基于甲狀腺激素及脫碘酶探討桑葚多酚類物質對壬基酚所致神經行為毒性的干預效應

李中意，柯倩華，劉煥，韓文娜，朱思俞，柳春紅,

（1.華南農業大學食品學院，廣東廣州 510642；2.廣東省食品質量安全重點實驗室，廣東廣州 510642）

壬基酚（Nonylphenol，NP）是一種重要的工業原料，常被用于生產表面活性劑、殺蟲劑、潤濕劑和乳化劑等。國內對NP 的需求量巨大，是僅次于美國的第二大消費市場。研究顯示，空氣、水體和土壤中的NP 污染情況十分嚴重，工業、農業和生活污水是環境中NP 的主要來源，我國大多數河流均有較高水平的NP 檢出。水體中的NP 污染不僅會降低魚類的生育能力，造成魚類臟器毒性和胚胎發育毒性，更重要的是會對以魚類為食的人類造成威脅，對人體產生生殖、免疫、神經等方面的毒性。有研究發現NP 在體內具有模擬雌激素的作用，影響雌性SD 大鼠仔鼠早期神經行為的發育，降低仔鼠的空間學習記憶。相似地，有研究顯示長期暴露于NP 會導致其蓄積在大鼠甲狀腺和血清中，使甲狀腺的組織形態及超微結構發生變化，并且會干擾甲狀腺受體和雌激素受體的表達，從而影響大鼠的神經行為。

桑葚是一種營養價值較高的小漿果，在世界各地種植廣泛，果實可作為水果和中藥食用，葉子可以用于喂養桑蠶。桑葚中除了富含人體必需的多種氨基酸，維生素和礦物質，還含有多種活性成分，如花青素、白藜蘆醇等。桑葚已經被證實具有抗氧化和保護神經系統的作用，改善大鼠的內分泌紊亂，影響焦慮行為等。桑葚中主要的多酚類物質花青素和白藜蘆醇對神經退行性疾病有明顯的改善效果，如花青素具有較強的抗氧化能力，能改善不溶性淀粉樣蛋白所致的神經毒性，提高大鼠在Morris 水迷宮中的空間記憶能力；白藜蘆醇能夠通過影響細胞的自噬，提高對大腦中病理性蛋白的清除能力。目前有研究表明桑葚粗提液對NP 所致的神經毒性有一定的干預效果，但桑葚粗提液中主要是哪種成分以及通過哪種途徑對NP 毒性發揮干預作用尚不明晰。

本研究用桑葚粗提液和桑葚多酚類物質（花青素、白藜蘆醇、花青素和白藜蘆醇聯合）對NP 染毒大鼠進行干預，從大鼠體重、食物利用率和臟器系數評價桑葚多酚類物質對NP 一般毒性的干預作用。通過曠場實驗（Open field test,OFT）和高架十字迷宮實驗（Elevated plus maze,EPM）對大鼠的神經行為進行評價，從甲狀腺激素通路和脫碘酶水平分析桑葚及其多酚類物質對NP 染毒大鼠的神經調節作用，研究結果有助于深入探討NP 導致大鼠神經毒性的機制，并且對進一步挖掘桑葚及桑葚多酚類物質的健康效應以及研發具有抗外源化學物毒性的保健食品具有重要的參考意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮桑葚 國家桑樹種植資源華南分圃（廣州）；桑葚花青素（純度≥95%）成都草源康生物科技有限公司；白藜蘆醇（HPLC≥98%）上海源葉生物科技有限公司；壬基酚 上海阿拉丁試劑公司；大鼠脫碘酶（DIO1、DIO2、DIO3）ELISA 檢測試劑盒、大鼠甲狀腺素（FT3，FT4）ELISA 檢測試劑盒、大鼠促甲狀腺素（TSH）ELISA 檢測試劑盒 上海江萊生物科技有限公司；SPF 級雄性SD 大鼠 70 只，體重70～90 g，4 周齡，動物和飼料購于廣東省醫學實驗動物中心（SCXK（粵）2018-0002），實驗動物合格證號：44007200078791，通過華南農業大學實驗動物倫理委員會批準（編號：2020b031）。

曠場實驗裝置和高架十字迷宮裝置 上海移數信息科技有限公司；Ethovision 8.0 型行為軌跡跟蹤分析系統 荷蘭Noldus 公司；高效液相色譜儀 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 制備桑葚粗提液 參考楊婕的方法制備桑葚粗提液（MCE），該方法主要提取具有相應活性作用的多酚類物質，又以其中的花青素和白藜蘆醇為代表參與后續的干預實驗。將新鮮桑葚冷凍干燥后粉碎過篩（60 目），稱取500 g 粉末，按照料液比1:15加入乙醇（體積分數80%），超聲輔助提取1.5 h。靜置后取上清液，桑葚果渣按以上步驟重復提取，將提取液進行真空抽濾，得到的濃縮液用超純水定容至500 mL，即為桑葚粗提液，4 ℃避光保存備用。

1.2.2 桑葚粗提液總多酚、總花青素和白藜蘆醇含量的測定 a.福林-酚法測定桑葚粗提液總多酚含量。使用80%乙醇溶液配制1 mg/mL 的沒食子酸標準溶液，然后用80%乙醇溶液將其稀釋為400、350、300、250、200、150 和50 mg/mL 的標準溶液。分別取125 μL 各濃度標準溶液與福林酚溶液1:1 混合，避光靜置90 min 后測定760 nm 處吸光值，以沒食子酸濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制標準曲線。將桑葚粗提液稀釋100 倍，按上述步驟繪制標曲計算總多酚含量。

b.pH 示差法測定桑葚粗提液中總花青素含量。首先配制pH1.0 的氯化鉀和pH4.5 的乙酸鈉緩沖液。將桑葚粗提液稀釋100 倍后取2 份，每份2.5 mL，分別用pH1.0 的氯化鉀和pH4.5 的乙酸鈉緩沖液定容至25 mL，得到濃度相同的不同樣品緩沖液。將樣品緩沖液進行水浴平衡（氯化鉀緩沖液：70 ℃，45 min；乙酸鈉緩沖液：40 ℃，45 min），分別在520 和700 nm處檢測吸光值，根據參考文獻中公式計算花青素含量。

c.參考標準NY/T 2641-2014《植物源性食品中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的測定 高效液相色譜法》，測定桑葚粗提液中白藜蘆醇的含量。

1.2.3 實驗動物分組及處理 將70 只大鼠單籠飼養于屏障環境中，大鼠可自由飲食，室內溫度為（22±0.5）℃，相對濕度為50%～60%，明/暗12 h 循環。適應性飼養一周后，通過隨機區組設計分組，根據大鼠體重分為7 組：空白對照組（C 組），桑葚對照組（MC 組：MCE，以多酚含量計，120 mg/kg·bw），NP 染毒組（NP 組：NP，270 mg/kg·bw，溶劑為玉米油），桑葚干預組（M 組，NP+MCE），花青素干預組（A 組，NP+花青素，按桑葚粗提液中花青素含量計），白藜蘆醇干預組（R 組，NP+白藜蘆醇，按桑葚粗提液中白藜蘆醇含量計），花青素和白藜蘆醇聯合干預組（AR 組，NP+花青素+白藜蘆醇，按桑葚粗提液中花青素和白藜蘆醇含量混合）。NP 溶于玉米油后按照4 mL/kg·bw 灌胃。干預組溶劑為生理鹽水，另添加0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液輔助溶解，按照10 mL/kg·bw 灌胃。每天上午9:00 空白對照組和桑葚對照組灌胃玉米油，染毒組和干預組灌胃壬基酚（溶于玉米油）；1 h后，空白對照組和NP 染毒組灌胃生理鹽水，桑葚對照組灌胃桑葚粗提液（溶于生理鹽水），干預組分別灌胃MCE、花青素、白藜蘆醇和花青素與白藜蘆醇的混合液（溶于生理鹽水）。各組大鼠每天具體灌胃設計見表1，連續灌胃28 d。

表1 大鼠每天灌胃設計表Table 1 Operation table of rats by intragastric administration every day

1.2.4 大鼠體重和食物利用率的測定 每4 d 為一個灌胃期，每個灌胃期結束當天的同一時間稱量體重和飼料剩余量，記錄數據，食物利用率=（體重增量/飼料消耗量）×100

1.2.5 大鼠臟器系數的測定 大鼠在斷頸處死前稱量其體重，處死后在冰上進行解剖，將大鼠肝臟、腎臟、睪丸和大腦完整的剝離后稱重，臟器系數=（臟器重量/大鼠體重）×100

1.2.6 行為學測試 行為學裝置在徹底清潔后進行實驗，實驗開始前1 h 將大鼠轉移到行為學實驗室讓其適應環境，開始實驗時，從大鼠背后輕柔地將其取出鼠籠，放入OFT 和EPM 行為學裝置中，然后立即離開實驗區域，并通過行為學裝置配套軟件自動記錄大鼠在5 min 內產生的行為學數據（OFT：總路程，進入中心區域次數、時間和路程，直立次數、修飾次數；EPM：入臂總次數和總時間，進入開臂次數和時間），實驗結束后將行為學裝置中大鼠的排泄物清理干凈，并用75%的乙醇消除氣味再進行下一次實驗。

1.2.7 甲狀腺激素水平的測定 行為學實驗結束后，對大鼠進行眼眶取血，采血后常溫靜置30 min，然后3000 r/min 離心15 min，得到的上清液即為血清，用相應的ELISA 試劑盒檢測血清中的FT3、FT4 和TSH。

1.2.8 脫碘酶水平的測定 大鼠斷頸處死后，在冰上解剖分離肝臟。切取同一部位的適量肝臟組織并稱重記錄，按1:9 的質量比例加入PBS 緩沖液，在冷凍研磨儀中重復研磨，得到的勻漿液在4 ℃，3000 r/min離心20 min，取上清液用相應的ELISA 試劑盒檢測DIO1、DIO2 和DIO3。

1.3 數據處理

實驗數據處理后以均值±標準差（mean±SD）表示，使用SPSS20.0 軟件對數據進行統計學分析，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）比較組間差異。若方差齊則采用LSD 檢驗，若方差不齊則采用Games-Howell 檢驗。<0.05 表示差異顯著，<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 桑葚粗提液多酚類物質含量

通過實驗測定得到，桑葚粗提液中總多酚含量為24.21 mg/mL，花青素含量為14.08 mg/mL，白藜蘆醇含量為129.67 mg/mL。

2.2 大鼠體重和食物利用率變化

由圖1 可知，在28 d 的灌胃期間各組大鼠的平均體重均呈現上升的趨勢，C 組平均體重增長速度最快，MC 組和R 組次之。但隨著灌胃天數的增加，各組大鼠體重的增長速率逐漸減緩，其中NP 組在28 d灌胃期后期體重增長速度最慢。

圖1 桑葚多酚類物質對NP 染毒大鼠體重增長的影響Fig.1 Effects of mulberry polyphenols on body weight gain of rats exposed to NP

由表2 可知，灌胃前各組間大鼠體重無顯著性差異（>0.05）。經過28 d 的灌胃后，與C 組相比，各組大鼠體重和體重增量均顯著或極顯著低于C 組（<0.05 或<0.01）。與NP 染毒組相比，四個干預組除R 組體重顯著增加（<0.05）、體重增量極顯著提高（<0.01）外，M、A 和AR 組大鼠體重和體重增量均無顯著性差異（>0.05）。

表2 各組大鼠體重變化Table 2 Changes of body weight of rats in each group

由表3 可知，在28 d 灌胃期間，各組大鼠的食物利用率均逐漸下降。在灌胃前期，各組大鼠食物利用率沒有明顯差異。與C 組相比，NP 組食物利用率從第4 個灌胃期開始出現極顯著下降（<0.01）；M 組食物利用率從第3 個灌胃期開始顯著下降（<0.05），但從第6 個灌胃期開始有所恢復，與C 組無顯著性差異（>0.05）；A、R 和AR 組食物利用率僅在第4個灌胃期有顯著降低（<0.05）。與NP 組相比，四個干預組食物利用率均從第6 個灌胃期開始顯著或極顯著上升（<0.05 或<0.01）。從總食物利用率來看，四個干預組與NP 染毒組相比只有M 組食物利用率有極顯著提升（<0.01）。

表3 各組大鼠食物利用率的變化Table 3 Changes of food utilization rate of rats in each group

綜上所述，連續28 d 的NP 暴露后，大鼠體重和食物利用率會明顯降低，說明NP 會影響大鼠的正常生長發育。四個干預組對NP 導致的大鼠體重和食物利用率的下降都有恢復作用，白藜蘆醇對體重變化的改善最明顯，而桑葚粗提液可以更好地改善NP 導致的食物利用率降低。

2.3 大鼠臟器系數的變化

由圖2 可知，與C 和MC 組相比，NP 組大鼠的腎臟系數和肝臟系數均有顯著或極顯著增加（<0.05或<0.01），說明NP 染毒后大鼠的腎臟和肝臟產生了形態學變化；與NP 組相比，四個干預組的腎臟系數都有降低但無顯著性差異（>0.05），肝臟系數也都有下降，并且A 組的肝臟系數顯著下降（<0.05），這可能是因為花青素能夠調節促凋亡蛋白和促炎因子的表達，從而抑制肝臟細胞凋亡。就大腦系數而言，與C 組相比，除MC 組和R 組，其余4 組大鼠大腦系數均顯著或極顯著增加（<0.05 或<0.01），說明NP 染毒可能使大鼠大腦產生了形態學變化；與NP 組相比，M、R、AR 組大腦系數都有下降趨勢，其中R 組下降最明顯，但沒有顯著降低，說明桑葚粗提液、白藜蘆醇和聯合干預組對大腦系數的有干預效果但不是很明顯。就睪丸系數而言，各組大鼠間沒有顯著性差異（>0.05）。

圖2 桑葚多酚類物質對NP 染毒大鼠臟器系數的影響Fig.2 Effects of mulberry polyphenols on organ coefficient of rats exposed to NP

2.4 桑葚多酚類物質對NP 染毒后大鼠神經行為的影響

各組大鼠在28 d 灌胃期前后的OFT 結果如表4和表5 所示。由表4 可知，各組大鼠的OFT 行為指標均無顯著性差異（>0.05）。由表5 可知，與C 組、MC 組相比，NP 組大鼠活動總距離極顯著下降（<0.01）。NP 組大鼠進入中心區的次數和時間顯著低于C 組（<0.05），且在中心區活動距離和直立次數顯著低于MC 組（<0.05）。大鼠進入中心區次數和時間越少，焦慮程度越高，這說明NP 染毒造模成功。與NP 染毒組相比，四個干預組的大鼠活動總路程都顯著增加（<0.05），M 組、R 組和AR 組大鼠進入中心區域次數顯著或極顯著增加（<0.05 或<0.01），R 組大鼠在中心區域活動時間顯著上升（<0.05），M 組和AR 組大鼠在中心區域活動距離顯著增加（<0.05），AR 組大鼠直立次數極顯著增加（<0.01），這些結果說明M 組、R 組和AR 組對大鼠焦慮均有一定的干預效果，而A 組的干預效果不明顯。

表4 灌胃前OFT 行為指標分析Table 4 Analysis of behavioral indexes of OFT before intragastric administration

表5 灌胃后OFT 行為指標分析Table 5 Analysis of behavioral indexes of OFT after intragastric administration

由表6 可知，各組間大鼠在28 d 灌胃期前的EPM 行為指標均無顯著性差異（>0.05），28 d 灌胃期后各組大鼠在EPM 的行為指標分析如表7 所示。與C 組和MC 組相比，NP 組大鼠入臂總次數、進入開臂的次數和時間均顯著或極顯著減少（<0.05或<0.01），說明NP 染毒使大鼠產生了焦慮情緒，造模成功。與NP 組相比，M 組、A 組和R 組大鼠入臂總次數、進入開臂的次數和時間均有顯著或極顯著提高（<0.05 或<0.01），AR 組的入臂總次數和進入開臂的次數也顯著提高（<0.05），這些結果說明四個干預組對大鼠焦慮均有一定的干預效果。

表6 灌胃前EPM 行為指標分析Table 6 Analysis of behavioral indexes of EPM before intragastric administration

表7 灌胃后EPM 行為指標分析Table 7 Analysis of behavioral indexes of EPM after intragastric administration

綜上所述，OFT 和EPM 測試結果同時說明NP 暴露會導致大鼠的焦慮行為。NP 暴露后可能會在蓄積大腦中并導致神經元細胞排列紊亂和胞核固縮，隨著暴露濃度越高，腦組織中NP 蓄積濃度越高。結合本研究中NP 暴露后大腦系數顯著增加的結果，推測NP 可能通過蓄積在大腦中對神經元產生損傷，從而產生神經行為毒性。楊婕發現桑葚粗提液能夠顯著增加大鼠在OFT 測試中進入曠場中心區域次數，還可以顯著提高EPM 測試中進入開臂的次數和時間，說明桑葚粗提液能夠改善焦慮程度，本研究結果與之一致。

2.5 桑葚多酚類物質對NP 染毒后大鼠甲狀腺激素的影響

桑葚粗提液、花青素及白藜蘆醇對各組大鼠血清中FT3、FT4 和TSH 水平的影響如圖3 所示。與C 組和MC 組相比，NP 組大鼠血清中的FT3、FT4和TSH 都有極顯著降低（<0.01），說明NP 對甲狀腺激素和促甲狀腺激素的分泌產生了干擾。干預組中，M 組和AR 組與NP 組大鼠相比，血清中FT3、FT4 和TSH 水平都有顯著回升（<0.05 或<0.01），R 組大鼠血清中的FT3 水平有極顯著的上升（<0.01），說明桑葚粗提液干預和聯合干預能夠在一定程度上緩解NP 對甲狀腺激素和促甲狀腺激素的影響。

圖3 桑葚多酚類物質對NP 染毒大鼠血清中甲狀腺激素的影響Fig.3 Effects of mulberry polyphenols on thyroid hormone in serum of rats exposed to NP

2.6 桑葚多酚類物質對NP 染毒后大鼠脫碘酶的影響

桑葚粗提液、花青素及白藜蘆醇對各組大鼠肝臟中脫碘酶DIO1、DIO2 和DIO3 水平的影響如圖4所示。與C 組相比，NP 組、R 組和AR 組大鼠肝臟內的DIO1、DIO2 和DIO3 水平均顯著或極顯著增加（<0.05 或<0.01），說明NP 暴露引起了大鼠肝臟中脫碘酶表達異常，花青素及聯合干預沒能逆轉NP 誘導的脫碘酶升高。M 組和A 組大鼠肝臟中DIO1、DIO2 和DIO3 水平與對照組相比沒有顯著性差異（>0.05），與NP 組相比均有下降的趨勢，但無顯著性差異（>0.05），說明桑葚粗提液和花青素對大鼠肝臟脫碘酶的干預有一定效果，但不是很明顯。

圖4 桑葚多酚類物質對NP 染毒大鼠脫碘酶的影響Fig.4 Effects of mulberry polyphenols on deiodinase in rats exposed to NP

3 討論與結論

本研究中，連續28 d 的NP 暴露導致大鼠體重和食物利用率明顯降低，而四組干預組中白藜蘆醇組對體重變化的改善最明顯，其他三個干預組也有所改善，但程度不大。另外，桑葚干預組的食物利用率明顯高于NP 組且恢復到與C 組相當的水平，而其余三組恢復程度不明顯。結果說明桑葚粗提液可以改善NP 導致的食物利用率降低，而白藜蘆醇的干預作用更好地體現在了體重的恢復上，先前的研究亦顯示，白藜蘆醇能夠在一定程度上改善環磷酰胺引起的免疫力低下導致的小鼠體重下降。

臟器系數是評價毒性作用的常用指標，能夠在一定程度上反映實驗動物的機能狀態和內臟器官的病理變化。從本實驗的臟器系數結果來看，NP 暴露后的大鼠肝臟系數、腎臟系數和大腦系數均顯著增加，這可能是因為NP 是脂溶性物質，容易蓄積于臟器，從而導致臟器出現充血、水腫或肥大等變化。A 組肝臟系數的干預效果最明顯，可能是花青素發揮了調節促凋亡蛋白和促炎因子的作用，從而減輕肝臟的炎癥反應。然而，四組干預物質對NP 導致的腎臟和大腦系數的增加無顯著的逆轉效果，這表明在一定程度上，桑葚多酚類物質未能有效緩解NP 所致腎臟和大腦的形態學變化。

OFT 和EPM 實驗是評估大鼠神經行為狀態的經典手段，可以通過大鼠在OFT 中進入中心區活動的時間和距離或在EPM 中進入的開臂次數和停留時間等指標來評估其焦慮狀態，在OFT 中心區活動越少，或進入EPM 開臂次數越少，說明大鼠的焦慮程度越高。本研究中，NP 組大鼠與C 組和MC 組相比，在OFT 中活動的總路程、直立次數和進入中心區次數明顯減少，在EPM 中進入開臂的次數和停留時間也明顯降低，表明NP 暴露可引起大鼠焦慮情緒。而在桑葚粗提液和多酚類物質干預后，上述指標均有一定程度的提高，并恢復到對照組水平，說明干預組大鼠的焦慮水平被有效緩解。多酚類物質能夠對焦慮抑郁情緒有一定的緩解作用，例如富含多酚的黑果海葵汁能夠顯著增加大鼠在EPM 中進入開臂的時間和次數，且具有劑量-效應關系，對大鼠具有明顯的抗焦慮作用；黑莓汁中的花青素對大鼠也有鎮定和抗焦慮的作用，而且在一定劑量下可達到抗焦慮藥物相似的效果；白藜蘆醇也具有多種治療作用，如抗氧化、抗炎、神經保護等。

甲狀腺激素對于大腦發揮正常功能有著重要的作用，而內分泌干擾物會影響甲狀腺激素的水平，進而影響大腦的神經系統。有報道稱甲狀腺激素的降低會導致海馬體神經元突觸結構生長緩慢，造成記憶力下降和認知障礙。本研究結果顯示，與C 組和MC 組相比，大鼠在暴露于NP 后血清中FT3、FT4和TSH 水平極顯著下降，說明NP 可能對大鼠的甲狀腺造成了一定的損傷。與NP 組相比，桑葚粗提液干預、花青素和白藜蘆醇聯合干預都能顯著或極顯著提高FT3、FT4 和TSH 的水平（<0.05 或<0.01），白藜蘆醇單獨處理也能顯著提高FT3 的水平（<0.05），而花青素單獨處理后，FT3、FT4 和TSH 均沒有明顯回升。研究顯示，白藜蘆醇能夠通過改善甲狀腺功能減退大鼠血漿TSH水平和下丘腦促甲狀腺激素釋放激素（TRH）水平，從而改善其學習記憶能力。因此，推測桑葚多酚類物質可能是通過調控大鼠體內甲狀腺激素和TSH 水平等，減少NP 導致的神經毒性，從而緩解焦慮情緒。

脫碘酶的作用在于維持甲狀腺激素水平的穩定。本研究結果顯示，NP 染毒后大鼠肝臟中的脫碘酶DIO1、DIO2 和DIO3 水平與對照組相比均顯著升高（<0.05）。經過桑葚粗提液和花青素干預后，三種脫碘酶的水平均有下降趨勢，且與對照組無顯著性差異，而白藜蘆醇和聯合干預后三種脫碘酶水平還是顯著高于對照組。結果提示桑葚粗提液和花青素對肝臟脫碘酶水平有一定的調節作用，其對NP 染毒大鼠的干預效應可能是通過調節甲狀腺激素和脫碘酶水平的穩態、改善大鼠的焦慮情緒，從而達到減輕神經行為毒性的途徑來實現的。

綜上所述，NP 短期重復染毒可導致大鼠體重和食物利用率下降，部分臟器損傷，焦慮行為，血清FT3、FT4 和TSH 水平的降低和肝臟DIO1、DIO2和DIO3 水平的升高。桑葚粗提液及其主要多酚成分花青素和白藜蘆醇可以有效緩解NP 所致的有害作用，推測其中的機制可能是桑葚多酚類物質可以通過調節甲狀腺激素水平穩態達到減輕神經行為毒性的干預效果。