易錯PCR 技術提高嗜熱酸性III 型普魯蘭水解酶TK-PUL 催化活性的研究

曾 靜，郭建軍，袁林

（江西省科學院微生物研究所，江西南昌 330096）

優化工業淀粉制糖工藝的相關研究對于我國淀粉制糖工業的發展具有重要的技術和經濟意義。現行工業淀粉制糖工藝包括液化和糖化兩個步驟。液化步驟和糖化步驟的反應溫度、pH 均不同，并且淀粉制糖工藝中使用了多種淀粉水解酶（例如-淀粉酶、-淀粉酶、普魯蘭酶以及葡萄糖淀粉酶等），這些因素導致淀粉制糖工業的生產成本增加、生產效率降低。因此，如果能夠獲得一種在高溫液化條件下對淀粉原料同時進行液化和糖化作用的酶，則可有效降低生產成本，提高生產效率。

III 型普魯蘭多糖水解酶（EC 3.2.1.1/41）屬于糖苷水解酶類的第13 家族（GH13_20），是一種雙功能淀粉水解酶，同時具有-淀粉酶活性和普魯蘭酶活性。嗜熱酸性III 型普魯蘭多糖水解酶可在淀粉制糖工業的液化條件下完全水解淀粉為淀粉糖，有望實現“液化糖化一步法”淀粉酶法制糖工藝。嗜熱酸性III 型普魯蘭多糖水解酶TK-PUL 來源于極端嗜熱古生菌KOD1，具有優良的熱穩定性和高溫活性，并且其熱穩定性和高溫活性均不依賴于Ca，即TK-PUL 的酶學性質完全符合淀粉酶法制糖工業的需求。因此TK-PUL在淀粉酶法制糖工業中具有巨大的應用潛力。但是TK-PUL 的催化效率尚不能滿足淀粉酶法制糖工業的需求，難以在淀粉酶法制糖工業中高效地發揮水解作用，這限制了TK-PUL 在淀粉酶法制糖工業中的應用。通過蛋白質工程對TK-PUL 進行提高催化活性的分子改造可以為其在淀粉酶法制糖工業中的應用奠定基礎，對淀粉制糖工業的升級改造具有重要意義。此外，突變體催化效率強化的分子機制研究也可為其他淀粉水解酶以應用為導向的分子改造提供理論依據和設計思路。

易錯聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）就是目前采用最多的一種蛋白質體外定向進化技術，在酶分子的催化特性改善方面發揮重要作用。易錯PCR 技術已經應用于提升淀粉水解酶、脂肪酶、漆酶、-葡聚糖酶、糖基海藻糖合酶、纖維素酶等酶活力，并對研究影響酶催化性質的關鍵氨基酸殘基起到了重要指導作用。本研究擬運用易錯PCR 技術對TK-PUL 進行體外定向進化研究，以期獲得酶活力提高的突變體。進一步通過比較突變體與TK-PUL 的酶學特性和蛋白質分子結構，揭示突變體酶活力提高的可能分子機制。本研究有助于理解TK-PUL 的雙功能催化機制，也可為其他淀粉水解酶以應用為導向的分子改造提供理論依據和設計思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

TK-PUL 表達載體pBE-S-大腸桿菌JM109 均由本實驗室保存；DNA Marker、蛋白質Marker、質粒DNA 小量純化試劑盒、Secretory Protein Expression System、DNA Ligation Kit Ver.2.1、限制性內切酶 日本TaKaRa 公司；StarMut 隨機突變試劑盒 北京康潤誠業生物科技有限公司；Ni-NTA 親和層析柱 德國QIAGEN 公司；普魯蘭糖、可溶性淀粉、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖、潘糖、異潘糖 上海惠誠生物科技有限公司；Bradford 法蛋白質定量檢測試劑盒上海碧云天生物技術有限公司；LB 肉湯培養基 生工生物工程（上海）股份有限公司；其他試劑 均為國產分析純。

S1000 PCR 儀（Mastercycler gradient）美國Bio-Rad 公司；全自動數碼凝膠圖像分析系統（Tanon-4100）上海天能科技有限公司；紫外可見分光光度計（760CRT）上海儀電分析儀器有限公司；CMax Plus 酶標儀 日本Hitachi 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 易錯PCR 擴增 根據StarMut 隨機突變試劑盒說明書和TK-PUL 的基因序列，設計易錯PCR 引物。在引物的末端分別引入限制性內切酶I 和I 的酶切位點（如下劃線所示）：上游引物F 為5'-CGCATATGAGCGGATGTATCTCGGAGAGC-3'；下游引物R 為5'-TGTCTAGAACCCCGCTCAAGG ATGATTATC-3'。易錯PCR 反應的模板為pBE-S。PCR 反應體系為50 μL：模板DNA 1 μL、2×StarMut Random system 25 μL、上游引物F 1 μL、下游引物F 1 μL、StarMut Enhancer 0～20 μL、ddHO補足至50 μL。PCR 擴增條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，25 個循環；72 ℃ 7 min。通過調整PCR 反應體系中StarMut Enhancer 的添加量改變堿基突變率。

1.2.2 突變文庫的構建 采用DNA 膠回收試劑盒對易錯PCR 產物進行切膠回收。將重組載體pBES-和純化后的易錯PCR 產物分別用限制性內切酶I 和I 雙酶切后進行連接，其中酶切反應和連接反應均參照產品說明書進行。將連接產物電擊轉入大腸桿菌JM109 感受態細胞，轉化產物于37 ℃孵育1 h 后涂布于含100 μg/mL 氨芐青霉素的LB 平板，37 ℃培養16 h，提取所有轉化子中的重組質粒。采用改進的Spizizen 法將所獲得的重組質粒轉化RIK1285 感受態細胞，根據Secretory Protein Expression System 說明書，將轉化產物涂布于含10 μg/mL 卡那霉素的LB 平板上，于37 ℃培養24 h，即獲得突變文庫。

1.2.3 突變文庫的高通量培養和高通量篩選 突變文庫的高通量培養和高通量篩選參照文獻[13]方法進行。突變體文庫經高通量培養后，各突變體的發酵液上清用于-淀粉酶活性的高通量檢測。-淀粉酶活性的高通量檢測對應的吸光值的大小反應突變體的酶活大小，篩選出吸光值最大的突變體用做第2 輪易錯PCR 的模板或進行基因測序分析。

1.2.4 重組酶的誘導表達和純化 重組酶的誘導表達與純化參照文獻[13]進行。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）檢測重組酶的純度，并采用Bradford 法蛋白質定量檢測試劑盒測定重組酶的濃度。

1.2.5 重組酶的酶活力測定 分別以1%（m/V）可溶性淀粉或普魯蘭多糖為底物，參照文獻[13]測定重組酶的-淀粉酶活性和普魯蘭酶活性。酶活力單位（U）定義：在一定反應條件下，每分鐘催化產生1 μmol 還原糖的酶量為一個酶活力單位（U）。

1.2.6 重組酶的酶學性質測定 分別以1%可溶性淀粉或普魯蘭多糖為底物，測定重組酶的最適反應pH、pH 穩定性、最適反應溫度及熱穩定性。重組酶的酶學性質測定參照文獻[26]進行。重組酶的最適反應pH 以及pH 穩定性的測定范圍為pH3.0～9.0；于40～110 ℃下測定重組酶的最適反應溫度，并于100 ℃下測定重組酶的熱穩定性。測定重組酶的最適反應pH 或最適反應溫度時，將所測得的最高酶活定義為100%，其余測得酶活與最高酶活的比值定義為相對酶活。測定重組酶的pH 穩定性或熱穩定性時，將未處理酶液的酶活定義為100%，處理后酶液的酶活與未處理酶液的酶活的比值定義為剩余酶活。

1.2.7 重組酶的動力學常數測定 分別以可溶性淀粉或普魯蘭多糖為底物，測定重組酶的動力學常數。重組酶的動力學常數測定參照文獻[26]進行。可溶性淀粉的濃度梯度設定為5.0、10.0、15.0、20.0、30.0、35.0 mg/mL；普魯蘭多糖的濃度梯度設定為1.6、3.2、6.4、12.8、16.0、20.0 mg/mL。

1.2.8 生物信息學分析 將篩選獲得的突變體送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行基因測序，并根據基因的堿基序列生成氨基酸序列，分析堿基及氨基酸的突變情況。以TK-PUL（PDB ID：5OT1）的蛋白質分子結構為模板，采用SWISS-MODEL（http://swissmodel.expasy.org）同源模建突變體的蛋白質分子結構，并采用三維圖像軟件PyMOL v2.5.2 顯示TK-PUL 及突變體的三級結構。

1.3 數據處理

所有試驗均重復3 次，試驗結果用平均值±標準差表示，運用軟件SigmaPlot 14.0 對試驗數據進行統計分析并作圖。

2 結果與分析

2.1 易錯PCR 條件的確立

根據StarMut 隨機突變試劑盒說明書，調整PCR反應體系中StarMut Enhancer 的添加量可以改變堿基突變率。因此我們根據實驗要求，在PCR 反應體系中加入不同體積的StarMut Enhancer，進行易錯PCR 反應，構建突變體文庫。從每組突變體文庫中隨機挑取10 株菌進行基因測序以計算突變率，如表1 所示，其中StarMut Enhancer 的添加量為1 μL時的平均突變率為0.26%，接近目前公認的合適突變率0.25%，因此本研究易錯PCR 反應體系中Star-Mut Enhancer 的添加量為1 μL。

表1 PCR 反應體系中StarMut Enhancer 添加量對應的PCR 突變率Table 1 PCR mutation rates corresponding to the supplemental level of StarMut Enhancer in the PCR reaction system

2.2 突變體文庫的構建與高通量篩選

以重組質粒pBE-S-為模板進行第1 輪易錯PCR，回收PCR 產物，將其雙酶切處理后連接經同樣雙酶切處理的載體，將連接產物轉化大腸桿菌JM109 感受態細胞，提取所有轉化子所含重組質粒。將所獲得的重組質粒轉化RIK1285感受態細胞，獲得容量約為2500 株轉化子的突變體文庫。利用高通量篩選方法篩選突變體文庫中酶活力提高的轉化子，共獲得10 株胞外-淀粉酶活力提高的轉化子（數據未顯示）。再次采用高通量篩選方法對以上10 株轉化子（定義為轉化子1～轉化子10）以及包含重組質粒pBE-S-的轉化子（定義為轉化子C）進行胞外-淀粉酶活力的測定，結果如表2所示，篩選得到2 株胞外-淀粉酶活力提高幅度最大的轉化子（轉化子2 和轉化子7）。提取這2 株轉化子中重組質粒，并以這兩種重組質粒為模板進行第2 輪易錯PCR，按照同樣的方法獲得容量約為2800 株轉化子的突變體文庫。然而對新的突變體文庫進行高通量篩選未能獲得酶活力進一步提高的突變體。對經第1 輪易錯PCR 反應獲得的2 個重組質粒進行測序，測序結果顯示這2 個重組質粒包含的突變位點一致，其第1612 位堿基由C 突變為G、第1613 位堿基由T 突變為A，即基因編碼序列CTC突變為GAC，氨基酸序列由Leu538 突變為Asp538。即本研究通過易錯PCR 技術對TK-PUL 進行體外定向進化，獲得了酶活力提高的突變體L538D。

表2 轉化子的高通量篩選結果Table 2 High throughput screening results of the transformants

2.3 TK-PUL 和突變體L538D 的表達、純化及比酶活測定

枯草芽孢桿菌作為傳統的工業生產菌株，具有分泌能力強、培養條件和基因操作簡單、發酵工藝成熟等優點，被認為是理想的外源蛋白質的分泌表達宿主菌。本研究于枯草芽孢桿菌表達系統中表達TKPUL 和突變體L538D，重組酶TK-PUL 和突變體L538D 均得到成功表達。采用Ni親和層析法對重組酶進行純化，并采用SDS-PAGE 檢測各重組酶的純度。如圖1 所示，TK-PUL 和突變體L538D 的表觀分子質量分別約為84 kDa，大小均與理論值相符。根據SDS-PAGE 檢測圖中蛋白質條帶的灰度分析結果，重組酶TK-PUL 和突變體L538D 的純度均達到95%以上。

圖1 TK-PUL 和突變體L538D 的SDS-PAGE 檢測圖Fig.1 SDS-PAGE analysis of TK-PUL and the mutant L538D

采用Bradford 法測定TK-PUL 和突變體L538D的蛋白質濃度，并測定其分別以可溶性淀粉和普魯蘭多糖為底物的比酶活力，結果如表3 所示。TKPUL 的-淀粉酶比酶活力為54.08 U/mg，L538D 的-淀粉酶比酶活力為81.14 U/mg。與TK-PUL 相比，L538D 的-淀粉酶比酶活力提高了50%。TKPUL 的普魯蘭酶比酶活力為110.39 U/mg，L538D 的普魯蘭酶比酶活力為133.18 U/mg。與TK-PUL 相比，L538D 的普魯蘭酶比酶活力提高了21%。TKPUL 的-淀粉酶活性與普魯蘭酶活性的比值為0.49，L538D 的-淀粉酶活性與普魯蘭酶活性的比值為0.61。以上結果表明，與TK-PUL 相比，突變體L538D 的-淀粉酶活性和普魯蘭酶活性均明顯提高，并且其-淀粉酶活性的提高幅度更大。

表3 TK-PUL 及突變體L538D 于100 ℃的比酶活力Table 3 Specific activities of TK-PUL and the mutant L538D at 100 oC

2.4 TK-PUL 和突變體L538D 的酶學性質

本研究測定了pH 和溫度對TK-PUL 及突變體L538D 酶學性質的影響。由圖2（A）可知。以1%可溶性淀粉或普魯蘭多糖為底物時，TK-PUL 及突變體L538D 的最適反應pH 均約為4.5，并且兩者的相對酶活隨pH 的變化趨勢也基本相同。另外，圖2（B）顯示，在pH 為3.0～9.0 的范圍內，TK-PUL 及突變體L538D 的pH 穩定性也幾乎一致。這表明TK-PUL中L538D 位點變化不影響其最適反應pH 和pH 穩定性。

TK-PUL 及突變體L538D 的最適反應溫度測定結果如圖2（C）所示。TK-PUL 及突變體L538D 的最適反應溫度均約為100 ℃，在40～110 ℃的范圍內兩者的相對酶活隨溫度的變化趨勢也基本相同。同時，由圖2（D）可知，TK-PUL 及突變體L538D 于100 ℃的熱穩定性也基本一致，于100 ℃的半衰期均約為2 h。即TK-PUL 中L538D 位點變化也不影響其最適反應溫度和熱穩定性。

圖2 TK-PUL 和突變體L538D 的酶學性質Fig.2 Enzymatic properties of TK-PUL and the mutant L538D

2.5 TK-PUL 及L538D 的動力學常數測定

本研究測定并比較了TK-PUL 及突變體L538D于100 ℃的動力學常數，依此來確定TK-PUL 中L538D 位點變化對其底物結合能力和底物降解能力的影響。由表4 可知，以可溶性淀粉或普魯蘭多糖為底物時，與TK-PUL 相比，突變體L538D 的K值基本不變，k值均明顯提高。其中以可溶性淀粉為底物時，突變體L538D 的k/K值提高了44%；以普魯蘭多糖為底物時，突變體L538D 的k/K值提高了27%。以上結果表明，TK-PUL 中L538D 位點變化不影響TK-PUL 對底物的結合能力，并有利于提高其對底物的降解能力，特別有利于提高其對可溶性淀粉的降解能力。

表4 TK-PUL 及突變體L538D 的動力學常數Table 4 Kinetic parameters of TK-PUL and the mutant L538D

2.6 突變位點分析與分子結構模擬

以TK-PUL（PDB ID：5OT1）的蛋白質分子結構為模板，采用Swiss-Model 同源模建突變體L538D的蛋白質分子結構。采用三維圖像軟件PyMOL v2.5.2 顯示TK-PUL 及突變體L538D 的三級結構。由圖3（A1）可知，TK-PUL 具有糖苷水解酶第13 家族酶分子結構和催化機制上的共同特征，如三個結構域、四個高度保守的保守基序、保守的催化活性中心（Asp503、Glu534、Asp601）等。蛋白質的分子結構具有較強的穩定性，單個氨基酸殘基的突變不會明顯改變蛋白質分子的三維結構，所以突變體L538D與TK-PUL 的三級結構基本一致（如圖3 所示）。由圖3（A2）可知，TK-PUL 中Leu538 距離其催化活性中心和底物結合中心較遠，無直接相互作用。本研究結果也表明，TK-PUL 中L538D 位點變化不影響其最適反應pH、pH 穩定性、最適反應溫度及熱穩定性。因此蛋白質分子結構對比分析結果與本研究實驗結果是相對應的。但是已有研究結果表明，催化活性位點附近的氨基酸殘基的側鏈大小以及側鏈性質影響酶分子水解糖苷鍵的活性和特異性。Leu538鄰近催化活性位點Glue534，兩者均位于同一loop 結構上。TK-PUL 中L538D 位點變化可能通過縮短氨基酸殘基側鏈的長度和減弱氨基酸殘基的疏水性，改變催化活性位點Glu534 所在loop 結構的柔性，進而提高酶的催化活性。

圖3 TK-PUL 和突變體L538D 的三級結構模擬圖Fig.3 Three-dimensional modelling of TK-PUL and the mutant L538D

3 結論

本研究采用易錯PCR 技術對III 型普魯蘭多糖水解酶TK-PUL 進行體外定向進化，獲得催化活性提高的突變體L538D。TK-PUL 中Leu538 是影響其催化效率的重要氨基酸殘基。將TK-PUL 中催化活性位點Glu534 鄰近的氨基酸殘基Leu538 替換為側鏈長度更短并且極性更強的氨基酸殘基Asp538，有利于提高TK-PUL 的催化活性。突變體L538D有望應用于“液化糖化一步法”的淀粉制糖工藝，可極大地簡化淀粉酶法制糖工藝和提高生產效率。本研究也可為其他淀粉水解酶以應用為導向的分子改造提供理論依據和設計思路。