油茶粕膳食纖維的超聲輔助酶法提取工藝優化及理化性質分析

張 智，宋偉，閆建英，薛紅洋

（東北林業大學林學院，黑龍江哈爾濱 150040）

膳食纖維（Dietary Fiber，DF）作為第七大營養素，有著突出的應用前景。IDF 在自然界中的占比為90%以上，而SDF 的生理特性要優于IDF，SDF含量在10%以上更好。油茶（）廣泛分布于亞洲熱帶和亞熱帶地區，是世界四大木本油料樹種之一。油茶粕（meal）為油茶籽制油后的副產物，營養價值高，然而由于開發強度不足而造成了資源浪費。從油茶粕中提取膳食纖維，不僅提高了油茶粕的附加價值，帶來經濟效益，還可以避免資源浪費和環境污染。

目前提高SDF 含量的方法主要有物理法、化學法和生物法。李怡杰等使用微波法提取油茶粕SDF 的得率為12.55%，低于盧忠英等用微波輔助酶法提取SDF 的得率，陳曉媛用突變菌株發酵提取油茶粕SDF 得率為3.81%，持水力和膨脹力分別為2.50 g/g 和0.88 mL/g，均低于李怡杰等提取得到的IDF。馬力等提取得到的油茶粕膳食纖維溶脹性與持水力最高，但都未對提取的油茶粕膳食纖維理化性質及結構表征進行綜合分析。

酶法提取DF 條件溫和環保，纖維素酶可降低DF 分子量，增加SDF 含量。超聲波處理操作簡單，可破壞多糖的化學鍵，影響聚合物的形態和結構，使組織疏松，活性成分更好的溶解。在適當的條件下使用超聲波處理可提高酶的活性，研究發現在17.33 W/cm的超聲條件下處理30 min 后，纖維素酶活性比原來提高約25%。本實驗采用超聲輔助酶法對油茶粕進行處理來提高SDF 得率，并對其提取工藝進行優化，獲得高品質膳食纖維，之后對TDF 的理化性質及結構表征進行綜合分析。本實驗酶用量少，提取時間較短，可減少經濟與時間成本，為油茶粕的綜合利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

油茶粕 重慶秀山提供（由實驗室經脫茶皂素處理）；纖維素酶（1×10U/g）和氏璧生物科技有限公司；堿性蛋白酶（200 U/mg）、葡萄糖、膽固醇標準品、-淀粉酶（150 U/mg）上海源葉生物科技有限公司；其它試劑均為國產分析純；石油醚（沸程為30～60 ℃）天津市富宇精細化工有限公司。

KQ-300DE 型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；JSM-7500F 掃描電鏡 日本JEOL公司；Spectrum 400 傅里葉紅外光譜 美國Thermo Nicolet 公司；Zetapals 激光粒度儀 美國布魯克海文儀器有限公司；UV-5500PC 型紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；SJ-3F 型pH 計 上海圣科儀器設備有限公司；HY-200 標準篩（60 目）北京祥宇偉業儀器設備有限公司；JA2003 分析天平上海良平儀器儀表有限公司；RE-52 旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器公司；RT-6000 型酶標儀 深圳雷杜生命科學有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料預處理 將油茶籽粕脫脂（浸泡于石油醚中24 h）并蒸干溶劑，脫蛋白（料液比1:10 g/mL；堿性蛋白酶1.0 %；pH9；1.5 h；60 ℃）脫淀粉（-淀粉酶1.0%；pH6；1.5 h；60 ℃），濃縮后加入四倍95%乙醇醇沉2 h 抽濾，將預處理后得到的固體烘干粉碎并過60 目篩，儲存在干燥器中備用。

1.2.2 膳食纖維制備工藝 將一定比例的纖維素酶加入經過預處理后的油茶粕粉，用蒸餾水調節超聲酶解料液比，選擇適宜的酶解條件進行超聲酶解處理。處理一段時間后高溫滅酶并離心，上清液加入4 倍體積的乙醇醇沉2 h 過濾干燥可得SDF，沉淀用乙醇和丙酮洗滌并干燥可得IDF，兩者混合則為TDF。

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 酶添加量的影響 在pH5.5、溫度55 ℃、超聲時間30 min、超聲功率240 W、料液比1∶25 g/mL的條件下探究不同酶添加量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）對SDF 得率的影響。

1.2.3.2 超聲時間的影響 確定酶添加量為0.2%，其他條件同上，探究不同超聲時間（10、20、30、40、50 min）對SDF 得率的影響。

1.2.3.3 超聲功率的影響 確定酶添加量為0.2%，超聲時間為30 min，其他條件同上，探究不同超聲功率（150、180、210、240、270 W）對SDF 得率的影響。

1.2.3.4 料液比的影響 確定酶添加量為0.2%，超聲時間為30 min，超聲功率為210 W，其他條件同上，探究不同料液比（1:15、1:20、1:25、1:30、1:35 g/mL）對SDF 得率的影響。

1.2.4 響應面試驗 以酶添加量（A）、超聲時間（B）、超聲功率（C）、料液比（D）四個因素，SDF 得率為響應值進行響應面試驗，采用 Design Expert 2018 軟件建立四因素三水平試驗，因素水平如表1所示。

表1 響應面條件優化試驗因素水平Table 1 Response surface condition optimization test factor level

1.2.5 得率測定

1.2.5.1 SDF 得率計算

式中：M表示SDF 干重，g；M表示樣品干重，g。

1.2.5.2 IDF 得率計算

式中：M表示IDF 干重，g；M表示樣品干重，g。

1.2.6 理化性質測定

1.2.6.1 持水力測定 按料液比1:25 g/mL 將TDF樣品與水加入離心管中，37 ℃攪拌1h 后于4000 r/min的條件下離心15 min，棄上清液并將離心管壁上多余水分吸干后稱量其重量。

式中：WHC 表示持水力，g/g；M表示吸水后樣品及離心管質量，g；M表示離心管質量，g；M表示樣品質量，g。

1.2.6.2 持油力測定 按TDF 樣品質量與油的體積1:25 的比例加入離心管中，37 ℃攪拌1 h 后于4000 r/min 的條件下離心15 min，棄上層油后用吸干管壁多余油后稱重。

式中：OHC 表示持油力，g/g；M表示吸油后樣品及離心管質量，g；M表示離心管質量，g；M表示樣品質量，g。

1.2.6.3 膨脹力測定 將0.40 g TDF 樣品加入10 mL量筒中并記錄干樣體積，在量筒中加入8 mL 蒸餾水并攪拌均勻，于室溫條件下靜置24 h，記錄膨脹后的體積。

式中：SC 表示持油力，mL/g；V表示膳食纖維干樣體積，mL；V表示膳食纖維膨脹后體積，mL；M 表示樣品質量，g。

1.2.6.4 膽固醇吸附率測定 參照文獻[14]中的方法繪制膽固醇標準曲線。取市售雞蛋蛋黃加九倍體積去離子水后混合均勻，在離心管中加入50 mg 的TDF 及15 mL 蛋黃液，使用NaOH 和HCl 溶液將pH分別調至2.0 及7.0 來分別模擬胃和腸道環境，37 ℃攪拌2 h 后 4000 r/min 離心20 min，取上清液檢測并計算膽固醇含量，實驗做空白對照，按式（6）計算膽固醇吸附率。

式中：A表示膳食纖維吸附后膽固醇含量，mg；A表示膳食纖維吸附前膽固醇含量，mg；M 表示樣品質量，g。

1.2.6.5 葡萄糖吸附率測定 用DNS 法制備葡萄糖標準曲線，配制濃度為0.1 mmol/mL，pH 為7 的葡萄糖溶液，取0.10 g TDF 樣品加入10 mL 葡萄糖溶液中，37 ℃攪拌6 h，此后在4000 r/min 的條件下離心20 min，取上清液按標準曲線的方法檢測并計算葡萄糖溶液濃度，實驗做空白對照，按式（7）計算葡萄糖吸附率。

式中：A表示膳食纖維吸附后葡萄糖含量，mg；A表示膳食纖維吸附前葡萄糖含量，mg；M 表示樣品質量，g。

1.2.7 結構表征分析

1.2.7.1 紅外光譜（FT-IR）的測定 參考文獻[15]的方法略作修改，按干燥膳食纖維樣品與溴化鉀粉末1:100 的比例充分研磨并進行紅外光譜掃描，掃描波數400～4000 cm，掃描分辨率4 cm。

1.2.7.2 顯微結構分析 將膳食纖維粉處理后進行電鏡觀察，放大100、500 與1000 倍，拍照得到電鏡圖并進行分析。

1.2.7.3 粒徑測定 參考文獻[17]的方法略作修改，將樣品與水 1:20 使用超聲混勻，并用激光粒度儀對油茶粕膳食纖維的粒徑分布情況進行測定。

1.3 數據處理

所有實驗數據均平行測定3 次，基礎數據采用Excel 處理，響應面試驗由Design Expert8.0.6 進行設計分析，作圖采用Origin2018 軟件。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 纖維素酶添加量對SDF 得率的影響 由圖1可知，隨酶添加量的增加，SDF 的得率呈先增加后減小的趨勢，在酶添加量為0.2%時所得的SDF 達到最高。這是因為纖維素酶可將IDF 水解，因此部分IDF 轉化為SDF，SDF 得率增加，而酶用量過高時酶達到飽和，SDF 可能會被水解為小分子多糖、低聚糖等物質，這些物質不能被乙醇沉淀，從而引起SDF 的得率下降。因此確定0.2%為纖維素酶最佳添加量。

圖1 酶添加量對SDF 得率的影響Fig.1 Effect of enzyme addition amount on SDF yield

2.1.2 超聲時間對SDF 得率的影響 由圖2 可知，超聲時間在10～30 min 期間SDF 得率隨時間的增加而增大，超過30 min 后SDF 的得率開始迅速降低。這是因為超聲波的機械震動可加快其內部分子運動，提高了酶解效率，當時間超過30 min 后膳食纖維的結構可能遭到破壞，纖維素酶活性也隨著時間的增加及超聲導致的升溫而降低，故確定超聲酶解的最適時間為30 min。

圖2 超聲時間對SDF 得率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on SDF yield

2.1.3 超聲功率對SDF 得率的影響 由圖3 可知，超聲功率在150～210 W 范圍內，SDF 的得率隨超聲功率的增大而增大，到210 W 時達到最高值，此后開始有所下降。超聲可能會破壞細胞結構，隨著超聲功率增大，超聲波的機械效應與空化效應也會增強，IDF 中的化學鍵斷裂形成小分子物質，超聲功率過大時可能會引起纖維素酶活性的降低，破壞膳食纖維結構；超聲導致升溫，超聲功率大，溫度上升快，因此SDF 得率迅速下降。綜合考慮最適超聲功率為210 W。

圖3 超聲功率對SDF 得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on SDF yield

2.1.4 料液比對SDF 得率的影響 由圖4 可知，當料液比為1:25 g/mL 時SDF 得率達到最高值，當溶劑較少時，原料在溶液中得率較高，酶與底物不能充分接觸，SDF 溶出受限。當溶劑升高，原料也在溶液中充分擴散，酶與底物接觸充分，因此SDF 得率會有所升高。當溶劑過多時，酶濃度降低，此時SDF 的得率也會降低。因此可得出最佳料液比為1:25 g/mL。

圖4 料液比對SDF 得率的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on SDF yield

2.2 響應面優化試驗

在單因素實驗結果的基礎上進行響應面優化試驗，以SDF 得率（Y）為響應值，考察酶添加量（A）、超聲酶解時間（B）、超聲功率（C）、料液比（D）4 個因素對SDF 得率的影響，試驗方案及結果如表2 所示。

表2 中心組合試驗設計方案及結果Table 2 Central combination experiment design scheme and results

2.2.1 響應面試驗設計及結果 由表3 可知，該回歸模型<0.0001，說明此模型回歸效果達到極顯著，失擬項=0.1093>0.05 不顯著，=0.9505 線性關系較好，能夠反應酶添加量、超聲酶解時間、超聲功率、料液比對SDF 得率的影響，可用于確定其最佳工藝。其回歸方程為：

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Results of variance analysis of regression model

Y=12.28+0.24A+0.33B+0.76C?0.66D+0.61AB?0.23AC+0.54AD?0.11BC+0.22BD+0.80CD?0.66A?1.08B?1.48C?0.75D

經軟件分析可得三維響應面及等高線圖（圖5～圖7）。圖5～圖6 說明AD等高線比較圓潤，響應面坡度平緩，C（超聲功率）與D（料液比）之間交互作用對響應值的影響比A（酶添加量）與D（料液比）之間的交互作用顯著，A（酶添加量）與B（超聲時間）的交互作用對響應值的影響（<0.01）與A（酶添加量）與D（料液比）的交互作用（<0.05）相比更為顯著。圖7可根據等高線及響應面坡度可直觀得出C（超聲功率）與D（料液比）之間的交互作用對響應值的影響最為顯著（<0.01）。

圖5 酶添加量與超聲時間交互作用Fig.5 Interaction between the amount of enzyme and ultrasonic time

圖6 酶添加量與料液比交互作用Fig.6 Interaction between the amount of enzyme and solid-liquid ratio

圖7 超聲功率與料液比交互作用Fig.7 Interaction between ultrasonic power and solid-liquid ratio

2.2.2 最佳工藝參數及驗證 通過Design Expert8.0.6軟件進行實驗分析，得出最佳工藝條件為酶添加量0.21%，超聲時間31.42 min，超聲功率214.86 W，料液比1:23.49 g/mL，此時SDF 得率可達12.4732%。與實際結合將工藝條件修改為酶添加量0.2%，超聲酶解時間31 min，超聲功率210 W，料液比1:23 g/mL，在此條件下做3 次平行實驗，得到SDF 得率為12.43%±0.14%，此結果與理論值相近，說明基于響應面優化所得到的模型參數真實可靠。當按最佳工藝條件進行實驗時，IDF 得率為68.39%±0.27%。

2.3 理化性質分析

由1.2.6 的方法制備標準曲線，得到膽固醇標準曲線y=4.3555x+0.0843，=0.9991，葡萄糖標準曲線y=38.614x+0.2315，=0.9993。由表4 所示，油茶粕TDF 的持水力為4.36 g/g，持油力為3.67 g/g，膨脹力為6.83 mL/g，由于TDF 含有較多親水集團，可以與水分子結合，從而膨脹，可以有效減少腸炎及便秘的風險。TDF 在pH 為2 的條件下膽固醇吸附率為5.79 mg/g，小于pH 為7 時的膽固醇吸附率，這與小米麩皮所得到的結論相似，而滇橄欖果渣總膳食纖維的膽固醇吸附率pH 為2 時更高，這可能是由于原料不同，性質有所不同。油茶粕 TDF 的葡萄糖吸附率為11.49 mg/g，TDF 可通過吸附膽固醇、葡萄糖等物質來預防高血糖、高血脂等疾病。

表4 油茶粕TDF 理化性質Table 4 Physicochemical properties of TDF of Camellia oleifera meal

2.4 結構表征分析

2.4.1 紅外光譜（FT-IR）的測定 TDF 的紅外分析如圖8 所示，TDF 在3458 cm處有圓潤且寬的吸收峰，此處為O-H 伸縮振動峰，此處有處于締合狀態的氫鍵，可推測油茶粕TDF 含有纖維素與半纖維素。在2928 cm左右處的吸收峰證明有C-H基團，證明有糖類物質的存在。1615 cm處的吸收峰是由木質素中芳香苯基團產生的。1354 cm處的吸收峰證明有C-H 的變角振動峰的存在，1000～1200 cm處有糖類C-O 吸收峰的存在，這些吸收峰表明油茶粕TDF 符合膳食纖維的結構特征。

圖8 油茶粕TDF 紅外光譜Fig.8 TDF infrared spectrum of Camellia oleifera meal

2.4.2 顯微結構分析 采用電子掃描顯微鏡觀察TDF 的表面特征，如圖9 所示，膳食纖維的孔隙特征與有效表面特征有關，當放大倍數為100 倍時，TDF具有空腔且形狀不規則的塊狀結構，顆粒大小不均勻，表面有孔狀結構且凹凸不平。當放大倍數為500、1000 倍時可觀察到疏松的孔狀結構，有蜂巢型的多孔網狀結構特征，表面粗糙且凹凸不平，空間結構比較均勻，由于蜂巢狀的小孔使得TDF 表面積更大，造就了良好的親水性，因此有著更好的持水力和持油力。

圖9 油茶粕TDF 掃描電鏡Fig.9 TDF scanning electron microscopy of Camellia oleifera meal

2.4.3 粒徑測定 油茶粕TDF 的粒度分布如圖10所示，其平均粒徑為50.699 nm，由圖可知膳食纖維呈現單峰分布的狀態，近似正態分布，且峰波較窄，膳食纖維顆粒尺寸比較均勻。這與李鵬沖等提取的可溶性膳食纖維結果相似，均為單峰且近似正態分布。

圖10 油茶粕TDF 粒徑分布Fig.10 Particle size distribution of camellia oleifera mealdietary fiber

3 結論

以油茶粕為原料進行前處理后以SDF 的得率為指標進行工藝條件優化，確定最佳工藝條件為酶添加量0.2%、超聲酶解時間31 min、超聲功率210 W、料液比1:23 g/mL，此時SDF 得率為12.43%，IDF得率為68.39%。此工藝條件用酶量少，提取時間短，減少了經濟與時間成本。

對TDF 的理化性質進行測定，實驗表明油茶粕TDF 的持水力為4.36 g/g、持油力為3.67 g/g、膨脹力為6.83 mL/g、膽固醇吸附率在pH2 時為5.79 mg/g，pH7 時為8.38 mg/g，葡萄糖吸附率為11.49 mg/g。油茶粕TDF 理化性質良好。在不同條件下膽固醇吸附率不同，油茶粕TDF 在腸道環境下更容易吸附膽固醇。通過對TDF 的結構表征研究可知，油茶粕TDF 具有蜂巢型多孔網狀結構且顆粒均勻，含有糖類、木質素、纖維素及半纖維素，結構表征結果表明油茶粕TDF 具有膳食纖維的結構特征。

本實驗采用超聲輔助酶法對油茶粕SDF 進行工藝優化，并對油茶粕TDF 進行了理化性質及結構表征分析，為今后油茶粕膳食纖維的提取提供理論基礎，并對油茶粕的有效開發利用提供了理論參考。在今后的實驗中可以對多種提取方法對比，獲得更加優質的油茶粕膳食纖維。