醬油渣中具有抑菌活性的乳酸菌的篩選及其抑菌特性

呂 蕾，楊曉萍，王阿利，鐘先鋒，黃桂東,，趙嘉樂

（1.佛山科學技術學院食品科學與工程學院，廣東佛山 528231；2.廣東省傳統發酵食品工程技術研究中心，廣東佛山 528231；3.廣東省食品流通安全控制工程技術研究中心，廣東佛山 528231；4.佛山市釀造工程技術研究中心，廣東佛山 528231；5.佛山市農業生物制造工程技術研究中心，廣東佛山 528231）

乳酸菌是普遍公認安全（generally recognized as safe，GRAS）的微生物，不僅能賦予食品特殊風味，且部分乳酸菌能分泌細菌素等抑菌物質。乳酸菌所產細菌素是低分子量蛋白質或多肽，能抑制食品腐敗，延長貨架期，且無毒、無抗藥性、無副作用、可被分解消化。目前乳酸菌源細菌素作為新型生物抑菌劑在食品安全方面成為了化學防腐劑的良好替代品，逐漸成為食品科學研究的熱點。

發酵食品是產細菌素乳酸菌的重要來源。Gutiérrez-Cortés 等從巴西新鮮手工奶酪中分離出多株乳酸菌，其能產生抑制單核細胞增生李斯特氏菌的細菌素；劉樹昕等從新疆傳統酸奶中得到一株抑菌效果良好的植物乳桿菌，并鑒定出菌株主要抑菌物質是IIb 類細菌素；舒梨等從濃香型窯泥中分離出抑菌活性較高的副干酪乳桿菌，其抑菌物質是具有蛋白質特性的細菌素。但當前細菌素商業化產品較少，且抑菌特性不穩定。乳酸鏈球菌的Nisin 是目前唯一被美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration，FDA）官方批準認可的食品防腐劑，因此亟需開發穩定、安全、具有高效抑菌活性的細菌素，作為新型生物抑菌劑延長食品保質期。

醬油渣是醬油發酵結束后殘留的固形物質，作為工業副產物產量巨大，其所含微生物和營養物質豐富，主要微生物為乳酸菌、酵母等，具備再次加工利用的潛力。目前，國內外學者對醬油渣中篩選有益菌株的相關研究關注較少?，F有研究表明，醬油渣的綜合利用基本集中在副產物飼料生產和化工能源方面，如何實現醬油渣中產細菌素的有益微生物篩選和利用的問題仍值得深入探討。本課題組前期以醬油渣為材料，分離鑒定得到多株乳酸菌，且具有耐受模擬胃腸環境能力、疏水能力及抗氧化能力等特性。為進一步開發現有乳酸菌的有益生物活性，本研究以醬油渣中分離得到的16 株乳酸菌為出發菌株，擬篩選出具有高效抑菌活性的乳酸菌，并通過有機酸、過氧化氫排除試驗，酶敏感試驗初步分析乳酸菌上清液的抑菌物質和其抑菌特性，為乳酸菌回填以提升醬油耐儲藏品質提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

16 株乳酸菌 實驗室前期從醬油渣中篩選獲得，其中ZW2 為已鑒定稱為HT31 的副干酪乳桿菌副干酪亞種、ZW9 為已鑒定稱為HT4 的乳酸乳球菌霍氏亞種，ZW14 為已鑒定稱為HT155 的副干酪乳桿菌堅韌亞種；金黃色葡萄球菌（ATCC 25923）南京茂捷微生物科技有限公司；大腸桿菌（ATCC 25922）上海魯傲科技有限公司；MRS 肉湯、酵母提取物、胰化蛋白胨、瓊脂粉 廣東環凱微生物科技有限公司；胰蛋白酶（2500 U/mg）、蛋白酶K（20 U/mg）、胃蛋白酶（2500 U/mg）、-蛋白酶（400 U/mg）、堿性蛋白酶（200 U/mg）、中性蛋白酶（4 U/mg）生工生物工程股份有限公司；氯化鈉、吐溫-80、Triton X-100、SDS、尿素 天津市大茂化學試劑廠。

ME104 電子分析天平 梅特勒-托利多精密儀器公司；SW-CJ-1FD 超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；LRH-150 恒溫培養箱 上海一恒科學儀器有限公司；GR60DA 全自動滅菌鍋 致微（廈門）儀器；SY-1220 水浴鍋 美國精騏有限公司；Epoch2 微孔板分光光度計酶標儀 美國伯騰儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 指示菌懸液制備 參考馬國涵等的方法，將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌分別接種于LB 液體培養基中，經3 代活化后，于4 ℃保存備用。

1.2.2 乳酸菌上清液制備 參照馬國涵等和杜宏等的方法，16 株乳酸菌甘油菌各取200 μL（2%，v/v）接種于MRS 肉湯中，活化3 代后，4 ℃、6000 r/min離心15 min，0.22 μm 濾膜過濾，得乳酸菌上清液，4 ℃保存備用。

1.2.3 具有抑菌活性乳酸菌的篩選 參照黃奕雯等的方法，以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌為指示菌，采用牛津杯雙層平板法，每個孔中加200 μL 乳酸菌上清液，檢測16 株醬油渣源乳酸菌上清液中是否有抑菌物質。經室溫擴散4 h，培養箱37 ℃培養24 h，測定抑菌圈直徑大小，判斷乳酸菌上清液抑菌活性，選取對兩種指示菌均有抑菌活力的乳酸菌上清液進行后續抑菌物質分析。

1.2.4 乳酸菌抑菌物質分析 乳酸菌在代謝過程中產生的抑菌物質主要是有機酸、HO和細菌素等，尤其細菌素是蛋白類物質，易被人體蛋白酶降解完全，安全無毒，是極具潛力和應用前景的生物抑菌劑。為進一步明確1.2.3 篩選獲得的對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有抑菌活性的醬油渣源乳酸菌上清液中的抑菌物質，采用NaOH 中和法，排除發酵產物中有機酸影響，用過氧化氫酶處理排除過氧化氫影響，通過酶敏感試驗進一步驗證抑菌物質是否是細菌素。

1.2.4.1 有機酸排除試驗 參考黃奕雯等的方法，用2 mol/L NaOH 調節乳酸菌上清液的pH 至6.0，用1 mol/L 的乳酸、鹽酸、乙酸分別調節MRS 肉湯至pH6.0 和未處理乳酸菌上清液（pH4.2）作為對照，如1.2.3 所示，進行抑菌試驗。

1.2.4.2 過氧化氫排除試驗 參照黃奕雯等的方法，用0.05 mol/L（pH7.0）的磷酸鹽緩沖液溶解適量的HO酶，加入經排酸后的乳酸菌上清液（pH6.0）中，使HO酶終濃度為1 mg/mL。37 ℃水浴2 h，以未處理乳酸菌上清液（pH4.2）和加酶空白培養基作為對照組，如1.2.3 所示，進行抑菌試驗。

1.2.4.3 酶敏感驗證實驗 參照劉樹昕等的方法，分別用0.05 mol/L（pH7.0）的磷酸鹽緩沖液溶解適量的胰蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、-淀粉酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶，分別加入排除酸和HO后的乳酸菌上清液中，使各蛋白酶終濃度均為1 mg/mL，分別將pH 調整為酶最適pH（依次為8.5、2.0、6.5、9.8、7.5），37 ℃水浴2 h。以未經各種酶處理的上清液（pH4.2）和加酶MRS 肉湯為對照組，如1.2.3 所示，進行抑菌試驗。

1.2.5 抑菌動力學曲線 參照王萌萌等的方法稍作修改，將1.2.4 篩選出具有抑制效果的菌株按2%（v/v）的接種量加入到100 mL MRS 肉湯中，37 ℃恒溫培養，每隔2 h 測OD值，pH 值及乳酸菌上清液對大腸桿菌指示菌的抑菌圈直徑，繪制抑菌動力學曲線。

1.2.6 影響乳酸菌上清液抑菌活性的因素

1.2.6.1 溫度對乳酸菌上清液抑菌活性影響 參照曹海鵬等方法，將乳酸菌上清液分裝5 mL 至試管中，分別置于40、60、80、100 ℃的水浴鍋以及121 ℃高壓鍋中處理30 min，室溫冷卻，以大腸桿菌為指示菌，參照1.2.3 進行抑菌試驗。

1.2.6.2 pH 對乳酸菌上清液抑菌活性影響 參考高欣等方法，將每管5 mL 乳酸菌上清液分別用2 mol/L的HCl 和2 mol/L 的NaOH 溶液調節pH 為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0，以大腸桿菌為指示菌，參照1.2.3 進行抑菌試驗。

1.2.6.3 紫外線對乳酸菌上清液抑菌活性影響 參考郝艷芳等方法，將每管5 mL 乳酸菌上清液在距離40 W 紫外燈20 cm 處分別照射15、30、60、90、120 min，以大腸桿菌為指示菌，參照1.2.3 進行抑菌試驗。

1.2.6.4 表面活性劑對乳酸菌上清液抑菌活性影響參考舒梨等的方法，將表面活性劑吐溫-80、Triton X-100、SDS 和尿素分別加入裝有5 mL 乳酸菌上清液的試管中，在37 ℃水浴鍋溫育2 h 后，以大腸桿菌為指示菌，參照1.2.3 進行抑菌試驗。

1.3 數據處理

本研究所有實驗均重復3 次及以上，數據采用平均值±標準偏差形式，應用Origin 2019 軟件進行繪圖，并采用SPSS 25.0 軟件進行單因素方差分析，以最小顯著差異法（LSD）進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 醬油渣源具有抑菌活性的乳酸菌的篩選

前期從醬油渣中篩選分離得到的16 株乳酸菌，編號依次為ZW1～ZW16，以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為指示菌，根據抑菌圈大小進行抑菌活性初步篩選。由表1 可知，大腸桿菌抑菌實驗中，12 株菌對大腸桿菌有抑菌作用，其中ZW9 抑菌效果最好，抑菌圈直徑為15.63±0.04 mm，抑菌圈最小乳酸菌是ZW7，直徑為9.31±0.03 mm；金黃色葡萄球菌抑菌實驗中，4 株乳酸菌上清液對金黃色葡萄球菌有抑菌作用，且ZW9 抑菌效果最好；而ZW6、ZW10、ZW11對兩種指示菌均無抑菌效果。整體而言，16 株乳酸菌對兩種指示菌有不同的抑制作用，且乳酸菌上清液對大腸桿菌的抑制效果更明顯。其中，菌株ZW2、ZW9、ZW14 同時對兩種指示菌的抑菌效果較好，可進一步研究菌株產生的抑菌物質及其影響因素。

表1 不同乳酸菌上清液對指示菌的抑制作用（mm）Table 1 Inhibitory effect of different lactic acid bacteria supernatant on indicator bacteria (mm)

2.2 醬油渣源乳酸菌抑菌物質分析

2.2.1 酸排除結果 排酸試驗結果如表2 所示。結果顯示，采用NaOH 中和后的pH6.0 乳酸菌上清液對兩種指示菌具有明顯的抑制作用，與未經處理乳酸菌上清液（pH4.2）抑菌活性相比差異不顯著（>0.05），說明排除酸作用后對兩種指示菌抑菌圈仍明顯；而1 mol/L 的乳酸、乙酸、鹽酸調節pH 至6.0 的MRS肉湯對兩種指示菌無抑菌作用。由此推測，有機酸不是乳酸菌上清液抑菌作用的主要物質，還可能存在其他抑菌物質，這與馬迎濤進行的副干酪乳桿菌的排酸試驗結果一致。

表2 有機酸對乳酸菌上清液抑菌活性的影響（mm）Table 2 Effect of organic acids on antibacterial activity of lactic acid bacteria supernatant (mm)

2.2.2 過氧化氫排除結果 HO排除試驗結果見表3，經HO酶處理的乳酸菌上清液與未經處理的乳酸菌上清液相比，均具有抑菌活性。經HO酶處理的乳酸菌上清液其抑菌活性僅降低了5.59%～9.90%，說明HO不是主要抑菌作用因素，該結果與涂小麗等的研究：用HO酶處理后的乳酸菌上清液對兩種指示菌仍有較強抑制作用一致，提示乳酸菌上清液可能存在其他抑菌物質。

表3 過氧化氫酶處理對乳酸菌上清液抑菌活性的影響（mm）Table 3 Effect of catalase treatment on antibacterial activity of lactic acid bacteria supernatant (mm)

2.2.3 酶敏感性結果 酶敏感試驗結果如表4 所示。經6 種蛋白酶（胰蛋白酶、胃蛋白酶、-蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、蛋白酶K）處理的乳酸菌上清液對兩種指示菌的抑制效果有不同程度變化。胰蛋白酶處理的乳酸菌上清液與未經酶處理的乳酸菌上清液相比，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌活性顯著降低（<0.05）；胃蛋白酶處理的乳酸菌上清液與未經處理的乳酸菌上清液相比，對大腸桿菌的抑菌活性顯著降低（<0.05），而對金黃色葡萄球菌無抑菌作用；-蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、蛋白酶K 處理的乳酸菌上清液對兩種指示菌無抑制作用。上述結果表明，3 株乳酸菌上清液的抑菌物質對蛋白酶敏感，能被其分解，初步推斷是一種具有蛋白質類特性的細菌素，乳酸菌上清液中該物質具備良好的抑菌效果，與Zhang 等研究具備抑菌作用的細菌素對蛋白酶敏感的結果一致。

表4 不同酶處理對乳酸菌上清液抑菌活性的影響（mm）Table 4 Effect of different enzyme treatments on antibacterial activity of lactic acid bacteria supernatant (mm)

2.3 抑菌動力學曲線

經抑菌活性乳酸菌的篩選和抑菌物質分析發現，菌株ZW2、ZW9、ZW14 發酵上清液對大腸桿菌抑制作用較好，以大腸桿菌為指示菌，進一步研究菌株的抑菌動力學曲線，結果如圖1 所示。菌株的生長曲線顯示：菌株生長呈典型的“S”型，在遲緩期4 h 內，3 株菌增長緩慢，OD值變化不明顯；培養4 h 后進入生長對數期，隨著發酵時間的延長，菌液濃度呈指數增長，細胞代謝活躍；培養20 h 后達到生長穩定期，3 株乳酸菌OD均穩定在1.5 左右。菌株的pH 變化曲線顯示：乳酸菌從接種至培養4 h 時，pH 有小幅下降；培養4～20 h 時，pH 迅速下降；培養20～28 h 時，pH 趨于3.5 左右，說明3 株菌有一定產酸能力。以大腸桿菌為指示菌株，乳酸菌上清液的抑菌活性顯示：進入生長對數期后菌株開始呈現抑菌活性，隨培養時間的延長，抑菌圈直徑不斷增大，20 h 后抑菌圈直徑趨于穩定。上述結果表明，抑菌物質產生于生長對數期，隨菌液濃度增加，pH 不斷降低，細菌素的抑菌活性不斷增強；在穩定期時，培養基中碳源和氮源的耗盡使細菌生長受到抑制，代謝物產量、pH 與抑菌活性趨于穩定，這與涂小麗等和張建飛等報道的乳酸菌抑菌動力學曲線總體變化結果一致。綜上所述，選取培養時間20 h 為最佳觀察抑菌圈直徑時間。

圖1 ZW2、ZW9、ZW14 菌株的抑菌動力學曲線Fig.1 Antimicrobial kinetics curves of ZW2,ZW9,ZW14

2.4 乳酸菌上清液抑菌效果影響因素研究

2.4.1 溫度穩定性 溫度是影響蛋白質的空間結構及生物功能的主要因素之一，隨溫度升高蛋白質空間結構遭到破壞，相應的生物功能也發生變化。在食品工業中，巴氏殺菌溫度為65～80 ℃，微生物（含芽孢）滅菌溫度為121 ℃，為探究乳酸菌上清液的抑菌物質對溫度的耐受性情況，選擇40～121 ℃區間進行觀察，如圖2 所示。結果顯示，經40、60、80、100 ℃處理后，菌株ZW2、ZW9 的抑菌圈直徑基本無變化（>0.05），經121 ℃處理后抑菌活性降低（<0.05）；ZW14 上清液經60、80、100、121 ℃處理后，抑菌圈直徑顯著減?。?0.05）。3 株乳酸菌經熱處理的上清液與未經熱處理的上清液相比，抑菌活性均出現一定程度的下降，這是由于高溫引起部分蛋白或多肽失活，但菌株上清液的抑菌活性仍保持在90%以上。結果表明，3 株乳酸菌上清液細菌素具有極好的熱穩定性，與Qiao 等從傳統發酵馬奶篩選到殼狀乳桿菌細菌素經加熱處理后仍保持較好抑菌活性的結果一致。耐高溫的細菌素在食品工業高溫滅菌生產過程中具有較大優勢。細菌素是乳酸菌產生的具有抑菌活性的主要物質，Ishibashi 等和Han 等研究顯示乳酸菌產生多是Class Ⅱb 類雙肽細菌素，且Class Ⅱ類細菌素耐熱性強，推測本研究乳酸菌所產可能為Class Ⅱb 類細菌素。

圖2 溫度對乳酸菌細菌素的影響Fig.2 Effect of temperature on lactic acid bacteriocin

2.4.2 pH 耐受性 乳酸菌上清液對pH 敏感性結果如圖3 所示。結果表明，3 株乳酸菌的抑菌物質對pH2.0～6.0 環境具有較強耐受性，而在中性、堿性環境（pH8.0～10.0）條件下，抑菌活性降低甚至喪失。Zacharof 等研究也發現酸性條件有助于乳酸菌細菌素更有效地吸附到致病菌上，從而能發揮更好的殺菌效果。pH 增高會導致分子內靜電相互作用而引起細菌素結構改變，從而導致抑菌活性下降甚至徹底喪失。3 株乳酸菌細菌素的酸性耐受性強，有利于作為生物抑菌劑應用在酸性食品保鮮中。

圖3 pH 對乳酸菌細菌素的影響Fig.3 Effect of pH on bacteriocin of lactic acid bacteria

2.4.3 紫外線敏感性 蛋白質的氫鍵經過紫外輻照后會被破環，甚至會使某些蛋白質喪失基礎功能，最終導致蛋白性質改變，乳酸菌上清液對紫外線敏感性如圖4 所示。由圖4 數據變化規律可知，3 株乳酸菌細菌素在不同時間紫外線輻射下均表現出抑菌活性，而對紫外線耐受性不盡相同。隨著紫外線照射時間增加，紫外線輻射60 min 后3 株乳酸菌上清液抑菌效果與未經處理的上清液相比，呈顯著性下降（<0.05），但紫外線輻射120 min，乳酸菌上清液抑菌活性仍保留近80%。由此可見，3 株乳酸菌細菌素對紫外線敏感性較弱。本研究結果與冉軍艦等研究嗜酸乳桿菌在紫外照射超過1 h 其抑菌活性才有顯著性降低的報道相似。ZW2、ZW9、ZW14 乳酸菌細菌素作為生物抑菌劑對紫外線有很好的耐受性，適用于食品工業中需紫外線殺菌消毒的食品。

圖4 紫外線對乳酸菌細菌素的影響Fig.4 Effects of ultraviolet on lactic acid bacteriocin

2.4.4 表面活性劑敏感性 乳酸菌上清液經不同表面活性劑處理后的抑菌活性變化如圖5 所示，3 株乳酸菌上清液均具有一定抑菌活性，并且細菌素對不同表面活性劑敏感性不同。乳酸菌上清液經吐溫-80、Triton X-100、SDS 處理后對大腸桿菌抑菌圈直徑均大于未經處理的上清液，3 種表面活性劑顯著提高乳酸菌上清液的抑菌能力（<0.05），推測它們改變了蛋白質空間結構，使細菌素溶解度增大，穩定性提高，從而增強了抑菌效果，這與李志如等研究表面活性劑的試驗結果一致。而經尿素處理的乳酸菌上清液與未經處理的上清液相比，抑菌活性呈顯著性下降（<0.05），推測尿素對抑菌物質有一定拮抗作用，能破壞氫鍵，導致蛋白質分子結構松弛，使蛋白質變性失活，但抑菌活性仍保留80%～90%。

圖5 表面活性劑對乳酸菌細菌素的影響Fig.5 Effects of surfactant on lactic acid bacteriocin

3 結論

本論文以實驗室前期從醬油渣中分離的16 株乳酸菌作為出發菌株，以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌為指示菌，篩選得到了具有高效抑菌活性的乳酸菌ZW2、ZW9、ZW14。經有機酸排除、HO排除、酶敏感試驗分析，有機酸和HO不是菌株主要抑菌物質，可能存在具有蛋白質屬性的抑菌活性物質。菌株的抑菌動力學曲線和抑菌活性穩定性結果顯示，3 株乳酸菌在培養20 h 后抑菌活性趨于穩定；菌株中的抑菌物質在40～100 ℃具有良好的熱穩定性；菌株在pH2.0～6.0 中抑菌效果較強，對酸具有較好的耐受性；菌株中的抑菌物質對紫外線不敏感；表面活性劑吐溫-80、Triton X-100、SDS 對菌株抑菌活性有促進作用，而尿素對抑菌活性有一定抑制作用。綜上所述，通過醬油渣篩選獲得的ZW2、ZW9、ZW14 乳酸菌細菌素，在高溫處理的食品保鮮、酸性食品保鮮、紫外滅菌食品保鮮等生物防腐方面具有應用潛力，為后續研究3 株乳酸菌細菌素類型、抑菌作用機理及安全性奠定了基礎，也為醬油渣源乳酸菌資源開發應用提供了科學依據。