高壓酶解法提取硫酸皮膚素工藝優(yōu)化及其抗氧化活性分析

王鈺堡，王語(yǔ)聰，謝智鑫，張俊杰，李春雨，謝宜桐，王宇晴，陳曉偉，劉丹怡，韓建春,

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030；2.黑龍江省綠色食品科學(xué)研究院，黑龍江哈爾濱 150028）

硫酸皮膚素（Dermatan sulfate，DS），又稱硫酸膚質(zhì)、硫酸軟骨素B，是一種線狀陰離子多糖，具有抗凝血、抗血栓、抗氧化、抗炎和抗腫瘤等生物活性，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)中。傳統(tǒng)方法常以動(dòng)物皮層，特別是水生生物（如鮟鱇魚皮）為提取原料，目前工業(yè)上主要從豬皮和豬小腸中提取。

DS 以蛋白聚糖形式存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞基質(zhì)和結(jié)締組織中，在生物體內(nèi)通過(guò)共價(jià)鍵與蛋白質(zhì)結(jié)合，因此需選取適當(dāng)?shù)拿盖袛喙矁r(jià)鍵以達(dá)成提取DS 目的。常使用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和Protamex復(fù)合蛋白酶等酶進(jìn)行單酶或雙酶復(fù)合水解，但均存在效率不高的問題，因此采用超高壓技術(shù)通過(guò)施加一定壓力使蛋白適當(dāng)變性能夠有效改善酶解效率。朱文慧等以鱈魚骨為原料采用超高壓耦合酶解工藝使酶解液氨基酸態(tài)氮含量提升1.68 倍。原料酶解后仍含有較多雜質(zhì)，離子交換樹脂法能有效對(duì)DS 分離純化。大孔樹脂是一種兼具篩選和吸附能力的高分子材料，具備操作簡(jiǎn)便、不改變多糖原有結(jié)構(gòu)和生物活性等優(yōu)點(diǎn)，是理想DS 吸附材料。付瑩采用D208 大孔吸附樹脂以從雞軟骨中提取到純度達(dá)72.03%的DS。

在豬腸粘膜提取肝素過(guò)程中，吸附透過(guò)液常作為廢棄物被丟棄，經(jīng)檢測(cè)每毫升透過(guò)液中仍含有較高濃度DS（4.62 ng/mL），從中提取純化DS 既可以提高原料的利用率、降低污染，亦可增加產(chǎn)業(yè)價(jià)值。本文以豬腸粘膜提取肝素透過(guò)棄液為原料，采用高壓酶解結(jié)合樹脂吸附技術(shù)，通過(guò)單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化酶解工藝和樹脂吸附純化條件，對(duì)DS 與抗壞血酸（V）進(jìn)行抗氧化活性比較，為DS 的提取及進(jìn)一步研究應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豬腸粘膜肝素提取透過(guò)液 江西時(shí)通實(shí)業(yè)有限公司；醋酸纖維素薄膜（8 cm×12 cm）騰輝化玻儀器；硫酸皮膚素標(biāo)準(zhǔn)品 北京普天同創(chuàng)生物科技公司；堿性蛋白酶（200 U/mg）、Protamex 復(fù)合蛋白酶（100 U/mg）、木瓜蛋白酶（100 U/mg）、透析袋（1000 D）北京索萊寶生物科技有限公司；D312 樹脂、D208樹脂、D958 樹脂 新鄉(xiāng)賽普瑞特有限公司；ELISA硫酸皮膚素酶聯(lián)免疫試劑盒 上海梵態(tài)生物科技有限公司；無(wú)水乙醇、過(guò)氧化氫、1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH 自由基）、醋酸、抗壞血酸、甲苯胺藍(lán) 分析純，Sigma 公司。

HL-300B 恒流泵 蘭格恒流泵有限公司；HZSH 水浴振蕩器 哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；層析柱（直連通用B 型，70 mL）無(wú)錫天演生物；XQ-FD-10N 凍干機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；TG-600 酶標(biāo)儀 Thermo Fisher 科技公司；R-100 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士Buchi 有限公司；Power Pac HC 電泳儀 Bio-rad 生命醫(yī)學(xué)有限公司；L-539 超微分子壓縮儀 沈陽(yáng)人和機(jī)電工程設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料處理 豬腸粘膜肝素提取透過(guò)液經(jīng)凍干、粉碎，過(guò)60 目篩后得到凍干粉，?20 ℃保存。

1.2.2 蛋白酶的篩選 將堿性蛋白酶、Protamex 復(fù)合蛋白酶、木瓜蛋白酶在最適pH 和溫度（表1）下向10 g 樣品中以18000 U/g 酶底物比加酶水解8 h，結(jié)束后離心（8000 r/min，15 min）取上清以DS 濃度為標(biāo)準(zhǔn)選擇最適酶。DS 濃度用試劑盒測(cè)定，DS 抗體在經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品、樣品、檢測(cè)抗體溫育洗滌后，使底物顯藍(lán)色，再經(jīng)酸的作用轉(zhuǎn)化黃色。顏色深淺與樣品中DS 濃度呈正相關(guān)，450 nm 測(cè)定吸光度并計(jì)算濃度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖濃度，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.1613x+0.0259，y 代表吸光度值，x 代表DS 濃度（ng/mL），R=0.9977。

表1 不同蛋白酶最適pH 和溫度Table 1 Optimal pH and temperature for different proteases

1.2.3 高壓酶解工藝的單因素實(shí)驗(yàn) 參考徐俊濤的方法略作改動(dòng)，進(jìn)行溫度、時(shí)間、pH 和壓力單因素實(shí)驗(yàn)。

1.2.3.1 酶解時(shí)間的選擇 以酶解液DS 濃度為指標(biāo)，酶解溫度45 ℃，pH9.0，酶添加量18000 U/g，壓力100 MPa 為基本條件，探究不同時(shí)間（1、2、3、4、5、6、7、8、9 h）條件下酶解效果。

1.2.3.2 酶解溫度的選擇 以酶解液DS 濃度為指標(biāo)，時(shí)間7 h，pH9.0，酶添加量18000 U/g，壓力100 MPa為基本條件，設(shè)置不同溫度（45、50、55、60 ℃）條件，探究酶解效果。

1.2.3.3 pH 的選擇 以酶解液DS 濃度為指標(biāo)，時(shí)間7 h，溫度45 ℃，酶添加量18000 U/g，壓力100 MPa為基本條件，探究不同pH（7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5）條件下酶解效果。

1.2.3.4 酶解壓力的選擇 以酶解液DS 濃度為指標(biāo)，時(shí)間7 h，溫度45 ℃，pH9.0，酶添加量18000 U/g為基本條件，使用超微分子壓縮儀設(shè)置不同壓力（0、50、100、150、200 MPa）條件，探究酶解效果。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn) 綜合單因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇軟件Design-Expert 利用Box-Behnken 法設(shè)計(jì)四因素三水平實(shí)驗(yàn)，因素水平見表2。響應(yīng)面結(jié)束后以所得最佳條件進(jìn)行酶解，升溫至85 ℃滅活后，過(guò)100 目篩除雜后4000 r/min 離心20 min，取上清即粗多糖溶液。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素及水平Table 2 Response surface design factors and levels

1.2.5 大孔樹脂篩選 樹脂預(yù)處理：以去離子水充分浸泡樹脂，依次用4% HCl、4% NaOH 溶液交替攪拌3 h，去離子水沖洗至中性后浸泡4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

稱取15 g 經(jīng)預(yù)處理的D208、D312、D958 樹脂，分別裝入具塞三角瓶中，每瓶加入125 mL 粗多糖溶液，置于55 ℃恒溫振蕩器中100 r/min 振蕩吸附過(guò)夜，以吸附量為標(biāo)準(zhǔn)選擇最佳樹脂。根據(jù)式（1）計(jì)算DS 吸附量。

注：t：吸附前溶液DS 濃度（ng/mL）；t：吸附后溶液DS 濃度（ng/mL）；V：溶液體積（mL）。

1.2.6 樹脂吸附純化工藝優(yōu)化

1.2.6.1 吸附流速優(yōu)化 稱取30 g 經(jīng)預(yù)處理樹脂以濕法裝柱，去離子水平衡。粗多糖溶液在55 ℃條件下分別以1.0、1.5、2.0、2.5 BV/h 上樣，20 mL/管取樣并測(cè)定DS 濃度，吸附量達(dá)到飽和值時(shí)停止吸附，繪制吸附曲線并確定最優(yōu)流速。

1.2.6.2 洗脫流速優(yōu)化 樹脂處理同1.2.6.1，粗多糖溶液以1.2.6.1 所得最優(yōu)流速上樣至樹脂飽和，用4% NaOH 分別以1.0、1.5、2.0、2.5 BV/h 進(jìn)行洗脫，20 mL/管取樣并測(cè)定DS 濃度，當(dāng)濃度穩(wěn)定后停止洗脫，繪制洗脫曲線。

1.2.6.3 透析脫鹽 參考薛發(fā)剛的方法，洗脫液透析4 d，每隔6 h 換一次水，透析后加入3 倍體積的無(wú)水乙醇，4 ℃過(guò)夜后離心，將沉淀凍干后得到DS 稱重。

1.2.7 抗氧化活性測(cè)定

1.2.7.1 DPPH 自由基清除能力測(cè)定 試驗(yàn)參考Nevin 等方法。將DS 配制成濃度分別為0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mg/mL 的溶液，依次加入DPPH 試劑，混勻后室溫避光反應(yīng)30 min，于517 nm 處測(cè)得OD 值為A；以蒸餾水代替樣品測(cè)得OD 值為A；無(wú)水乙醇代替DPPH 測(cè)得OD 值為A。根據(jù)式（2）計(jì)算DPPH 清除率。

1.2.7.2 羥基自由基清除率測(cè)定 參考李珊珊等方法，將DS 配制成濃度為0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mg/mL 的溶液，分別加入6 mmol/L FeSO溶液、10%雙氧水，搖勻后加入6 mmol/L 水楊酸乙醇，37 ℃反應(yīng)30 min，于510 nm 測(cè)定OD 值為A；以蒸餾水代替雙氧水OD 值為A；以蒸餾水代替樣品OD 值為A。根據(jù)式（3）計(jì)算羥基自由基清除率。

1.2.7.3 還原力測(cè)定 參考Oyaizu方法，將DS 配制成濃度分別為0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mg/mL的溶液。取樣品溶液0.5 mL 加入磷酸緩沖液0.5 mL及KFe（CN）2.5 mL 混勻，50 ℃水浴20 min，加入0.5 mL 三氯乙酸，混勻后4000 r/min離心20 min取上清，加入蒸餾水和0.1% FeCl溶液，靜置10 min于700 nm 測(cè)OD 值為A；以蒸餾水代替上清OD值為A，根據(jù)式（4）計(jì)算還原力。

1.2.8 醋酸纖維素薄膜電泳分析 采用醋酸纖維薄膜電泳對(duì)得到DS 進(jìn)行分析，使用0.1 mol/L 醋酸鋇緩沖液，在100 V、4 mA 的條件下電泳3 h 后用0.1%甲苯胺藍(lán)溶液染色0.5 h，2%醋酸溶液脫色 0.5 h。

1.2.9 純度測(cè)定 DS 純度測(cè)定采用高效凝膠滲透色譜法。以DS 標(biāo)品為對(duì)照，色譜柱為Ultrahydrogel Linear（7.8 mm×300 mm），流動(dòng)相為超純水，柱溫30 ℃，流速1.2 mL/min，進(jìn)樣量20 μL。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)均平行重復(fù)三次，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用Origin 2019 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理擬合繪圖，SPSS 20 進(jìn)行顯著性分析，<0.05 和<0.01 分別指差異顯著及極顯著，響應(yīng)曲面試驗(yàn)用Design-Expert 軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)和結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

由表3 可知，堿性蛋白酶酶解后溶液中的DS 濃度顯著高于Protamex 復(fù)合蛋白酶和木瓜蛋白酶（<0.05），效果最佳，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用堿性蛋白酶。蛋白酶具有專一性，不同酶的酶切位點(diǎn)不同，對(duì)酶解效果具有重要影響，選擇合適作用位點(diǎn)的酶進(jìn)行酶解至關(guān)重要。

表3 三種酶酶解效果的影響Table 3 Effects of different enzymes on enzymatic hydrolysis

2.2 酶解條件實(shí)驗(yàn)

由圖1a 可知，溶液DS 濃度在1～6 h 時(shí)平緩上升，7～8 h 之間顯著（<0.05）上升，8 h 后濃度趨于穩(wěn)定。可能是超高壓酶解時(shí)，機(jī)器封閉，原料自然沉積底部接觸面積較小導(dǎo)致前期酶解效率不高，故選擇8 h 為響應(yīng)面0 水平。

由圖1b 可知，溶液中DS 濃度隨溫度升高先上升后下降，55 ℃時(shí)濃度達(dá)到最大值（7.61±0.31）ng/mL，當(dāng)溫度繼續(xù)升高，可能影響了蛋白酶活性導(dǎo)致水解能力下降，DS 濃度反而下降。故選擇55 ℃為響應(yīng)面0 水平。

由圖1c 可知，溶液中DS 濃度隨pH 升高逐漸增加，pH9.0 時(shí)達(dá)到最大值，隨后呈下降趨勢(shì)，原因可能是過(guò)酸或過(guò)堿條件導(dǎo)致酶催化能力降低。故選擇pH9.0 為響應(yīng)面0 水平。

由圖1d 可知，壓力從0.1～200 MPa 的過(guò)程中，DS 濃度先增后減，在150 MPa 時(shí)濃度最高，為（8.17±0.23）ng/mL，說(shuō)明適度的壓力可以激活酶活力中心。故選擇150 MPa 為響應(yīng)面0 水平。

圖1 不同因素對(duì)酶解效果的影響Fig.1 Influence of different factors on the effect of enzymolysis

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表4 所示。對(duì)結(jié)果進(jìn)行方差分析，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到響應(yīng)曲面回歸方程如下：

表4 響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Design and experimental results of response surface methodology

Y=12.71+0.6233A?0.9892B+1.01C?0.8242D?0.1AB+0.34AC+0.045AD?0.795BC?0.7575BD?0.34CD?1.69A?3.69B?1.87C?1.31D

如表5 可見：該模型整體（<0.0001）極顯著，失擬項(xiàng)（=0.1589>0.05）不顯著，說(shuō)明模型可以真實(shí)反應(yīng)試驗(yàn)，殘差來(lái)源于隨機(jī)誤差。根據(jù)回歸方程均方可知，各因素對(duì)響應(yīng)值的影響力排序?yàn)椋好附鈺r(shí)間（C）>pH（B）>壓力（D）>酶解溫度（A）。復(fù)相關(guān)系數(shù)R=0.90，表明響應(yīng)值（DS 濃度）變化有90%來(lái)自于試驗(yàn)因素（溫度、pH、時(shí)間、壓力），可以較好解釋各因素與響應(yīng)值之間關(guān)系。因此，該模型擬合度良好，利用該回歸方程可以對(duì)高壓酶解效果進(jìn)行分析預(yù)測(cè)。

表5 方差分析結(jié)果Table 5 ANOVA results

圖2 可直觀表示出當(dāng)某因素被固定為中心點(diǎn)水平時(shí)，其他因素交互作用對(duì)響應(yīng)值影響，曲面彎曲程度越大，因素交互作用越強(qiáng)，因素之間相關(guān)影響程度也就越大。

圖2 模型中顯著相關(guān)因素交互響應(yīng)面圖Fig.2 Interaction response surface plot of significant correlation factors in the model

2.3.2 工藝優(yōu)化與結(jié)果驗(yàn)證 結(jié)合響應(yīng)面進(jìn)行優(yōu)化分析，以響應(yīng)值最大為評(píng)價(jià)指標(biāo)，得到最佳工藝條件為溫度56.1℃，pH8.9，時(shí)間8.35 h，壓力134.3 MPa，在此條件下DS 濃度預(yù)測(cè)值為13.15 ng/mL。考慮實(shí)際可行性，調(diào)整工藝條件為溫度56 ℃，pH9.0，時(shí)間8.4 h，壓力135 MPa。經(jīng)平行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，DS 濃度實(shí)際值為13.05 ng/mL，誤差為0.1 ng/mL，與預(yù)測(cè)值接近，說(shuō)明本模型具有可行性。

2.4 大孔樹脂篩選

表6 對(duì)比三種不同型號(hào)樹脂吸附前后溶液中DS 濃度變化，D312 樹脂吸附效果顯著高于其余兩種樹脂（<0.05）。樹脂的吸附性能取決于樹脂功能基與空間結(jié)構(gòu)，一般非極性化合物易被非極性樹脂吸附，極性樹脂可以吸附極性物質(zhì)。DS 作為具有一定極性的聚陰離子化合物，陰離子交換樹脂D312 是其純化最佳樹脂。本實(shí)驗(yàn)選用D312 樹脂進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表6 樹脂靜態(tài)吸附結(jié)果Table 6 Result of resin static adsorption

2.5 動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

2.5.1 上樣流速優(yōu)化 圖3 為D312 樹脂在不同上樣流速下穿透液中DS 濃度變化曲線。隨著體積的增加，不同流速的DS 濃度均升高，表明樹脂的吸附能力下降。由圖可見，2.5 BV/h 相比于其他三種流速DS 濃度上升最快，于120 mL 最先到達(dá)平衡點(diǎn)，與橫坐標(biāo)所截面積最大，說(shuō)明穿透溶液中DS 濃度高；1.0 BV/h 流速最晚到達(dá)穩(wěn)定點(diǎn)，穿透溶液中DS 濃度低。原因是流速快，導(dǎo)致DS 與樹脂接觸不充分，吸附效果差；相反，流速越慢吸附效果越好，但時(shí)間成本高。考慮到吸附量與所需時(shí)間，1.5 BV/h與橫坐標(biāo)截面較2.0 BV/h 更小，即吸附量較大，效果更優(yōu)，故采用1.5 BV/h 流速進(jìn)行樹脂吸附。

圖3 不同上樣流速動(dòng)態(tài)吸附曲線Fig.3 Dynamic adsorption curves for different sample flow rates

2.5.2 洗脫流速優(yōu)化 圖4 為4% NaOH 洗脫時(shí)不同流速穿透液中DS 濃度變化曲線。解吸流速為2.0 和2.5 BV/h 時(shí)，于20 mL 時(shí)出現(xiàn)峰值，而后洗脫液中DS 濃度持續(xù)下降，100 mL 后趨于穩(wěn)定，但拖尾較長(zhǎng)；解析流速為1.0 和1.5 BV/h，峰值出現(xiàn)早，洗脫液中DS 濃度隨解析進(jìn)行持續(xù)下降，于120 和160 mL時(shí)趨于穩(wěn)定，無(wú)拖尾。這是因?yàn)榱魉龠^(guò)快，樹脂與洗脫液的接觸不充分，DS 還未被完全解吸下來(lái)，導(dǎo)致拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重，造成材料的浪費(fèi)；反之，流速過(guò)慢所需時(shí)間長(zhǎng)，不利于生產(chǎn)。綜合考慮時(shí)間成本，以1.5 BV/h洗脫流速最為合適。

圖4 不同流速洗脫液的動(dòng)態(tài)洗脫曲線Fig.4 Dynamic elution curves of eluents at different flow rates

2.6 抗氧化能力的測(cè)定

2.6.1 DPPH 自由基清除能力 由圖5 可知，在測(cè)定濃度范圍內(nèi)，DS 對(duì)DPPH 自由基清除能力隨濃度增長(zhǎng)而加強(qiáng)，呈濃度依賴性。在2.0 mg/mL 時(shí)DPPH自由基清除率為35.17%，當(dāng)濃度達(dá)2.4 mg/mL 時(shí)清除率為36.29%，DPPH 自由基清除率增加趨勢(shì)變緩，與陽(yáng)性對(duì)照V相比，清除能力可達(dá)V的43.5%。可見DS 具有一定的抑制DPPH 自由基能力。

圖5 DPPH 自由基清除率Fig.5 DPPH·scavenging activity

2.6.2 羥自由基清除能力 通過(guò)清除氧自由基中最活躍的·OH，從而減少有色物質(zhì)的生成，以510 nm處OD 值為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)定量樣品對(duì)·OH 的清除能力。圖6 表明，不同濃度DS 與V對(duì)羥自由基均具有較好抑制率，且隨濃度增加而增大。當(dāng)濃度在1.5、2.0 mg/mL 時(shí)，DS 的羥自由基清除率達(dá)63.7%、67.13%，均高于V，可見DS 具有抑制羥自由基的能力。

圖6 DS 對(duì)羥自由基的清除能力Fig.6 Hydroxy free radical scavenging activity of DS

2.6.3 還原力測(cè)定 抗氧化劑的還原力是通過(guò)自身氧化給出電子清除自由基實(shí)現(xiàn)，DS 還原力分析如圖7 所示，不同濃度DS 還原力不同，隨濃度升高還原力逐漸增加呈緩慢遞增趨勢(shì)，在DS 濃度由0.4 mg/mL 升至2.5 mg/mL 時(shí)，還原力由0.11 升至0.22，低濃度DS 還原力較低，隨濃度升高仍明顯弱于陽(yáng)性對(duì)照V，說(shuō)明其還原力較弱。

圖7 DS 的還原能力Fig.7 Reducing power of DS

2.7 醋酸纖維薄膜電泳結(jié)果

純化后得到DS 多糖，進(jìn)行醋酸纖維素薄膜電泳實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果如圖8 所示，樣品電泳后得到單一條帶，且兩者遷移距離和形狀類似，說(shuō)明純化后DS 多糖樣品與標(biāo)準(zhǔn)品組分接近，達(dá)到了電泳純，但無(wú)法測(cè)定具體純度。

圖8 DS 樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的醋酸纖維薄膜電泳結(jié)果Fig.8 Cellulose acetate membrane electrophoresis results of dermatan sulfate samples and standards

2.8 色譜分析

通過(guò)高效凝膠滲透色譜分析純化后DS 純度為73.32%，相較付瑩采用D218 樹脂提取純度提升1.29%。由圖9 可知，在時(shí)間為3.7 和5.725 min時(shí)出現(xiàn)雜質(zhì)峰，表明樣品中含有其他分子量物質(zhì)，這可能是硫酸軟骨素和透明質(zhì)酸鈉。

圖9 DS 高效液相色譜圖Fig.9 HPLC chromatogram of DS

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用高壓酶解結(jié)合樹脂吸附技術(shù)提取DS，通過(guò)單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化最佳酶解工藝和樹脂吸附條件，探討了抗氧化活性。結(jié)果表明：在溫度56 ℃，pH9.0，壓力135 MPa 處理8.4 h 最優(yōu)條件下，DS 濃度達(dá)到13.05 ng/mL；使用D312 樹脂以1.5 BV/h 流速上樣，4% NaOH 以1.5 BV/h 流速洗脫條件下得到DS 純度可達(dá)73.32%；此外抗氧化試驗(yàn)表明，DS 多糖還原力較弱，對(duì)DPPH 自由基、羥基自由基具有清除能力，具備一定抗氧化活性。高壓酶解結(jié)合樹脂吸附工藝不僅提高了酶解效果，還提升了純度。純化后DS 色譜存在雜質(zhì)峰，電泳方法不能鑒定，后續(xù)需進(jìn)一步探究高純度DS 純化方法和其他成分結(jié)構(gòu)鑒定方法，為DS 產(chǎn)品開發(fā)利用提供理論參考與數(shù)據(jù)支撐。