正丁醇處理對‘粉紅女士’蘋果貯藏期間揮發性物質的影響

田林平，張琪，李瑞，任小林

（西北農林科技大學園藝學院，陜西楊凌 712100）

蘋果（Borkh）因其脆甜多汁的口感以及豐富的維生素和礦物質深受大眾喜愛。一個綜合品質優良的蘋果不僅能夠提高消費者的食欲及購買欲，同時能夠增強其市場競爭力，提高果農的收益。蘋果果實品質不僅受質地、色澤、固酸比、成熟度和果形指數的影響，而且與其揮發性物質密切相關。現已有大量水果的揮發性物質被鑒定，其中草莓中鑒定出100 余種，葡萄中99 種，梨中300余種，香蕉中44 種，蘋果中350 多種。

水果果實中的揮發性物質包括：酯類、醇類、醛類、酮類、酸類、萜烯類、含硫化合物和酚類。蘋果果實揮發性物質以酯、醇、醛類物質為主，其中酯類物質是主要的呈香物質，如丁酸酯、丁酯、2-甲基丁酸酯、2-甲基丁酯、己酯、己酸酯等，此外，不同品種蘋果主要呈香物質不同，如‘蜜脆’蘋果以2-甲基-丁酸乙酯和丁酸乙酯為主；‘紅玉’蘋果以己醇、3-甲基丁醇為主；嘎啦系蘋果以乙酸己酯、乙酸丁酯、2-甲基乙酸丁酯為主；富士系蘋果以2-甲基乙酸丁酯和2-甲基丁酸乙酯為主。其中呈甜香的乙酸丁酯、呈蘋果香的2-甲基丁酸乙酯、2-甲基乙酸丁酯、丁酸乙酯對它們的香氣貢獻起了重要作用。

此外乙烯處理、1-MCP 處理、氣調貯藏、冷藏以及相關前體的添加均會影響蘋果果實揮發性物質的產生。蘋果果實中的揮發性酯類物質主要來自于脂肪酸代謝途徑和氨基酸代謝途徑，其中醇類物質和酰基-輔酶A 在醇酰基轉移酶的作用發生酯化反應生成酯是關鍵的一步。已有報道表明蘋果整果可以吸收外源醇，并將其轉化成相應的酯類物質，Harb用丁醇，己醇，戊醇作為香氣前體處理‘金冠’蘋果，在超低氧環境下貯藏6 個月，發現其乙酸己酯、乙酸丁酯、乙酸戊酯的含量顯著增加。Lee 等用正丁醇、2-甲基丁醇、正己醇處理‘富士’蘋果，發現乙酸丁酯、丁酸丁酯、丙酸丁酯、己酸丁酯、辛酸丁酯、2-甲基丁酸丁酯、2-甲基乙酸丁酯、乙酸己酯含量均顯著增加。丁醇作為蘋果中主要的揮發性醇類物質以及酯類合成的重要前體物質，已受到廣泛關注，本研究通過不同濃度的外源正丁醇處理‘粉紅女士’蘋果果實，分析其對蘋果果實貯藏期間內源揮發性酯類物質的影響，旨在為揮發性物質合成及代謝途徑的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

‘粉紅女士’蘋果 陜西省扶風縣天度鎮一商業果園；正丁醇 色譜級（濃度≥99.5%），Sigma-Aldrich公司；3-壬酮 HPLC 級（濃度≥99.7%），Alfa Aesar公司；乙醇 分析級（濃度≥99.7%），四川西隴科學有限公司；甲基叔丁基醚 色譜級（濃度≥99.9%），阿拉丁試劑有限公司。

7890B-5977B 型氣相色譜質譜聯用儀、色譜柱（HP-5MS）美國Agilent；SB25-12DTD 型超聲清洗機 浙江寧波新芝生物科技股份有限公司；D-37520 型離心機 美國Thermo Fisher 公司；氮吹儀杭州奧盛儀器有限公司；QT-1 渦旋儀 上海琪特分析儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 材料處理 本試驗所用材料‘粉紅女士’蘋果（Borkh‘Pink Lady’）果實于2017 年10 月30 日采自陜西省扶風縣天度鎮一管理良好的商業果園。挑選大小一致，著色均勻，成熟度一致，無機械損傷，無病蟲害的570 個果實，采收后立即運往西北農林科技大學采后生物學實驗室，室溫放置24 h 散去田間熱。根據先前的預實驗（處理濃度分別為25、50 和100 μL·L），確定本實驗的處理濃度為10 和25 μL·L。實驗分為3 組，對照組培養皿中僅放置濾紙，不添加任何溶劑，處理組培養皿中放入濾紙后分別添加3.6 和9 mL 的正丁醇（濃度分別為10 和25 μL·L）。將蘋果和裝有濾紙的培養皿放置于容量為360 L 的氣調箱內密閉熏蒸，熏蒸時間為24 h，溫度為20±0.5 ℃。處理結束后用聚氯乙烯（PVC）保鮮袋包裝后放入紙箱內室溫（溫度：20±0.5 ℃，相對濕度：85%～90%）貯藏42 d，每隔7 d 每組隨機挑選9 個果實取樣，每3 個果實為一個重復，于?80 ℃冰箱保存。

1.2.2 揮發性物質的提取 本試驗揮發性物質的提取采用有機溶劑萃取法，提取方法參考石金瑞等。用液氮研磨儀將從?80 ℃冰箱中取出的待測樣品研磨成粉末；稱取2 g 樣品于10 mL 離心管中，并加入3 mL 的蒸餾水，3 mL 的甲基叔丁基醚（Methyl tertbutyl ether，MTBE）和10 μL 的內標[V（3-壬酮）:V（甲醇）=5:30000]，渦旋儀充分混勻。將混勻后的樣品放入超聲清洗機中，20 ℃超聲萃取30 min，然后11000 r/min、4 ℃條件下離心15 min。吸取上清液1.5 mL，利用氮吹儀濃縮至500 μL，過濾后進行GC-MS 分析。

1.2.3 揮發性物質的定性定量分析 采用氣相色譜質譜聯用儀（GC-MS）進行揮發性物質分析。分析條件：a.升溫程序：起始溫度40 ℃保持3 min，然后以每分鐘5 ℃升溫至180 ℃，再以每分鐘8 ℃升溫至300 ℃，保持2 min；b.色譜條件：色譜柱為HP-5MS，進樣口溫度為230 ℃，進樣量為1 μL，不分流進樣，載氣：流速為1 mL/min 的氦氣（濃度99.999%）；c.質譜條件：電子轟擊離子源，電離能量70 eV，傳輸線和離子源溫度均為240 ℃；質量掃描m/z 33～380。

揮發性物質的定性分析是根據GC-MS 得到譜圖，利用Qualitative Analysis B.07.00 進行分析，結合標準品保留時間、質譜圖、保留指數RI 以及NIST庫比對確定。定量分析參照李瑞等的方法，由各標準品的校正因子（CF）計算得到各揮發性物質的含量，矯正因子計算過程如下：

式中：C是標準品濃度（μg/kg）；A是離子模式下標準品的峰面積；C是內標（3-壬酮）的濃度（μg/kg）；A是內標（3-壬酮）的峰面積。

被測物質濃度C的數值基于CF 的計算結果得來，具體計算過程如下：

式中：A是被測物質的峰面積；C是被測樣品的內標濃度（μg/kg）；A是被測樣品的內標面積。

1.3 數據處理

運用Excel 2010 軟件對所得數據進行統計分析；使用IBM SPSS Statistics 25 進行顯著性差異分析；采用R 軟件進行主成分分析并作圖；采用Origin 2021b 繪制柱形圖。

2 結果與分析

2.1 正丁醇處理對‘粉紅女士’蘋果揮發性物質種類和含量的影響

利用氣相色譜質譜聯用儀（GC-MS）分析對照、10 和25 μL·L正丁醇處理后‘粉紅女士’蘋果貯藏42 d 內揮發性物質種類和含量的變化。在貯藏第0 d 共檢測到25 種揮發性化合物（表1），包括酯類、醇類、醛類和其他類；其中酯類物質最豐富，包括乙酸丁酯、乙酸-2-甲基丁酯、丁酸丙酯、乙酸戊酯、丁酸丁酯、乙酸己酯、2-甲基丁酸丁酯、丙酸己酯、2-甲基丙酸己酯、己酸丁酯、丁酸己酯、2-甲基丁酸己酯、己酸己酯、辛酸丁酯以及辛酸己酯。隨著貯藏時間的增加，揮發性物質種類逐漸減少，在對照組以及兩種濃度的正丁醇處理組，第7、14、21、28、35、42 d 均分別檢測出25、24、24、22、20、20、20 種揮發性物質。此外，貯藏初期與貯藏末期相較，特有的物質有乙酸戊酯、丁酸丁酯、2-甲基-丙酸己酯、法尼醇和2-甲基丁酸。綜上可知，正丁醇處理不會影響‘粉紅女士’蘋果揮發性化合物的種類，但隨著貯藏時間的延長揮發性物質的種類逐漸減少。

表1 正丁醇處理對‘粉紅女士’蘋果貯藏期間揮發性物質的影響Table 1 Volatile substance content in ‘Pink Lady' apple treated with n-butanol

正丁醇處理能夠影響貯藏前期‘粉紅女士’蘋果揮發性物質的含量，在對照及兩種不同濃度的正丁醇處理后的整個貯藏過程中大部分揮發性物質呈現先升高后降低最后保持基本穩定的趨勢。正丁醇處理組貯藏前期與對照相比，其揮發性物質含量上升顯著（<0.05）（圖1），尤其是25 μL·L處理組，此外，含量變化較大的物質有乙酸丁酯、丁酸丙酯、丁酸丁酯、2-甲基丁酸丁酯、己酸丁酯。在貯藏第7 d 時，25 μL·L處理組的乙酸丁酯含量為1836.37 μg/kg，是10 μL·L處理組的2 倍，對照組的3.6 倍；25 μL·L處理組的丁酸丁酯含量為703.12 μg/kg，是10 μL·L處理組的2.39 倍，對照組的3 倍，在貯藏14 d 時，25 μL·L處理組的丁酸丙酯含量為566.61 μg/kg，是10 μL·L處理組的1.5 倍，是對照組的1.6 倍；25 μL·L處理組的丁酸丁酯含量為219.67 μg/kg，是10 μL·L處理組的1.7 倍，處理組的1.5 倍。隨著貯藏時間的延長，丁酯和丁酸酯類物質含量逐漸趨于穩定，可能是正丁醇的添加使得底物提前消耗完畢果實達到穩態，這與Harb 的研究一致，即醇類的添加僅影響了貯藏前期揮發性物質的產生。乙酸-2 甲基丁酯呈現出與其他酯類物質不同的情況，在貯藏前期其處理組揮發性物質含量顯著（<0.05）低于對照組，并隨著貯藏時間的延長不斷降低，直至貯藏后期二者無顯著差異（>0.05）。乙酸-2-甲基丁酯特異的表現，可能是由于前期2-甲基丁醇和丁醇競爭乙酰CoA，而乙酰CoA 優先與丁醇生成乙酸丁酯，當丁醇被消耗完畢，再與2-甲基丁醇結合生成2-甲基乙酸丁酯，在Harb的研究中，在‘金冠’蘋果中添加丁醇，并在超低氧條件下貯藏，乙酸己酯含量顯著降低，而乙酸丁酯的合成增加，是因為乙酸丁酯的合成消耗了乙酸己酯的合成前體乙酸。貯藏前期揮發性物質總和為78662.89～131940.18 μg/kg，貯藏后期僅為51779.72～110114.45 μg/kg，比貯藏前期揮發性物質總量減少，并且25 μL·L處理組揮發性物質含量下降幅度大于10 μL·L處理組和對照組。綜上所述，25 μL·L正丁醇的處理在貯藏前期對促進香氣釋放的效果要明顯優于10 μL·L的正丁醇處理，并且在相同處理條件下隨著貯藏時間的增加，揮發性物質的種類和含量大都不斷減少，尤其是25 μL·L處理組。

圖1 不同濃度正丁醇處理對‘粉紅女士’貯藏期酯類物質變化的影響Fig.1 Effects of different concentrations of n-butanol on changes of esters in ‘Pink Lady’ during storage

2.2 主成分分析

主成分分析是一種考察多個變量間相關性一種多元統計方法，研究如何通過少數幾個主成分來揭示多個變量間的內部結構。為探究不同貯藏時間及正丁醇處理對‘粉紅女士’蘋果揮發性物質的影響，基于各樣本香氣物質的含量，進行了主成分分析，并制作得分圖和載荷圖（圖2）。結果顯示，當提取兩個主成分時可解釋原始變量總方差的63.6%，其中第一主成分（PC1）解釋了總方差的48.7%，是區分不同貯藏時間以及不同處理揮發性物質差異的主要成分，第二主成分（PC2）解釋了總方差的14.9%。根據得分圖（圖2A）可知，不同貯藏時期的‘粉紅女士’蘋果樣本在PC1 方向被顯著區分（三個處理貯藏0、7、14 d均位于PC1 的正半軸），說明引起不同貯藏時間蘋果香氣差異因素主要是PC1。在貯藏前期（0、7、14 d），同一貯藏時期不同處理組間的樣本在PC2 方向被顯著區分（對照組位于PC2 的正半軸，10 和25 μL·L處理組位于PC2 的負半軸）；而在貯藏后期，對照與兩種處理組聚在一起。結合載荷圖（圖2B）結果可知每種揮發性物質的貢獻率以及揮發性化合物和各樣品之間的關系。在三個處理的整個貯藏期，使第0、7、14 以及21 d 的對照組位于PC1 正半軸的物質主要有：乙酸-2-甲基丁酯、乙酸戊酯、丙酸己酯、2-甲基丁醇、E-2-己烯醛、壬醛、2-甲基丁酸，使得第28、35、42 d 位于PC1 負半軸的主要物質有：丁酸丙酯、己酸己酯、辛酸己酯、己醛。在貯藏前期（0、7、14 d），導致對照組位于PC2 的正半軸的揮發性物質主要為2-甲基丙酸己酯、2-甲基丁酸己酯、2-甲基丁酸乙酯、3-己烯醛、壬醛、法尼醇，其中法尼醇僅在貯藏0 d 時被檢測到；導致其他兩個處理組位于PC2 的負半軸的揮發性物質主要為乙酸丁酯、丁酸丁酯、乙酸己酯、2-甲基丁酸丁酯。

圖2 正丁醇處理后不同貯藏時間25 種香氣的主成分分析Fig.2 Principal component analysis of 25 fragrances treated with n-butanol during storage

不同貯藏時期‘粉紅女士’蘋果果實香氣構成存在很大差異，正丁醇處理可能是通過影響丁酯的含量從而影響果實的香氣構成。不同處理和貯藏方式對果實揮發性物質的影響已有報道，乙烯和低溫處理富士蘋果后與對照相比，揮發性物質種類先升后降，其中差異物質包括2-甲基-丁酸酯、己酸丙酯、己酸-2-甲基丁酯等。1-MCP 處理鴨梨果實后在不同程度上降低了其果皮果肉揮發性物質的含量和種類，其差異物質在主要有E-2-己烯醛、己醛、乙酸己酯等。張敏將富士蘋果和寒富蘋果分別貯藏10 個月和12 個月，發現隨著貯藏時間的增加，其貨架期揮發性化合物不斷減少，尤其是寒富蘋果的酯類物質。

2.3 正丁醇處理對‘粉紅女士’蘋果氣味活性值的影響

氣味活性值（odor activity value，OAV）是鑒別氣味活性化合物的一種常用的方法，由物質的含量與其香氣閾值的比值決定；當OAV≥1 時可認為該物質對整體香氣有貢獻作用，并且這個值越大，對整體香氣的貢獻越大。‘粉紅女士’蘋果各處理整個貯藏期間的OAV 見表2，共檢測出19 種氣味活性化合物，主要是酯類、醛類物質，如己醛、（E）-2 己烯醛、壬醛，乙酸己酯、2-甲基丙酸己酯、2-甲基丁酸己酯、2-甲基丁酸乙酯、己酸己酯、辛酸己酯。在包括不同處理的整個貯藏時期，乙酸己酯的氣味活性值占到了全部物質的40%～53%，是‘粉紅女士’蘋果主要的呈香物質。包括乙酸己酯在內的許多C6 酯類已被證實對許多蘋果品種（如‘McIntosh’和‘Cortland’）的香氣有重要作用。果實的香氣不僅僅依靠某一種，或某幾種芳香活性化合物，還有化合物之間相互作用的影響。

表2 ‘粉紅女士’蘋果貯藏期間OAV 活性值Table 2 OAV activity of 'Pink Lady' apple during storage

正丁醇的添加明顯增加了貯藏前期乙酸丁酯、丁酸丁酯、2-甲基丁酸丁酯、己酸丁酯的OAV，并且從對照組到10 以及25 μL·L正丁醇處理組的OAV是遞增的。在整個貯藏期間，大部分醛類隨著貯藏時間的增加，OAV 不斷減小，而酯類物質隨著貯藏時間的增加，OAV 不斷增加，說明在貯藏初期醛類是主要的呈香物質，隨著貯藏時間的延長，酯類物質尤其是己酯類物質成了主要的呈香物質。這種現象的產生可能是由于不同揮發性化合物氣味閾值以及含量的不同導致的。其中酯類物質的產量通常是隨著乙烯的釋放而逐漸升高，在果實成熟過程中還伴隨著各種香氣合成相關酶含量和活性的變化，它們也在影響著揮發性物質的種類和產量。

3 結論

‘粉紅女士’蘋果果實的揮發性物質主要為酯類和醛類物質，具有甜香果香的乙酸己酯是其特征香氣物質。揮發性物質種類和含量在貯藏期間均發生了變化，在貯藏前期和后期種類差異較大的揮發性物質有法尼醇、2-甲基丁酸；含量差異較大的物質有丁酸丙酯、己酸己酯、辛酸己酯和己醛。正丁醇作為蘋果果實中揮發性酯類物質合成主要前體物質，采用10 和25 μL·L正丁醇處理均刺激了貯藏初期果實揮發性物質的產生，且25 μL·L正丁醇處理后對貯藏初期揮發性物質含量和OAV 的影響更顯著。該研究為后續酯類物質的深入研究奠定了理論基礎。