魚內臟蛋白水解物的制備及其生理活性研究進展

黃 蘋，袁美蘭，趙利，江勇，白春清，陳麗麗

（國家淡水魚加工技術研發分中心（南昌），江西科技師范大學生命科學學院，江西南昌 330013）

2020 年，我國水產品總產量為6549.02 萬噸，其中魚類總產量為2761.36 萬噸，在水產品中占比42.2%，同比增長了1.95%。在魚類加工中，會產生約占生魚質量40%～55%的副產物（包括魚頭、魚皮、魚骨、魚鱗和內臟），但是約有50%的副產物被直接作為廢物丟棄處理，僅有30%被初步加工為低值的動物飼料、肥料或發酵魚露、魚粉。其中魚內臟含有大量的蛋白類物質且在副產物中占有較大比重（約15%～30%），但其難保存、易腐爛及高值化利用程度較低，造成了不必要的浪費和污染。

近年來，從魚及其副產物中制備蛋白水解物成為研究熱點。魚內臟是蛋白質和omega-3 多不飽和脂肪酸的重要來源，可用作生產蛋白質水解物的原料。魚蛋白水解物（FPH）是魚蛋白酶水解后轉化成的多肽產物，具有抗凝血、抗菌、抑制血管緊張素轉換酶和抗氧化等活性，可以被用于治療動脈粥樣硬化、癌癥、冠心病和心血管類疾病。目前，國內外對于魚內臟生產具有生理活性的蛋白肽的研究較為活躍。例如從大西洋鯖魚（）內臟的蛋白水解物中純化抗菌水解物，用沙丁魚副產物（魚內臟）、露斯塔野鯪（）內臟、虹鱒魚內臟、鯉魚Catla（）內臟制備抗氧化蛋白水解物。但據已有文獻可知，魚內臟蛋白水解物的生物活性尚未像牛奶蛋白肽和植物蛋白肽那樣得到廣泛深入研究，在臨床應用方面也尚未受到關注，目前多數研究還是停留在對制備工藝的不斷重復上，只有較少的研究評估了魚內臟蛋白水解物作為功能性食品的潛在生物活性。

魚內臟蛋白水解物是生物活性物質，是生產功能食品和營養補充食品的原料來源。本文對目前國內外魚內臟蛋白水解物的制備工藝和生理活性研究現狀進行了綜述，并對魚內臟蛋白水解物的綜合加工利用前景進行展望，旨在為魚內臟蛋白水解物的進一步開發利用提供參考，也為水產品產業的轉型發展帶來更多機遇。

1 魚內臟的基本成分構成

魚內臟可作為生產蛋白質的良好來源，其用途十分廣泛，可加工為細菌素、生物降解膜、蛋白胨，還可用作蛋白酶源。作為魚類加工的主要副產物，魚內臟約占魚體質量的10%，其成分比較復雜，主要包括蛋白質、水分、脂肪、灰分等，不同的魚內臟，其基本營養成分含量有所差異，表1 總結了幾種不同魚內臟的基本成分構成。

表1 不同種類魚內臟的基本成分構成Table 1 Basic nutritional contents of fish viscera of different species

2 魚內臟蛋白水解物的制備工藝研究現狀

2.1 魚內臟蛋白水解物的制備工藝步驟

魚內臟蛋白可以通過酸、堿、酶水解或加熱的方法轉化為低分子質量肽或游離氨基酸，是提高魚內臟蛋白生物活性的常見方法。而在水解之前需對樣品進行一系列的預處理工藝，以防止蛋白水解液發生氧化、變色及產生臭味和有毒物質。預處理一般包括去除魚內臟的膽囊、魚鰾等物質，然后對樣品進行絞碎、脫脂、滅酶、過濾、熱處理等操作。蛋白水解后獲得不同分子量的復雜的小肽段，一般使用超濾或納濾、微濾、離子交換色譜等方法對肽組分進行初步分離，得到具有多種生理活性的蛋白肽。圖1 總結了魚內臟蛋白水解物的制備工藝步驟。

圖1 魚內臟蛋白水解物制備流程Fig.1 Preparation process of fish viscera protein hydrolysate

2.2 魚內臟蛋白水解物的制備方法

蛋白水解物的制備方法分為化學法（包括酸水解、堿水解和熱水解）和生物法（包括自溶、微生物發酵和酶解法）?；瘜W法適用于非特定性的水解，其主要優勢是操作簡單且成本低廉，因此在工業上的應用較為廣泛，但反應過程難以控制，且會導致營養物質的損失和水解產物的生物活性較低。酶解法由于具有條件溫和、易于控制、無副作用且產物營養價值較高等優點，因此，是接受程度最高、最適合用于生產FPH 的方法。

近年來，越來越多的學者采用酶法水解魚內臟蛋白制備活性肽。表2 詳細總結了國內外不同魚內臟制備蛋白水解物的工藝條件及部分產物的生理活性。在國內，孫一瑋等以復合酶酶解鱈魚內臟得到氨基酸含量為16.33 mg/mL 的魚內臟蛋白水解物。林慧敏等以脫脂鮟鱇魚肝為原料制備的抗氧化肽，水解度為69.52%，羥自由基清除能力76.74%。褚晨艷等用胰蛋白酶對草魚內臟進行水解，通過單因素實驗和正交試驗優化水解條件，最佳條件下水解度可達37.87%。李致瑜等用Alcalase 蛋白酶酶解大黃魚內臟制備抗氧化肽，在最佳工藝下此內臟多肽具有較高的抗氧化活性，水解度為30.66%。在國外，Gómez 等確定了羅非魚內臟制備蛋白水解物的最佳酶解時間、溫度以及pH 等工藝條件，水解度為42.5%。Motamedzadegan 等用中性蛋白酶水解黃鰭金槍魚內臟，其水解度相較其他酶制備蛋白水解物，水解度較低為30%。以上研究都以水解度為指標，確定了不同魚內臟的水解條件，從中可知，不同條件下的水解度是不同的，這取決于所選擇的酶、底物以及溫度、酸堿度、酶解時間等，其中蛋白酶的特異性影響分子量和疏水性，可以用來系統地從N 末端或C 末端清除氨基酸，從而影響蛋白質的水解。較長的水解時間產生分子量較小的蛋白質和肽，在蛋白質表面產生更多暴露的可電離和極性基團，使其與水形成氫鍵的能力提高，則溶解性高，具有較高水解度。溫度和酸堿度都會對酶的反應動力學產生很大影響，極端的溫度和酸堿度會使酶變性而失活，從而導致水解程度降低。研究發現，一般堿性條件下的底物蛋白和水解物蛋白的可溶性肽含量高于酸性條件下的可溶性肽含量；pH 接近中性的酶，如中性蛋白酶、堿性蛋白酶和風味酶應用更加廣泛。綜合文獻來看，使用堿性蛋白酶、延長酶解時間及在中性或堿性條件下，魚內臟蛋白水解物的水解度更高，且大多數小分子肽段具有更高的抗氧化活性，從而提高魚內臟蛋白水解物的生理活性。此外，酶解法受多種因素的調控，它對環境污染較小，是目前具有發展前景的一種技術。

表2 魚內臟水解制備蛋白肽的工藝Table 2 Preparation of protein peptides from fish viscera by hydrolysis

從表2 可以看出，魚內臟蛋白水解物的相關研究比較多，雖然它們有潛在的生理功效，但大多數關于魚內臟蛋白水解生物活性的實驗都是在體外進行的，尚未進行體內研究和臨床證實，導致其工業化制備和應用也尚未實現。如果能進一步完善相關研究，并充分開發利用其生理活性物質，則可為淡水魚加工副產物的合理利用提供方向，提高水產行業的經濟效益。

3 魚內臟蛋白肽的氨基酸組成

蛋白及多肽的理化特性和生理活性與它的氨基酸組成有著直接或間接的關系。表3 總結了部分魚內臟蛋白肽的氨基酸組成?？梢钥闯鲆螋~類種類不同，氨基酸組成有較大差異，且同一種魚內臟，不同水解處理條件得到的內臟蛋白水解物的氨基酸組成也是不一樣的。其中大多數魚內臟含有較高的谷氨酸、甘氨酸、精氨酸、脯氨酸、亮氨酸。

表3 魚內臟蛋白酶解物中活性肽的氨基酸序列Table 3 Amino acid sequences of active peptides in the hydrolysates of fish viscera

4 魚內臟蛋白水解物的生理活性研究

4.1 魚內臟蛋白的抗氧化性

自由基是通過身體內的正常生理反應產生的物質，但過量的自由基生成易導致機體細胞或組織損傷。天然蛋白水解物在抑制氧化和清除自由基方面起著重要作用，可防止衰老、抗高血壓、抗癌癥、心血管疾病等慢性病，增強機體免疫力。

目前，研究表明魚類加工副產物的蛋白水解物是潛在的食品抗氧化劑的天然來源，許多抗氧化肽已在魚內臟蛋白水解物中被鑒定出來。Ganesh 等用胃蛋白酶和胰蛋白酶復合水解烏鯧魚內臟，經分離純化得到分子量為701.9 Da，結構為Ala-Met-Thr-Gly-Leu-Glu-Ala 的高抗氧化性肽段，在1 mg/mL 濃度下，DPPH 達到54%、金屬螯合能力達到78.6%，隨著酶解液濃度的增加，還原力也加強。Hassan等研究了用化學法和酶法制備得到的鰱魚內臟蛋白水解液的噴霧干燥產物的抗氧化性能。結果表明，胃蛋白酶和木瓜蛋白酶制備的鰱魚內臟蛋白水解液具有良好的抗氧化性能和綜合品質。Je 等用不同蛋白酶對金槍魚肝臟進行酶解得到的蛋白水解物，其還原力、DPPH 清除能力等都較高，具有較好的抗氧化活性。李娜等對鱈魚魚鰾用六種酶進行酶解，其產物DPPH 清除能力達到61.1%，同時有較好的亞鐵離子螯合能力。Bougatef 等對沙丁魚內臟蛋白水解產物中的新型抗氧化肽進行純化與鑒定，分離出七個抗氧化劑肽，其結構分別為Leu-His-Tyr、Leu-Ala-Arg-Leu、Gly-Gly-Glu、Gly-Ala-His、Gly-Ala-Trp-Ala、Pro-His-Tyr-Leu 和Gly-Ala -Leu-Ala-Ala-His，第一個肽表現出最高的DPPH 自由基清除活性，達63%±1.57%。研究表明，低分子量的肽段抗氧化活性更高。

4.2 魚內臟蛋白水解物的抑制血管緊張素I 轉化酶（ACE）活性

人體腎素-血管緊張素生化系統（RAS）和激肽釋放酶-激酶系統（KKS）對人體內的血壓進行調節。RAS 是升壓調節系統，腎素先將血管緊張素原轉化為血管緊張素I，再通過血管緊張素轉換酶（ACE）轉化為血管緊張素II，導致血壓升高（高血壓）。KKS能使毛細血管舒張，增加通透性，使血壓下降，是降壓調節。ACE 抑制劑作用于抗高血壓治療靶點，對于高血壓人群，如果服用ACE 抑制劑，則降低血管緊張素Ⅱ的生成，血壓下降，從而達到治療高血壓的目的。楊曉軍等以斑點叉尾鮰內臟為原料，用木瓜蛋白酶進行水解，制備血管緊張素轉化酶抑制產物，酶解產物的ACE 抑制率為72.34%。Bougatef等研究了不同蛋白酶處理的沙丁魚副產物（魚頭和魚內臟）所制的蛋白水解物的血管緊張素轉換酶抑制活性，結果表明所有水解產物對血管緊張素轉換酶都有抑制活性，而堿性蛋白酶處理內臟產生的水解產物具有最高的抑制活性（63.2%±1.5%）。Je 等使用不同的酶對金槍魚肝進行水解，結果表明所有水解產物都具有ACE 抑制特性。目前，大多數具有ACE 抑制活性的蛋白肽都是化學合成的，具有一定的副作用，因此，制備天然的具有ACE 抑制活性的蛋白水解物是值得研究的熱點。

4.3 抗菌性

抗菌肽（AMPs）是由10～60 個氨基酸組成的具有生物活性的小分子多肽，已發現植物、動物和微生物等多種來源。其中魚蛋白水解物中的抗菌肽，不僅能消除入侵的微生物，還能夠調節炎癥反應。LEAP-2和Hepcidins（鐵調素）都是由魚肝臟合成的抗菌多肽。有報道指出魚蛋白水解物對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌都有一定的抑制作用。目前用魚內臟提取抗菌肽的研究相對較少，Pezeshk 等用魚精蛋白復合酶對黃鰭金槍魚內臟進行水解，獲得的水解物通過超濾分離得到四個不同分子量的肽段，其中，最低分子量即<3 kDa 的抗菌肽段對革蘭氏陽性（李斯特菌和葡萄球菌）和革蘭氏陰性（大腸桿菌和假單胞菌）致病菌和與魚腐敗相關的微生物具有最高的抑菌率，對DPPH和ABTS自由基具有清除活性，且鐵離子還原能力較強。這些結果表明，從黃鰭金槍魚內臟中提取的蛋白質水解產物及其肽段可用作營養制品和功能性食品中的抗菌成分和抗氧化成分。

Ennaas 等使用復合蛋白酶水解鯖魚（）內臟，獲得的水解物對革蘭氏陽性菌（）和革蘭氏陰性菌均有抑制作用。Robert等用復合蛋白酶將羅非魚內臟水解，水解產物的必需氨基酸含量較高，且氨基酸組成平衡，并對魯氏耶爾森菌（）、愛德華氏菌（）和巨大芽孢桿菌（）有明顯抗菌作用。

抗菌肽除可直接殺滅微生物外，還可通過免疫調節機制改善其免疫功能，增強抗病能力，具有無污染、無殘留、廣譜抗菌及不易產生耐藥性等特點，是水產動物自身免疫系統的重要組成部分，已成為國內外學者研究的熱點，有望成為制藥領域新抗生素以及食品工業中抗菌劑的潛在替代物。

4.4 魚內臟蛋白水解物的其他生理活性

據報道魚副產物蛋白水解物具有抗壓、預防糖尿病、抗衰老、抗炎和抗癌等潛在活性，且在制藥領域已有應用，例如魚骨具有降血糖作用；羅非魚皮對細胞生長具有保護作用、對抗衰老具有好的發展潛力。目前，有少量關于利用魚的消化酶生產生物活性肽的報道。Gómez 等在羅非魚內臟的水解產物研究中，用HO應激的人腸分化Caco-2 細胞評價水解產物對氧化應激的保護作用，得到的兩個餾分RTVH-A 和FRTVH-V，在≤0.5 mg/mL 的濃度下，可防止細胞活力的降低，并抑制HO誘導的細胞內活性氧（ROS）的積累，表明RTVH-A 和FRTVH-V 是具有抗氧化特性的成分，并且對ROS介導的腸損傷具有保護作用。Giannetto 等從鳀魚內臟中獲得的蛋白質水解物（APH）對脂多糖誘導的RAW 264.7 細胞炎癥有顯著的保護作用，降低了促炎介質（即環氧化酶-2）的蛋白表達。同時對敲除基因的小鼠飲食中補充APH，發現其對主動脈和心臟組織中的促炎細胞因子及氧化應激相關基因（/、、、和）的表達進行調節，表明APH 可發揮有益作用，具有抗炎性。Xu 等對鮟鱇魚肝臟進行水解得到魚內臟蛋白肽，再利用實驗小鼠爬升耐力試驗證明了該蛋白肽是一種抗疲勞肽，有明顯的抗疲勞作用。現有的研究表明魚內臟蛋白水解物具有一定的疾病預防和治療作用，具有潛在的應用價值，但距離實際應用還有很長的一段路要走，需要圍繞制備工藝條件、活性成分作用機制等方面進行更廣泛和深入的基礎研究。

5 展望

目前國內外對魚內臟的研究比較多，但這些研究還停留在較低水平的重復上，且基本上都還處于實驗室研究階段，深度研究和高值化綜合利用較少。魚內臟蛋白水解物具有抗氧化、ACE 抑制、免疫調節、金屬離子螯合、抑菌、抗糖尿病等多種生理活性，如何進一步提高水解產物的生理活性，并加快對其生理活性的體內和體外實驗研究，使之盡早用于營養保健品或功能性食品的生產開發，盡快走上產業化的道路是值得期待的。

蛋白水解物的生物活性與其氨基酸組成和序列有關，大多數具有免疫調節和抗癌活性的食源性蛋白水解物的活性都是通過細胞培養和動物模型進行測試的，僅有少數涉及臨床實驗。另一方面，利用魚內臟蛋白水解物制備功能性食品還未見報道，大多是加入到魚飼料，還需要進一步研究其在食品基質中的性能和穩定性。

此外，FVPH 的生產和使用，正成為一種受歡迎的可持續替代物，如天然抗氧化劑、蛋白質補充劑、飲料中的穩定劑和糖果產品中的風味增強劑等，但在原料和產品質量保證、低成本工藝的開發以及活性成分的分離和剩余組分回收方面存在挑戰。另外，魚內臟蛋白水解工藝若控制不當，可能會產生苦味，從而影響食品基質的感官特性，因此，如何控制水解工藝條件以避免產生苦味，以及對蛋白水解物進行有效的脫苦脫臭是值得研究的。