分析。熒光標記后轉化產物進行LC-MS、GC-MS分析。

2.5 分析方法

2.5.1 HPLC分析

本研究將轉化產物用流動相（色譜純乙腈∶0.1%磷酸溶液=90∶10）復溶后，用0.22 μm有機膜過濾除雜，注射器進樣，進行HPLC檢測。

2.5.2 LC-MS分析

在LC-MS分析前，需要對樣品進行處理，轉化產物熒光標記方法如2.4.5所述。熒光標記后樣品進行LC-MS分析。

2.5.3 GC-MS分析

在GC-MS分析前，需要對樣品進行處理，處理方式：（1）甲基酯化反應：向1 mg樣品中加入700.0 μL 2N鹽酸甲醇溶液后，添加70.0 μL 2,2-Dimethoxypropane于85 ℃下保溫1 h。反應后減壓蒸發去除溶劑，加入100.0 μL無水甲醇后，再次減壓蒸發去除溶劑。（2）TMS化反應：向甲基酯化反應后的樣品中添加600.0 μL pyridine∶BSTFA=2∶1的溶液，于80 ℃下保溫40.00 min。各標準樣處理好后進行GC-MS分析。

3 結果與分析

3.1 球形芽孢桿菌AKU218轉化產物的確認

球形芽孢桿菌AKU218在細菌培養基中擴增后進行HDCA轉化實驗。經HPLC檢測發現，在好氧條件下，5.71 min有產物生成；在厭氧條件下，8.44 min左右有產物生成。

3.2 標準品與轉化產物對比確認

將球形芽孢桿菌A K U 218的轉化產物與標準樣3β-HDCA對比，HPLC所得保留時間完全一致。因此，該產物可能為HDCA 3位羥基經過脫氫酶的羥基氧化后，再次加氫還原形成的光學立體結構異構體。

本研究進一步通過LC-MS和GC-MS對轉化產物進行結構確證，對膽汁酸熒光標記后的樣品進行LC-MS分析。3β-HDCA標準樣的LC-MS分析結果表明，在同位體存在的情況下，該化合物以分子質量617和619被檢出。GC-MS分析結果顯示，二者保留時間一致，MS圖譜也完全一致。因此，該轉化產物可以被確認為3位羥基由α轉化為β的HDCA光學異構體。由于結構得到確定，該產物無需進一步的核磁分析。

4 討論

本研究發現球形芽孢桿菌AKU218對HDCA有轉化作用。通過HPLC分析對比發現，轉化產物出峰時間與3β-HDCA標準品出峰時間一致；后通過LC-MS和GC-MS進一步證明轉化產物為3β-HDCA。3β-HDCA標準樣通過LC-MS分析以分子質量617和619被檢出。GC-MS分析結果也證明，轉化產物與3β-HDCA標準品出峰時間一致，同時MS圖譜也完全一致。由于結構得到確定，該產物無需進一步的核磁分析。本研究表明，3位羥基經過球形芽孢桿菌AKU218脫氫酶的羥基氧化后，再次加氫還原形成光學立體結構異構體3β-HDCA。本研究尚未對球形芽孢桿菌AKU218轉化條件對收率的影響進行探索，后續將通過正交試驗等方法進行培養基轉化條件優化，提高轉化效率。

熊去氧膽酸（3α,7β-二羥基-5β-膽烷酸，UDCA）是HDCA的同分異構體，其殺菌、抗炎和溶解膽汁酸的作用比HDCA強，并且無不良反應。因此，臨床上應用UDCA治療膽結石、膽汁淤積性疾病以及脂肪肝、結腸腫瘤等疾病[8-9]。UDCA也是首個美國食品藥品監督管理局批準用于治療原發性膽汁性肝硬化的藥物，具有巨大的臨床應用價值。目前，有研究表明，HDCA可經酯化、選擇性氧化、環氧化、脫保護等一系列化學反應轉化為UDCA[10]，但化學法工藝煩瑣、流程復雜、反應條件苛刻，不適用于工業化生產。本次研究結果證明，HDCA可被微生物進行轉化利用，這可能預示HDCA存在被微生物轉化為UDCA的可能。通過進一步擴大微生物菌株篩選、考察反應條件等方式，有可能篩選出能將HDCA轉化為UDCA的菌株。一旦成功，這將是膽汁酸微生物轉化領域的又一重大發現，具有巨大的經濟價值和社會價值。