基于Wnt信號通路的中藥治療腦缺血/再灌注損傷研究進展

廖可欣，肖愛嬌，肖移生

(江西中醫藥大學中醫學院，江西 南昌 330004)

缺血性腦卒中(ischemic stroke, IS)好發于廣大中、老年人，其發病率、致殘率及病死率均極高，嚴重危害著人類健康，給個人、家庭、社會均帶來了沉重負擔。研究表明，導致IS致殘率、病死率高的主要原因是患者腦部缺血損傷后又出現腦血管再灌注、引發更嚴重的損傷，即發生腦缺血/再灌注損傷(cerebral ischemia-reperfusion injury, CIRI)，故救治患者IS的關鍵環節之一在于治療CIRI[1]。最新的《歐洲卒中組織(ESO)急性缺血性腦卒中靜脈溶栓指南(2021版)》中推薦，阿替普酶IVT進行溶栓治療以快速恢復缺血區的血液灌注，但短期內腦組織發生CIRI，使得腦神經損傷進一步加重，該機制復雜，是一個多因素、多機制參與的病理過程[2]。其中Wnt信號通路參與機體CIRI后腦部神經的多種靶基因轉錄，與該病理機制密切相關[3]。近年，現代醫學積極對此信號通路參與CIRI的作用機制進行研究，同時中醫藥基于Wnt信號通路治療CIRI的報道亦不斷增加，當前急需對其內在聯系進行總結。基于此，筆者從Wnt信號通路的確切機制、中藥調控Wnt信號通路治療CIRI的研究進展等方面進行綜述，以期為中藥治療CIRI提供理論依據，亦為深入探究CIRI的防治提供新思路。

1 Wnt信號通路機制概述

Wnt信號通路是機體重要的調控信號通路之一，可影響體內眾多的細胞生命活動，如調控細胞周期，促進細胞分裂，影響細胞生長和凋亡等；此信號通路亦涉及腫瘤、心腦血管疾病、衰老等多種疾病的病理生理與病機。Wnt信號通路主要由細胞外Wnt配體蛋白、細胞膜上受體、細胞質內信號轉導、核內轉錄調控幾部分構成，該信號中多個Wnt因子及相關配體配合Wnt蛋白共同發揮作用，在細胞內調控目的基因轉錄[3]。Wnt信號通路可分為經典通路和非經典通路。

1.1 Wnt經典信號通路Wnt經典通路需要關鍵介導物β-連接蛋白(β-catenin)參與，故又稱Wnt/β-catenin信號通路。此信號通路的主要配體為Wnt3、Wnt3a等，跨膜受體主要為卷曲蛋白(Frizzled, Fz)和低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6(lipoprotein receptor related proteins 5 and 6,LRP5/6)。當受到細胞外相關因子刺激時，Wnt配體與Fz及LRP5/6結合形成復合體，該復合體可活化胞質內的蓬松蛋白(dishevelled, DVL)；活化的DVL可抑制由多功能激酶糖原合酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β)、β-catenin、結腸腺瘤樣息肉蛋白(adenomatous polyposis coli, APC)、軸蛋白(Axin)形成的降解復合體對β-catenin的降解并促使其從降解復合體中解離，使得胞質中β-catenin水平上升，其易進入細胞核內與T細胞轉錄因子(T cell transcription factor, TCF)/淋巴增強因子(lymphoid enhancer-binding factor, LEF)結合，進而激活Wnt通路下游cyclinD1、MMP-7、Survivin、C-myc、c-Jun、CD44、COX-2等100多個靶基因的表達，發揮誘導細胞增殖、分化、成熟等作用[4-5]，如Fig 1。若無Wnt因子激活細胞膜表面的Fz受體，則胞質內降解復合體中的GSK3β能磷酸化β-catenin氨基端的絲氨酸/蘇氨酸殘基，磷酸化的β-catenin再結合到β轉導素重復蛋白(β translucent in repeat-containing proteins, β-TRCP)上受泛素連接酶復合體的共價修飾被蛋白酶體降解，導致胞質中β-catenin含量較少而無法順利進入細胞核內，大大減弱了核內靶基因的表達[6]，如Fig 1。

Fig1 Wnt canonical signaling pathway

1.2 Wnt非經典信號通路Wnt非經典通路中Wnt蛋白分子可以直接與Fz受體結合，可不需要LRP5/6受體參與，中游傳導亦不需要β-catenin參與。根據其Wnt配體及結合的受體不同和效應不同，又可分為Wnt平面細胞極性途徑(Wnt Planar cell polarity, Wnt/PCP)和Wnt/Ca2+途徑。

Wnt/PCP途徑激活是由細胞外相關因子刺激下，Wnt配體與Fz結合后，磷酸化胞質內DVL，使其轉變為活化狀態；活化的DVL又能激活胞質內蓬松蛋白相關形態形成活化因子-1(dishevelled associated activator of morphogenesis-1, Daam 1)和PKA與PKC相關激酶(related to the PKA and PAC kinase, RAC)，簡稱RAC蛋白；其中Daam1激活Rho蛋白，進一步激活Rho激酶(Rho-associated coiled-coil-forming kinases, ROCK)；另一方面，RAC蛋白可激活c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)；結果是ROCK與JNK兩條信號傳導激活下游目的基因轉錄，共同發揮促進肌動蛋白聚合和細胞骨架重排的作用，調控細胞在組織器官中的均勻分布、方向、運動及遷移等[7]，如Fig 2。

Wnt/Ca2+途徑啟動是受細胞外某些因子刺激下，Wnt5a和Wnt11等Wnt配體與Fz結合后，可激活G蛋白與DVL；后兩者可共同激活磷脂酶C(phospholipase C, PLC)，PLC進一步水解磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(phosphatidylinositol(4,5)-bisphosphate, PIP2) 生成肌醇三磷酸(inositol triphosphate, IP3)和二?；视?diacylglycerol, DAG)兩種第二信使分子；IP3可誘導Ca2+從內質網釋放，DAG又可激活磷脂酶C形成正反饋，進一步增加胞質內的Ca2+濃度；Ca2+觸發下游生物學效應，如激活蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)、鈣調神經磷酸酶(calcineurin)、Ca2+/鈣調蛋白依賴性激酶Ⅱ(Ca2+/calmodulin-dependent kinase Ⅱ) 等，它們共同活化T細胞核因子(nuclear factor of activated T-cells, NFAT) 和核因子κB(nuclear factor kappa-B, NF-κB)，進一步調控下游目的基因轉錄，發揮調節細胞黏連、遷移等功能[8]，如Fig 2。

Fig 2 Wnt non-canonical signaling pathway

2 中藥調控Wnt信號通路治療CIRI的研究

2.1 Wnt信號通路參與CIRI的神經保護目前，有許多學者們關注“Wnt信號通路與神經保護方向”的研究。文麗梅等[9]綜合分析已有研究得出，Wnt因子與Fz、LRP5/6結合后，可作為缺氧誘導因子-1α和血管內皮生長因子的上游信號在基因水平上刺激血管內皮生長因子的表達，促進腦血管發育及新小血管生長、調節血管內皮屏障功能、維護血腦屏障緊密連接、維持神經血管內穩態，從而激活Wnt/β-catenin通路、治療CIRI。此外，一些中樞神經系統區域的神經祖細胞也可表達Wnt配體，通過Wnt非經典信號通路發揮作用，如Arenas[10]研究表明，Wnt1可通過影響同源蛋白1表達機制促進中腦多巴胺能神經元發育和中腦祖細胞增殖，Wnt3a促進神經干細胞增殖分化，Wnt5a促進神經元極性建立和軸突生長，故多種Wnt因子相互協同促進腦內神經干細胞增殖分化。綜合這些研究結果表明，Wnt經典通路和非經典通路均參與調控機體腦血管重塑、血腦屏障生成、神經細胞增殖分化等過程，與神經保護密切相關。

在此基礎上，學者們積極深入“Wnt信號通路與CIRI防治方向”的研究。CIRI病理機制較為復雜，主要存在炎性反應、自由基損傷、細胞內Ca2+超載、氨基酸毒性作用、細胞凋亡等病理改變[11]，調控Wnt信號通路可有效糾正CIRI后的此類病理變化[3]。為此，學者們積極展開相關藥物調控Wnt信號通路治療CIRI的研究，其中包括較多的有關單味中藥及中藥復方研究。CIRI歸屬中醫“腦卒中”范疇，為本虛標實之病癥，“本虛”為肝腎陰虛、氣血衰少，極易氣血津液運行障礙，以致血瘀痰毒互生，故“標實”為血瘀、痰毒，最終致使神明蒙蔽、腦絡失養[12]。

2.2 中藥調控Wnt信號通路治療CIRI

2.2.1單味中藥 針對CIRI本虛標實的核心病機，中醫藥研究從補腎滋肝、益氣養陰、活血祛瘀、通經行氣類中藥里篩選有效治療CIRI的藥物，如枸杞、山茱萸、姜黃、丹參等，均顯示出調控Wnt信號通路可治療CIRI。

枸杞具有滋補肝腎、養陰益精等功效，其主要活性成分枸杞多糖具有抗炎、抗氧化、抗應激、抗細胞凋亡等作用，為有應用前景的神經保護劑。李杏英等[13]以10、20、40 mg·kg-1的枸杞多糖連續灌胃小鼠7 d，再采用大腦中動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)法造成小鼠CIRI，結果發現不同劑量的枸杞多糖均有抗CIRI作用，有抑制神經元凋亡作用，且其作用呈現明顯的量效關系。趙奇[14]以25 mg·kg-1·d-1的枸杞多糖腹腔注射預處理高血糖大鼠4周，再采用MCAO法造成高血糖大鼠CIRI，結果發現枸杞多糖能夠使CIRI的高血糖大鼠腦Wnt3a及β-catenin蛋白表達升高、GSK-3β蛋白表達下降，并使其腦梗死面積、核固縮與凋亡神經元數量均減少，這說明枸杞多糖可激活Wnt經典信號通路調控血糖、抗神經元凋亡、減輕CIRI。

山茱萸具有補益肝腎、生津止渴等功效，其有效成分莫諾苷具有抗炎、抗氧化和抗神經細胞凋亡作用，長期應用于腦血管疾病等治療。薛金龍等[15]以30、90、270 mg·kg-1的莫諾苷給CIRI模型大鼠灌胃，每天1次，連續7 d，結果發現各劑量的莫諾苷均可促進CIRI大鼠腦組織Wnt7a表達，抑制其APC表達，從而激活Wnt信號通路發揮神經保護作用。Sun等[16]采用MCAO法制備CIRI模型大鼠，再以30、90、270 mg·kg-1莫諾苷連續灌胃CIRI大鼠7 d，結果發現各劑量的莫諾苷均可使CIRI大鼠腦內Wnt3a、β-catenin和T細胞轉錄因子-4(TCF-4)的表達增加，激活下游轉錄因子，促進神經修復、治療CIRI?？梢娚杰镙怯行С煞帜Z苷可上調腦內Wnt7a、Wnt3a、β-catenin表達、激活Wnt信號通路防治CIRI，這表明山茱萸具有此藥理作用。

姜黃具有活血行氣、溫經通脈等功效，其主要有效成分為親脂性多酚類化合物姜黃素。有研究報道，姜黃素有較好的抗炎、抗氧化、抗應激等作用，可用于防治心腦血管類疾病、神經系統類疾病、糖尿病等多種疾??；其可通過多種機制抑制CIRI，發揮神經保護作用[17]。Chen等[18]運用體外培養神經干細胞模擬CIRI模型，發現500 nmol·L-1的姜黃素可提高損傷神經干細胞的Wnt3a和β-catenin表達水平，激活Wnt經典信號通路發揮神經保護作用。Yang等[19]通過小鼠CIRI模型，發現50、100 mg·kg-1·d-1, i.p.的姜黃素可激活CIRI小鼠海馬神經Wnt/β-catenin信號通路以促進海馬神經發生，從而減輕小鼠CIRI后的認知功能障礙。這表明，姜黃可調控Wnt經典信號通路防治CIRI。

丹參具有活血祛瘀、通經行氣等功效，其主要活性物質是丹參酮，該成分具有抗炎、抗氧化、擴張血管改善微循環等藥理功能，臨床用于心腦血管類疾病、諸病瘀證等多種疾病的治療。Wang等[20]運用經冰片修飾載丹參酮IIA的新型鼻內給藥方法，發現丹參酮IIA能有效治療大鼠CIRI，可改善其神經功能，減少腦梗死面積，降低腦內MDA含量，并增強腦內SOD活性。劉月秋等[21]采用MCAO法制備大鼠CIRI模型，大鼠術前給予腹腔一次性注射1 mL·kg-1的丹參酮IIA，結果發現CIRI大鼠神經功能明顯改善，其大腦Wnt、β-catenin、cyclin D1及survivin的mRNA和蛋白表達水平均升高，TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎癥細胞因子表達明顯減少，Bax促凋亡分子表達減少，p53、Bcl-2等抗凋亡分子表達增加，這說明丹參酮可以減輕CIRI，其機制可能與其激活腦內Wnt/β-catenin/p53信號以減輕炎癥和凋亡有關。

2.2.2中藥復方 中藥復方具有辨證施治的特點，針對CIRI的核心病機，多采取益氣活血、補滋腎肝、祛瘀化痰等措施進行配伍組方治療CIRI。較多實驗研究亦證實，中藥復方可調控Wnt信號通路治療CIRI，如腦絡欣通、丹龍醒腦方、益氣活血方、補腎生髓方、黃精丸等。

復方藥品腦絡欣通(黃芪、紅花、三七、川芎、蜈蚣、當歸、天麻)為益氣活血的代表方之一，也有散結化濁之功效，是臨床治療缺血性中風、中風后遺癥的常用復方。鄧勇等[22]采用相同方法制作大鼠氣虛血瘀型CIRI模型，再以0.26 kg·L-1的腦絡欣通顆粒溶液按10 mL·kg-1劑量灌胃CIRI大鼠1、3、7 d，結果發現腦絡欣通組大鼠患側海馬和額頂葉皮質Wnt3a、Wnt5a和β-Catenin表達水平升高，且隨著灌胃時間延長藥效更佳，表明腦絡欣通可通過上調Wnt經典信號通路、可能促進CIRI后神經干細胞增殖分化，發揮治療CIRI作用。此外，譚輝等[23]也使用相同的氣虛血瘀型CIRI大鼠，再以858 mg·kg-1劑量的腦絡欣通顆粒給予CIRI大鼠連續灌胃7 d，發現腦絡欣通可促進CIRI大鼠腦組織mi RNA-124、Wnt3a、β-catenin的表達，且其Nestin和BrdU陽性細胞均增加，這表明該復方顆粒能通過影響腦組織mi RNA-124的表達而激活Wnt經典信號通路，從而促進CIRI的神經再生發揮治療作用。

丹龍醒腦方(丹參、三七、地龍、石菖蒲、遠志、菟絲子、淫羊藿)具有活血通絡、化痰開竅、化瘀通脈、補腎生髓等功效，臨床及動物實驗均證實，該方有抗炎、抗氧化、抗應激、抗細胞凋亡、改善腦血管活性、刺激神經血管單元再生等藥理作用，能較佳地治療CIRI[24]。張利美等[25]采用相同方法制備大鼠CIRI模型，再以3.7 g·kg-1、14.8 g·kg-1·d-1的丹龍醒腦方取提液給予CIRI模型大鼠灌胃治療，連續7 d，結果發現，兩組劑量的丹龍醒腦方均可升高CIRI大鼠腦內Wnt3a與β-catenin mRNA及蛋白表達、及使BrdU陽性細胞數增多，表明該方可能通過激活Wnt經典信號通路進而促進神經干細胞增殖、發揮治療CIRI作用。曹澤標等[26]采用相同的動物模型，然后以7.4 g·kg-1·d-1的丹龍醒腦方取提液灌胃CIRI模型大鼠治療，連續7 d，結果發現該方可使CIRI大鼠大腦內BrdU陽性細胞數明顯增多，Dsh1、Frizzled3、β-catenin的mRNA及蛋白表達均明顯增強，說明丹龍醒腦方能促進大腦特定腦區內的神經干細胞增殖，其機制可能與通過上調Dsh1、Frizzled3、β-catenin的表達水平、進而促進Wnt信號傳遞有關。

益氣活血方(黃芪，三七，川芎，紅花)具有益氣活血之功效，可使機體氣盛且脈絡通利，以恢復腦之氣血供養；補腎生髓方(龜版膠，鹿角膠，金毛狗脊，杜仲，肉蓯蓉，懷牛膝)有補腎生髓之效，可使機體腎精得補，髓海獲濟，腦神榮養，則神機復靈；此兩方均為治療缺血性腦中風、CIRI的良方。俞麗華等[27]將益氣活血方、補腎生髓方分別按8.54 g·kg-1、10.25 g·kg-1給兩組大鼠制備CIRI模型前30 min灌胃1次，以后每天灌胃2次，連續給藥2周，結果發現兩方均能夠降低CIRI大鼠大腦LRP5表達、升高β-Catenin蛋白表達，調節Wnt信號通路傳導，促進CIRI后大腦內源性神經干細胞增殖分化而發揮治療CIRI作用，且兩方的治療效果無差異。

黃精丸組方精煉，由黃精與當歸按1 ∶1經黃酒浸泡再蜜制成丸，具有補腎填精、益氣養陰、活血化瘀等功效，曾作為宮廷秘方用于中風防癡、抗衰防老等治療，課題組對該丸防治腦血管病、癡呆等進行了較深入的研究。筆者分別以2、5、10 g·kg-1·d-1的黃精丸藥液給大鼠灌胃，連續30 d，再采用MCAO法造成大鼠CIRI，檢測結果發現該丸對大鼠CIRI誘導的氧自由基、脂質過氧化、各種炎性因子損傷具有良好的保護作用[28]。筆者再以2.5 g·kg-1·d-1的黃精丸藥液給經D-半乳糖和岡田酸所致學習記憶障礙阿爾茲海默病(Alzheimer′s disease, AD)小鼠灌胃治療，持續4周，結果發現該丸可使AD小鼠海馬GSK-3β活性下降，β-catenin活性升高，進而增強下游CyclinD1表達，促進目的基因轉錄，發揮治療AD作用，表明黃精丸可激活機體腦內Wnt/β-catenin信號通路，發揮重要的神經保護功能[5、29]。筆者推進該丸的臨床應用研究，囑輕、中度AD患者口服黃精丸(9 g/次，2次/d)治療3個月，結果發現該丸可使患者血清SOD及GSH-Px活性升高、MDA與IL-1β水平下降，MMSE、HDS-R、ADL等智力評分明顯升高，可改善患者癡呆癥狀，提高其生活能力及認知功能[30]。故課題組推測，黃精丸可激活機體腦內Wnt信號通路以治療CIRI，其在IS中具有應用前景，值得深入探討。

3 結語與展望

綜上所述，調控腦內Wnt經典通路和非經典通路均具有抑制中樞神經炎癥、自由基及氧化損傷、細胞凋亡等作用、具有促進腦血管新生與重塑、神經干細胞增殖分化功能，與CIRI防治等神經保護密切相關。上述研究中具有補腎滋肝、益氣養陰、活血行氣、祛瘀化痰等功效的單味中藥及中藥復方能針對CIRI的中醫核心病機進行治療，可激活機體大腦Wnt信號通路，發揮治療CIRI作用。CIRI的中醫補腎益氣、活血祛瘀措施與其現代醫學的Wnt信號通路調控有較好契合之處。補腎生髓、益氣填精，則精成髓生、髓海充盈、神機復用，其現代醫學實質與激活Wnt信號通路后促進機體腦血管新生與重塑、刺激腦內特定區域神經干細胞增殖分化有著密切的相關性。CIRI后腦內出現的瘀血或缺血、炎癥反應、自由基及氧化損傷等屬于中醫的血瘀痰毒，故需活血祛瘀、化痰清毒，則氣血通暢、腦絡得榮、神明智醒，其現代醫學實質與激活Wnt信號通路后改善腦部血液供應、發揮抗炎、抗自由基、抗氧化等功能有關。

到目前，盡管有較多關于中藥調控Wnt信號通路治療CIRI的研究報道，但該研究方向中依然存在一些較明顯的問題：(1)中藥里具有補腎滋肝、益氣養陰、活血祛瘀、通經活絡等功效的單味藥或是復方藥有很多、遠不止上述所及，尚有較多的類似功效中藥是否具有調控Wnt信號通路治療CIRI作用？急需展開相關研究，以論證中醫藥在防治CIRI等腦病方向前景廣闊、大有可為。(2)已有的相關研究報道主要集中在“調控Wnt經典通路(Wnt/β-catenin)與治療CIRI”思路上，而少有“中藥調控Wnt/PCP、Wnt/Ca2+通路與治療CIRI”的研究報道。如上所述，Wnt/PCP、Wnt/Ca2+通路亦參與調控機體腦血管重塑、血腦屏障生成、神經干細胞增殖分化等，與治療CIRI密切相關，故后續學者們在深入探討“中藥調控Wnt經典通路治療CIRI”的同時，也需加強對“中藥調控Wnt/PCP、Wnt/Ca2+通路治療CIRI”的研究。(3)已有的相關研究深度和寬度還不夠，如大部分研究主要集中在Wnt經典通路中的Wnt3a、Wnt5a、β-Catenin等靶點上，對于其上游、下游的生物學變化卻鮮有探討；又如細胞內Ca2+超載、氨基酸毒性亦是CIRI的重要病理機制，而已有的相關研究缺乏相應探討等等。(4)已有的相關研究雖然立足中藥，但大多是從現代醫學的角度進行探討，缺乏現代醫學與傳統中醫的有效融合研究，此亦為后續學者們努力的方向之一。(5)已有的相關研究多是動物實驗，缺乏臨床研究、臨床轉化，這表明該研究方向依然任重道遠，需要有更多的學者、機構、政策支持與參與。

課題組研究的黃精丸具有較好地神經保護作用，其在CIRI等腦血管病防治中也顯示出應用前景，后續應圍繞“黃精丸調控機體腦內Wnt信號通路治療CIRI”展開相關研究，并積極促進相關成果臨床轉化以更好地發揮其價值。黃精丸中的黃精藥材盛產于江西、安徽、湖北、湖南等多個省份，可見，加強黃精丸的神經保護研究與應用，也可有力的促進當地黃精產業發展。