基于生物信息學(xué)分析構(gòu)建免疫相關(guān)基因膿毒癥預(yù)后模型

朱思哲，葉成林

（1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院臨床免疫研究室，湖北 武漢 430030；2.武漢大學(xué)人民醫(yī)院病理科，湖北 武漢 430060）

膿毒癥（sepsis）是宿主對感染的免疫反應(yīng)失調(diào)而導(dǎo)致危及生命的器官功能性障礙[1]。據(jù)保守估計，膿毒癥是全世界死亡和危重病的主要原因[2]。盡管在過去的幾十年中，膿毒癥的預(yù)后有所改善，但膿毒癥休克的死亡率仍高于25%～30%，甚至40%～50%[3]。此外，幸存的膿毒癥患者通常要承受長期的身體、心理和認(rèn)知障礙[4]。膿毒癥與其他主要流行病不同，其治療是非特異性的，沒有批準(zhǔn)的藥物，只能給予維持器官功能、抗生素和保障血液動力學(xué)穩(wěn)定治療。因此，迫切需要探索更多潛在的膿毒癥診斷生物標(biāo)志物并構(gòu)建預(yù)后模型，從而提高治療決策的有效性。免疫反應(yīng)失調(diào)在膿毒癥中扮演著重要的角色。單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞是先天免疫系統(tǒng)的主要組成部分，在膿毒癥期間協(xié)調(diào)宿主免疫反應(yīng)方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在膿毒癥的早期階段，兩種不同的淋巴細(xì)胞分泌的促炎因子和趨化因子水平升高，這會加劇炎癥反應(yīng)，增加死亡率[5]。中性粒細(xì)胞是體循環(huán)中最豐富的白細(xì)胞。研究表明，膿毒癥患者中循環(huán)中性粒細(xì)胞增加可導(dǎo)致免疫失調(diào)，通過釋放細(xì)胞因子和活性氧導(dǎo)致多器官衰竭，CD4+T 細(xì)胞可以直接介導(dǎo)宿主對膿毒癥的反應(yīng)，膿毒癥導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡會誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞的耗竭[6]。而膿毒癥導(dǎo)致記憶CD8+T 細(xì)胞表型、保護(hù)功能和定位的長期改變，可能會改變宿主對再感染的反應(yīng)能力[7]。因此，免疫相關(guān)基因在膿毒癥的診斷與預(yù)后預(yù)測方面具有巨大潛力。目前，關(guān)于免疫相關(guān)基因在膿毒癥的診斷與預(yù)后方面的研究報道罕見。基于此，本研究通過生物信息學(xué)分析獲得具有表達(dá)差異的免疫相關(guān)基因，并探索其生物學(xué)功能。進(jìn)一步通過LASSO 回歸和多因素COX 回歸分析篩選膿毒癥獨(dú)立預(yù)后基因，并構(gòu)建預(yù)后風(fēng)險模型，以及探索所篩選的基因在膿毒癥中的診斷價值，為膿毒癥的診斷、治療和預(yù)后提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源 通過GEO 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下載膿毒癥基因芯片表達(dá)數(shù)據(jù)集GSE134347、GSE13904 和GSE65682，每個數(shù)據(jù)集樣本信息見表1。通過CIBERSORTx 數(shù)據(jù)庫（https://cibersortx.stanford.edu/）分析GSE134347 數(shù)據(jù)集中每個樣本中22 種常見免疫細(xì)胞的浸潤程度。

表1 GSE134347、GSE13904 和GSE65682 數(shù)據(jù)集信息

1.2 差異基因分析 利用R 包limma 對GSE134347數(shù)據(jù)集進(jìn)行差異分析，adjustP-value ＜0.05，|Log2FC|＞1 的基因被定義為差異表達(dá)基因（DEGs）。通過ImmPort 數(shù)據(jù)庫下載免疫相關(guān)基因，并與差異表達(dá)基因取交集。

1.3 生物學(xué)功能富集分析 利用R 包c(diǎn)lusterProfile進(jìn)行生物學(xué)功能GO（gene ontology）和KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）富集分析，利用R 包GOplot 計算z-score。

1.4 構(gòu)建風(fēng)險預(yù)后模型 通過R 包glmnet 對GSE65682 數(shù)據(jù)集中含有預(yù)后信息的標(biāo)本進(jìn)行LASSO 回歸分析，設(shè)置10 折交叉驗(yàn)證，以獲得最優(yōu)模型。利用R 包survival 進(jìn)行多因素COX 回歸篩選獨(dú)立預(yù)后基因（P＜0.01），風(fēng)險比（Hazard ratio，HR）＞1為危險因素，HR＜1 為保護(hù)因素。進(jìn)一步通過多因素回歸分析確定每個獨(dú)立預(yù)后基因的回歸系數(shù)，建立預(yù)后風(fēng)險模型，預(yù)測患者生存率。公式為：風(fēng)險分?jǐn)?shù)=Σβi×xi，βi為基因?qū)?yīng)的多元COX 回歸beta 值，xi為基因表達(dá)值。

1.5 繪制診斷ROC 曲線及驗(yàn)證 利用R 包pROC 對GSE134347 訓(xùn)練集和GSE13904 驗(yàn)證集中的獨(dú)立預(yù)后基因繪制診斷ROC 曲線和計算AUC 值，并通過R 包ggplot2 繪制這兩個數(shù)據(jù)集中獨(dú)立預(yù)后基因表達(dá)值小提琴圖。

2 結(jié)果

2.1 免疫浸潤分析 免疫浸潤分析顯示，膿毒癥組和正常組的免疫細(xì)胞浸潤具有差異。在膿毒癥組中，漿細(xì)胞（plasma cells）、活化CD4+記憶T 細(xì)胞（T cells CD4 memory activated）、調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（T cells regulatory）、單核細(xì)胞（monocyte）、M0 型巨噬細(xì)胞（macrophage M0）和中性粒細(xì)胞（neutrophils）的浸潤程度上升，而初始B 細(xì)胞（B cells naive）、CD8+T 細(xì)胞（T cells CD8）、初始CD4+T 細(xì)胞（T cells CD4 naive）、靜息CD4+記憶T 細(xì)胞（T cells CD4 memory resting）和靜息自然殺傷細(xì)胞（NK cells resting）的浸潤程度下降，見圖1。

圖1 免疫浸潤分析

2.2 差異分析 共獲得911 個上調(diào)基因和1248 個下調(diào)基因，見圖2A。通過與免疫相關(guān)基因取交集，共獲得差異表達(dá)的免疫相關(guān)基因245 個，見圖2B。

圖2 差異基因分析

2.3 生物學(xué)功能富集分析 對篩選的245 個免疫相關(guān)基因進(jìn)行生物學(xué)富集分析：GO 富集顯示上述基因主要富集于免疫反應(yīng)激活細(xì)胞表面受體信號通路、細(xì)胞因子產(chǎn)生的正調(diào)控、抗原受體介導(dǎo)的信號通路、細(xì)胞活化的正調(diào)控、白細(xì)胞活化的正調(diào)控、淋巴細(xì)胞活化的正調(diào)控、淋巴細(xì)胞活化的調(diào)節(jié)、T 細(xì)胞受體信號通路、T 細(xì)胞活化、白細(xì)胞-細(xì)胞粘附，見圖3A；KEGG 信號通路富集分析顯示，上述基因主要富集于Th17 細(xì)胞分化、Th1 和Th2 細(xì)胞分化、抗原處理和呈遞、造血細(xì)胞系、T 細(xì)胞受體信號通路、肺結(jié)核、弓形蟲病、利什曼病、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性和甲型流感信號通路，見圖3B。

圖3 生物學(xué)功能富集分析

2.4 構(gòu)建風(fēng)險預(yù)后模型 對245 個免疫相關(guān)基因進(jìn)行LASSO 回歸分析篩選預(yù)后基因，見圖4A；共獲得DEFA4、IL4R、TFRC、CCL5、CAMP、CX3CR1、PRKCA、CD28 和LTB 9 個免疫相關(guān)預(yù)后基因，LASSO 回歸軌跡見圖4B。進(jìn)一步通過多因素COX 歸回篩選獨(dú)立預(yù)后基因，DEFA4 為危險因素（HR＞1），而CAMP、CX3CR1 和PRKCA 為保護(hù)因素（HR＜1），見圖4C。基于以上4 個基因的表達(dá)值與COX 回歸系數(shù)構(gòu)建風(fēng)險預(yù)后模型，計算GSE65682 中每個膿毒癥患者的風(fēng)險分?jǐn)?shù)：風(fēng)險分?jǐn)?shù)=0.2300×DEFA4-0.2894×CAMP-0.2958×CX3CR1-0.2388×PRKCA。進(jìn)一步按照風(fēng)險分?jǐn)?shù)中位數(shù)將GSE65682 中的膿毒癥患者分為高風(fēng)險組和低風(fēng)險組，比較兩組28 d 生存差異，結(jié)果顯示高風(fēng)險組28 d 生存率低于低風(fēng)險組（P=2.7e-7），見圖5。

圖4 LASSO 回歸和多因素COX 回歸分析

圖5 生存分析

2.5 診斷ROC 曲線及驗(yàn)證 ROC 曲線顯示，DEFA4（AUC=0.795）和PRKCA（AUC=0.893）展示出一定的診斷準(zhǔn)確性，而CAMP（AUC=0.923）和CX3CR1（AUC=0.950）則具有較高的診斷準(zhǔn)確性，見圖6A。為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果，利用GSE13904 驗(yàn)證集繪制DEFA4、CAMP、CX3CR1 和PRKCA 的ROC 曲線，結(jié)果顯示DEFA4、CAMP 和CX3CR1 展示出一定的診斷準(zhǔn)確性，而PRKCA 則具有較低的準(zhǔn)確性，見圖6B。進(jìn)一步根據(jù)DEFA4、CAMP、CX3CR1 和PRKCA 在GSE134347 訓(xùn)練集與GSE13904 驗(yàn)證集中的表達(dá)值，分別繪制表達(dá)值小提琴，結(jié)果顯示DEFA4 和CAMP 的表達(dá)在膿毒癥組上調(diào)（P＜0.05），CX3CR1 和PRKCA 的表達(dá)則在正常組中上調(diào)（P＜0.05），見圖7。

圖6 該模型診斷膿毒癥的ROC 曲線

圖7 DEFA4、CAMP、CX3CR1 和PRKCA 基因表達(dá)水平

3 討論

在過去的30 年里，膿毒癥的定義和管理有很大的發(fā)展[8]。這得益于對臨床綜合征的理解、血流動力學(xué)監(jiān)測工具的進(jìn)步和搶救措施改進(jìn)，但膿毒癥仍是危重患者發(fā)病和死亡的主要原因之一[9]。多數(shù)患者在膿毒癥的初始高炎癥階段可存活下來，但會進(jìn)展到后期的免疫抑制階段，其中30%的患者死于繼發(fā)感染，免疫反應(yīng)則可能在膿毒癥患者死亡率中起主要作用[10]。因此，探索免疫相關(guān)基因在膿毒癥中的作用，篩選免疫相關(guān)基因的膿毒癥診斷生物標(biāo)志物和構(gòu)建預(yù)后風(fēng)險模型對膿毒癥的早期診斷和預(yù)后評估具有重要意義。

本研究對GEO 數(shù)據(jù)集的膿毒癥組和正常組進(jìn)行免疫浸潤分析，結(jié)果顯示膿毒癥組與正常組外周血中免疫細(xì)胞浸潤程度具有差異，這說明免疫調(diào)節(jié)在膿毒癥中起重要作用。為了進(jìn)一步探索免疫調(diào)節(jié)在膿毒癥中的作用，本研究對膿毒癥組和正常組進(jìn)行差異分析，并從ImmPort 數(shù)據(jù)庫下載免疫相關(guān)基因與差異基因取交集，共獲得245 個免疫相關(guān)差異表達(dá)基因。生物功能富集分析顯示245 個基因主要富集于Th17 細(xì)胞分化、Th1 和Th2 細(xì)胞分化、肺結(jié)核以及弓形蟲病等免疫和感染相關(guān)信號通路。多項(xiàng)研究表明，這些信號通路與膿毒癥密切相關(guān)。如Mishra R 等[11]報道肺結(jié)核性膿毒癥休克是一種罕見的疾病，但其具有非常高的死亡率，這與敗血癥流行病學(xué)的普遍預(yù)期相反。Souza MC 等[12]報道，慢性弓形蟲感染可加劇繼發(fā)性多微生物膿毒癥。Th 細(xì)胞作為適應(yīng)性免疫的一部分，參與了膿毒癥的免疫調(diào)節(jié)。膿毒癥患者中Th17 和Th1 細(xì)胞的活化失調(diào)，以及Th17/Treg 比例失衡與膿毒癥預(yù)后相關(guān)[13，14]。Xue M等[15]報道，社區(qū)獲得性嚴(yán)重膿毒癥患發(fā)作時，Th2/Th1 比例顯著上升，Th2 占主導(dǎo)地位，其持續(xù)動態(tài)增加與ICU 獲得性感染和28 d 死亡率有關(guān)。

為了進(jìn)一步篩選免疫相關(guān)膿毒癥預(yù)后基因，本研究對上述245 個基因進(jìn)行LASSO 回歸和多因素COX 回歸，結(jié)果顯示DEFA4、CAMP、CX3CR1 和PRKCA 可以作為膿毒癥的獨(dú)立預(yù)后基因。DEFA4又名HNP4（人中性粒細(xì)胞α 防御素4），編碼一種先天免疫陽離子抗菌肽，對革蘭氏陰性菌具有較強(qiáng)的抗菌效果，也能保護(hù)人外周血單核細(xì)胞免受HIV-1 感染[16]。CAMP 編碼一種Cathelicidin 抗菌肽LL-17，是呼吸道內(nèi)宿主防御細(xì)菌感染中的重要元素[17]，并且可以抑制2 型登革熱病毒的感染[18]。CX3CR1 是趨化因子fractalkine 的受體，CX3CR1+細(xì)胞可以阻止沙門氏菌的侵襲[19]，并在控制可能導(dǎo)致組織損傷的異常腸道炎癥方面具有重要作用[20]。PRKCA 編碼蛋白激酶C 屬于絲氨酸和蘇氨酸特異性蛋白激酶家族，蛋白激酶C 參與調(diào)節(jié)先天免疫和適應(yīng)性免疫，參與2 型先天淋巴細(xì)胞的活化和Th2細(xì)胞的活化與增殖[21]。基于上述4 個基因構(gòu)建膿毒癥的預(yù)后風(fēng)險模型，結(jié)果顯示高風(fēng)險組28 d 生存率低于低風(fēng)險組。由此推測DEFA4、CAMP、CX3CR1和PRKCA 在膿毒癥的免疫調(diào)節(jié)中起到關(guān)鍵作用，且與預(yù)后緊密相關(guān)。ROC 曲線顯示，DEFA4、CAMP和CX3CR1 在訓(xùn)練集和驗(yàn)證集中均表現(xiàn)出一定的診斷能力（AUC＞0.75），而PRKCA 在驗(yàn)證集中AUC為0.673，說明DEFA4、CAMP、CX3CR1 和PRKCA可以成為膿毒癥免疫相關(guān)生物標(biāo)志物。本研究結(jié)果提示，DEFA4、CAMP、CX3CR1 和PRKCA 可能在膿毒癥的免疫調(diào)節(jié)中起到重要的作用，并且與預(yù)后緊密相關(guān)。探索膿毒癥的早期診斷生物標(biāo)志物以及構(gòu)建預(yù)后模型有助于給予膿毒癥患者及時有效的治療，同時提高患者生存率。

綜上所述，本研究基于4 個免疫相關(guān)的獨(dú)立預(yù)后基因DEFA4、CAMP、CX3CR1 和PRKCA，構(gòu)建了膿毒癥預(yù)后風(fēng)險模型，其在膿毒癥預(yù)后預(yù)測中具有一定的應(yīng)用價值，并且上述4 個基因都具有一定的膿毒癥診斷能力。