基于網絡藥理學研究扶正化瘀方抗肝纖維分子機制

王玉婷 梁詩雨 謝宇娟 李舒展 徐 怡 王佳慧 趙鐵建 鄭 洋

基于網絡藥理學研究扶正化瘀方抗肝纖維分子機制

王玉婷 梁詩雨 謝宇娟 李舒展 徐 怡 王佳慧 趙鐵建 鄭 洋

（廣西中醫藥大學賽恩斯新醫藥學院，廣西 南寧 530222）

目的：基于網絡藥理學方法分析扶正化瘀方抗肝纖維化分子機制研究。方法：利用OMIM、GeneCards等數據庫獲得肝纖維化相關靶點，采用Venn圖對扶正化瘀方活性成分作用靶點和肝纖維化相關靶點進行交互處理；利用String數據庫和metascape數據庫對交互靶點進行基因和信號通路注釋，明確扶正化瘀方抗肝纖維化的分子機制。結果：選擇了扶正化瘀方中的抗肝纖維化成分：有桃仁中的苦杏仁苷、丹參中的丹酚酸B和蟲草菌絲中的蟲草等。其中丹參主要化學成分為水溶性成分（丹參素、丹酚酸A及B、迷迭香酸、原兒茶酸、原兒茶醛等）和脂溶性成分（二氫丹參酮I、丹參酮IIA等）。丹參酮類是丹參的主要脂溶性成分，主要包括TanⅡA、隱丹參酮（cryptotanshinone，CPT）、丹參酮Ⅰ、二氫丹參酮等。TanⅡA是含量最多、目前研究最為深入的丹參酮。TanⅡA屬二萜醌類化合物，具有抗炎、抗腫瘤、心血管保護等多種活性。通過TCMSP數據庫對扶正化瘀方的這些活性成分進行篩選，并獲得扶正化瘀方活性成分作用靶點。將獲得的作用靶點，通過UniProt數據庫將其轉換為基因名，并將其導入String數據庫獲得作用靶點互作數據，利用Cyctoscape3.4.0構建互作網絡。通過OMIM、GeneCards數據庫獲得肝纖維化相關靶點蛋白，對化合物靶點與肝纖維化靶點進行交互處理，獲得重疊靶點。結論：體現了扶正化瘀方多靶點-多通路的作用特點，其所作用的多條通路均存在關聯性，為進一步研究提供了良好的基礎。

扶正化瘀方；網絡藥理學；肝纖維化；信號通路；HIF

引言

扶正化瘀方是由上海中醫藥大學針對肝纖維化血瘀研制，屬于治療肝纖維化的中藥復方，由丹參、冬蟲夏草、桃仁、松花粉、絞股藍、五味子等6味中藥組成，其功效為活血祛瘀、益精養肝。用于乙型肝炎纖維化屬瘀血阻絡、肝腎不足證者、肝炎后肝硬化正氣虛損、血瘀阻絡等疾病[1]。常表現為肋下痞塊（肚中可摸到硬塊，因脾腫大而引起）、脅肋疼痛、面色晦暗（面部皮膚沒有光澤、血色，出現萎黃、枯黃、暗淡、污垢色等）、或見赤縷紅斑（蜘蛛痣）、腰膝酸軟、疲倦乏力、頭暈目澀、舌質暗紅或有瘀斑、苔薄或微黃、脈弦細等。該方中抗肝纖維化成分有桃仁中的苦杏仁苷、丹參中的丹酚酸B和蟲草菌絲中的蟲草等[1]。其中丹參主要化學成分為水溶性成分（丹參素、丹酚酸A及B、迷迭香酸、原兒茶酸、原兒茶醛等）和脂溶性成分（二氫丹參酮I、丹參酮IIA等）。丹參酮類是丹參的主要脂溶性成分，主要包括TanⅡA、隱丹參酮（cryptotanshinone，CPT）、丹參酮Ⅰ、二氫丹參酮等[2]。其中，TanⅡA是含量最多、目前研究最為深入的丹參酮。TanⅡA屬二萜醌類化合物，具有抗炎、抗腫瘤、心血管保護等多種活性。該藥針對肝纖維化正虛血瘀的基本病機而設，方中丹參養血活血為君藥；冬蟲夏草補虛損、益精氣，桃仁助丹參活血化瘀，共為臣藥；松花粉益氣潤燥，絞股藍清熱解毒，同為佐藥，現代藥理研究更發現絞股藍含有比人參更高濃度的人參皂甙，可協助補氣；五味子味酸為引經使藥。諸藥合用，活血化瘀，益精養肝，從而達到抗肝纖維化的效果。

肝星狀細胞是肝周細胞，是正常肝臟本身固有的細胞[3]。但是肝纖維化形成過程中，肝星狀細胞被激活，在肝內的正常比例被打破，出現增殖，細胞自噬能力、遷移能力、合成膠原能力、炎癥反應等被激發，產生大量細胞外基質（纖維組織）在肝內沉積，導致肝纖維化和肝硬化[4]。扶正化瘀方治療肝纖維化正是通過緩解肝細胞的炎癥反應同時在肝纖維化形成的過程中抑制肝星狀細胞活化、增殖，從而發揮治療作用，促進活化肝星狀細胞的凋亡、促進細胞外基質的降解、抑制血管新生而減少纖維間隔、改善微循環、抑制肝星狀細胞的收縮，以及調整免疫功能等[5]。目前已經明確的作用機制不下十二種，它們協同作用、互相促進，共同達到抗肝纖維化的目的。臨床研究也證實扶正化瘀方治療肝纖維化療效確切，能明顯抑制肝纖維化的進一步發展，提高患者生存的幾率。

扶正化瘀方抗肝纖維化藥理機制研究已經深入到分子生物學水平，對其作用機制研究主要在某些靶點、某條通路方面，并未能揭示其系統的藥理作用機制。網絡藥理學的研究方法在不斷發展與完善，通過運用大數據和網絡分析等手段研究扶正化瘀方中多成分的作用藥理機制，證明扶正化瘀方“弱抑制-多靶點”的科學內涵。網絡藥理學以“整體性”和“系統性”為特點，其特點表現在探索藥物與疾病之間的大脈絡關系，這與中醫藥的治療原則相符。本研究擬基于網絡藥理學思路與方法，研究扶正化瘀方中有效成分、靶點、通路之間的關系，探討其可能的抗肝纖維化作用機制，運用網絡藥理學的研究方法對扶正化瘀方抗肝纖維化的作用機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 軟件與網站

TCMSP數據庫（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmspsearch.php）[6]；UniProt數據庫（http://www.uniprot.org）[7]；String數據庫[8]；OMIM[9]、GeneCards數據庫[10]；Venn圖軟件；metascape數據庫[11]；cytoscape可視化軟件。

1.2 扶正化瘀方的活性成分以及其作用靶基因的篩選

通過運用網絡藥理學的研究方法對扶正化瘀方的活性成分進行篩選，并獲得其活性成分的作用靶點。首先，利用TCMSP數據庫（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmspsearch.php）篩選并確定出扶正化瘀方的活性成分以及作用靶點；接著，通過利用UniProt數據庫（http://www.uniprot.org）對扶正化瘀方作用靶點進行進一步的驗證。

1.3 構建肝纖維化疾病相關作用靶點分子信息庫

使用OMIM、GeneCards數據庫，通過檢索“hepatic fibrosis”預測并篩選出肝纖維化對應的作用靶點信息以及相關分析。

1.4 構建重疊靶點的互作網絡

對扶正化瘀方活性成分作用靶點以及肝纖維化靶點信息庫進行交互處理，獲得扶正化瘀方抗肝纖維化的作用靶點。通過利用String數據庫構建扶正化瘀方-肝纖維化疾病活性成分作用靶點互作網絡并導入cytoscape可視化軟件繪圖。接著用Venn圖軟件對扶正化瘀方活性成分作用靶點和肝纖維化相關作用靶點進行交互處理，獲得重疊靶點蛋白。利用metascape數據庫對重疊靶點進行基因功能和信號通路的注釋。

2 結果

2.1 扶正化瘀方活性成分—靶點網絡

通過查閱文獻檢索發現扶正化瘀方中主要的活性成分包括：丹酚酸B、蟲草酸、蟲草素、苦杏仁苷、聚-β-羥丁酸、絞股藍提取物、五味子素等。此7種活性成分為研究對象，其基本信息見表1。根據TCMSP數據庫進行檢索查找扶正化瘀方的靶點基因共計608個，其中丹參的靶點基因140個，冬蟲夏草的靶點基因73個，桃仁的靶點基因116個，松花粉的靶點基因60個，絞股藍的靶點基因194個，五味子的靶點基因25個。扶正化瘀方7種活性成分對應131個靶基因，其主要活性成分—靶點網絡見圖1。

表1 扶正化瘀方的主要活性成分信息表

圖1 扶正化瘀方主要活性成分—靶點網絡

2.2 相關靶點數據庫對比分析

根據OMIM、GeneCards數據庫檢索關鍵詞“hepatic fibrosis”共計篩選出1573個疾病相關靶點基因，根據Relevance（相關度）計算出中位數，在GeneCards數據庫取前1500個靶點，在OMIM數據庫取前73個靶點組建相關靶點數據庫。對扶正化瘀方靶點和肝纖維化相關發病機制靶點進行對比驗證，得出扶正化瘀方中與肝纖維化發病機制相關作用靶點基因125個，包括NR3C2、AR、BCL2、ADRB2等。并構建扶正化瘀方成分靶點與肝纖維化相關發病機制靶點Venn圖，見圖2。

圖2 扶正化瘀方成分靶點與肝纖維化相關發病機制靶點Venn圖

2.3 扶正化瘀方靶基因—肝纖維化靶基因PPI網絡的構建

將扶正化瘀方和肝纖維化疾病的靶點基因進行規范處理后得出共有靶點基因125個，包括NR3C2、AR、BCL2、ADRB2等。將其導入STRING網站，并選擇人類基因類型（homo sapiens）且設置最小關系值≥0.9，生成藥物—疾病共有靶點PPI網絡，將結果輸入cytoscape3.8.2軟件進行分析，從而獲得PPI網絡共有節點117個，605條邊，根據Degree值排名前七位的靶蛋白STAT3、TP53、RELA、AKT1、MAPK1、TNF、JUN，作為扶正化瘀方直接抗肝纖維化靶蛋白，結果見圖3。

圖3 扶正化瘀方蛋白互作網絡

2.4 GO生物過程富集分析

將藥物—疾病篩選出的共有靶點125個輸入metascape數據庫中，分別進行細胞成分（GO cellular components）、分子功能（GO molecular functions）、生物途徑功能（GO biological processes）三方面的GO富集分析，設定閾值相關性＜0.01，最小計數=3，富集因子＞1.5，根據-log10P值篩選出相關性前20途徑，其中靶基因細胞成分主要與膜筏（membrane raft）、蛋白質激酶復合物（protein kinase complex）相關，見圖4a；靶蛋白分子功能主要與DNA結合轉錄因子綁定（DNA-binding transcription factor binding）呈顯著相關，見圖4b；生物途徑功能則主要與對脂糖的反應（response to lipopolysaccharide）、炎癥反應（inflammatory response）、凋亡信號通路（apoptotic signaling pathway）、對化學應激的細胞反應（cellular response to chemical stress）等多種生物途徑功能高度相關，見圖4c。

2.5 KEGG信號通路富集分析

據KEGG信號通路分析，選取閾值＜0.01，得出結果顯示扶正化瘀方抗肝纖維化是經過多條通路的作用結果方式，與癌癥的路徑（Pathways in cancer）、糖尿病并發癥中的衰老信號通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、丙型肝炎（Hepatitis C）、TNF信號通路（TNF signaling pathway）、麻疹（Measles）、癌癥中的蛋白體（Proteoglycans in cancer）、HIF-1信號通路（HIF-1 signaling pathway）、MAPK信號通路（MAPK signaling pathway）、NF-卡帕B信號通路（NF-kappa B signaling pathway）、瘧疾（Malaria）等多種途徑高度相關，綜合分析具有富集顯著相關性排行前十的通路，并繪制通路圖，見圖5。使用metascape數據庫中PPI網絡的MCODE功能，結果得出兩組蛋白互作用緊密，見圖6。其中TNF、MAPK8、JUN等27個靶蛋白為一組重要的靶蛋白簇，經KEGG信號通路分析得出該組靶蛋白簇與TNF信號通路密切相關；另一組重要的靶蛋白簇包含：HIF、STAT1、MAPK14等24個靶蛋白，經KEGG信號通路分析得出該組靶蛋白簇與HIF信號通路密切相關。

圖5 KEGG信號通路富集分析圖

圖6 PPI網絡模塊分析

3 討論

肝纖維化是慢性肝病的典型病理特征，是一個動態病理生理過程，可嚴重影響肝臟功能，符合中醫病機、病位動態演變的規律，因此中醫藥在治療肝纖維化方面具有獨特優勢[12]。扶正化瘀方是由上海中醫藥大學針對肝纖維化血瘀研制，由丹參、冬蟲夏草、桃仁、松花粉、絞股藍、五味子等六味中藥組成，諸藥合用活血化瘀、益精養肝，從而達到抗肝纖維化的效果[13]。

在獲取扶正化瘀方活性成分時發現，扶正化瘀方的主要藥效藥物包括丹參中的丹酚酸B、桃仁中的苦杏仁苷和冬蟲夏草中的蟲草素等[1]。苦杏仁苷在抑制肝星狀細胞的增值和膠原生成方面作用尤為突出，與蟲草菌絲同用時對血吸蟲肝病患者的肝纖維化有著明顯改善，而單用時在肝纖維化模型大鼠體內觀察到肝纖維化的轉好趨勢。其中丹酚酸B顯著改善慢性乙肝肝纖維化患者的肝纖維化，可抗肝細胞過氧化損傷、抑制肝星狀細胞活化[1]。

本研究通過文獻檢索獲得扶正化瘀方中丹酚酸B、蟲草酸、蟲草素、苦杏仁苷、聚-β-羥丁酸、絞股藍提取物、五味子素7種主要活性成分，并通過篩選和文獻檢索出扶正化瘀方608個潛在靶點，并構建扶正化瘀方相關作用靶點—肝纖維化發病機制網絡，從中發現125個扶正化瘀方抗肝纖維化的主要靶點基因，表明了扶正化瘀方具有多靶點抗肝纖維化作用。

本研究在通過對扶正化瘀方GO分析的過程中發現，靶基因主要與細胞成分、分子功能、生物途徑功能三條途徑顯著相關，接著通過KEGG富集通路分析選取前十位途徑，分別為癌癥的路徑、糖尿病并發癥中的衰老信號通路、丙型肝炎、TNF信號通路、麻疹、癌癥中的蛋白體、HIF-1信號通路、MAPK信號通路、NF-卡帕B信號通路、瘧疾。其中發現HIF-1信號通路和TNF信號通路是治療肝纖維化的特征通路。在慢性炎癥過程中，炎癥細胞的積累和纖維化可能導致缺氧，增加了受損組織對血流和氧氣供應的阻力。已有證據表明，血管生成，和炎癥的發生是由于缺氧的刺激所導致的。缺氧激活血管生成是缺氧誘導因子（HIFs）介導的信號通路的結果[14]。在炎癥和缺氧等特殊情況下，HIF表達被誘導結合IRP1和IRP2，從而促進TFRC轉錄，HIF-1α也可通過結合DNA調控TFRC的轉錄，隨后生成的TFRC蛋白可促進鐵代謝，增加供氧[15]。丹參、絞股藍和冬蟲夏草等藥物中的MAPK1、EGFR、PKC等藥物靶點與HIF-1α基因表達密切相關[16]。已有研究表明丹參素能在5 μmol·L-1～100 μmol·L-1濃度范圍內濃度依賴性的下調HIF-1α蛋白表達（＜0.01），進而抑制HIF-1信號通路[16]。TNF-α一方面在慢性肝炎的發病機制中起著關鍵作用，他強效促進炎癥反應的發生[17]，另一方面TNF-α具有消除炎癥、抑制腫瘤生長的功能[18]。因此TNF-α因子成為慢性肝炎和肝纖維化的強制性調節因子[19]。已有研究表明，TNF-α可抑制促纖維化因子的表達，如：α-SMA、NF-κB p65、TGF-β1，進而促進基質的降解，從而減少基質生成發揮抗肝纖維化作用[20]。從現有數據結果分析得出扶正化瘀方治療肝纖維化理論上具有積極的治療效果，多條通路顯示該方抑制肝纖維化向慢性肝炎進一步發展。

4 結束語

綜上所述，本研究通過網絡藥理學方法分析得出了扶正化瘀方治療肝纖維化的相關作用靶點，其中重要蛋白質靶點共7個，并對其進行富集分析與通路的注釋進一步理解藥物與疾病相互作用機制提供了重要信息。但本研究僅基于網絡藥理學上對扶正化瘀方治療肝纖維化的探討，并未通過實驗進一步驗證，由于數據庫信息尚未全面等原因存在一定的局限性。因此對扶正化瘀方抗肝纖維化的基礎實驗驗證將成為下一步研究的重要內容。

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Study on the Molecular Mechanism of Fuzheng Huayu Prescription Against Liver Fiber Based on Network Pharmacology

Objective: To analyze the molecular mechanism of Fuzheng Huayu prescription against liver fibrosis based on network pharmacology. Methods: Using OMIM, GeneCards and other databases to obtain liver fibrosis related targets, Venn diagram was used to interact the action targets of the active components of Fuzheng Huayu prescription and liver fibrosis related targets; using String database and metascape database to annotate the genes and signal pathways of the interactive targets, and clarify the molecular mechanism of Fuzheng Huayu prescription against liver fibrosis. Results: The anti-liver fibrosis components in Fuzheng Huayu prescription were selected: including amygdalin in peach kernel, salvianolic acid B in salvia miltiorrhiza and cordyceps sinensis in cordyceps mycelium. The main chemical components of salvia miltiorrhiza are water-soluble components (tanshinol, salvianolic acids A and B, rosmarinic acid, protocatechuic acid, protocatechuic aldehyde, etc.) and fat soluble components (dihydrotanshinone I, tanshinone IIA, etc.). Tanshinones are the main fat soluble components of salvia miltiorrhiza, mainly including Tan IIA, cryptotanshinone (CPT), tanshinone Ⅰ, dihydrotanshinone, etc. Tan IIA is tanshinone with the most content and the most in-depth research at present. Tan IIA is a diterpene quinone compound, which has many activities, such as anti-inflammatory, anti-tumor, cardiovascular protection and so on. These active components of Fuzheng Huayu prescription were screened through TCMSP database, and the action targets of the active components of Fuzheng Huayu prescription were obtained. The obtained action target is converted into gene name through UniProt database, and it is imported into String database to obtain action target interaction data, and the interaction network is constructed by using Cyctoscape3.4.0. The target proteins related to liver fibrosis were obtained from OMIM and GeneCards databases, and the compound targets were interacted with liver fibrosis targets to obtain overlapping targets. Conclusion: This study reflects the characteristics of Fuzheng Huayu prescription's multi-target and multi-channel action, and its multiple pathways are related, which provides a good basis for further research.

Fuzheng Huayu prescription; network pharmacology; liver fibrosis; signaling pathways; HIF

R285; R575

A

1008-1151(2022)08-0059-05

2022-05-20

國家自然科學基金項目（81960751、81660705）；廣西自然科學基金青年項目（2020GXNSFBA297094）；廣西中青年教師科研基礎能力提升項目（2020KY1667）；廣西壯瑤藥重點實驗室（GXZYZZ2019-1、GXZYZZ2020-07）；廣西中醫藥大學一流學科（2019XK141）；廣西中醫藥大學青年基金（2020QN006）；廣西中醫藥大學賽恩斯新醫藥學院2021年大學生創新創業訓練計劃項目（202113643019）。

王玉婷（2001－），女，福建龍巖人，廣西中醫藥大學賽恩斯新醫藥學院學生，研究方向為民族藥防治慢性肝病。

鄭洋（1991－），廣西中醫藥大學賽恩斯新醫藥學院助教，碩士，研究方向為民族藥防治慢性肝病。