細胞焦亡在重癥COVID-19中的作用

黃豆豆,李志輝,董宇軒,凌煜焱,顧 玲,陳美娟

(南京中醫藥大學醫學院·整合醫學學院，江蘇 南京 210023)

近30年來，隨著對細胞死亡模式的不斷探究，對細胞程序性死亡的認識不斷拓展，除細胞凋亡外，又相繼發現了壞死性凋亡(necroptosis)、細胞焦亡(pyroptosis)、鐵死亡(ferroptosis)及NETosis細胞死亡等其他程序性死亡方式。其中，細胞焦亡是一種由gasdermin蛋白家族(GSDMs)介導的、伴有明顯炎癥過程的死亡形式，并且其多數途徑都有半胱氨酸天冬蛋白酶家族(caspase)參與。近年來，人們對細胞焦亡的研究不斷更新著以往的認識，而焦亡在疾病發生發展以及治療方面也展現出了不可或缺的作用,如細胞焦亡參與了多種感染性疾病和炎癥性疾病，病毒感染通常經過NLRP3炎癥小體來誘導焦亡。自2019年12月以來,由SARS-CoV-2病毒感染導致的COVID-19在全世界范圍內流行，至今感染和因此死亡的人數仍在增加。重癥COVID-19患者血清中會出現IL-1β、IL-6、TNF-α、GM-CSF等細胞因子[1,2]顯著升高，其中IL-1β是細胞焦亡相關的典型細胞因子，這提示細胞焦亡參與了SARS-CoV-2感染和重癥COVID-19相關的并發癥，靶向細胞焦亡通路中關鍵分子的藥物將在COVID-19治療中展現出明顯的優勢。本文將重點介紹細胞焦亡及其在SARS-CoV-2感染和重癥COVID-19引起的ARDS與CRS中的作用機制以及治療方法。

1 細胞焦亡的概述

1.1 細胞焦亡的特征細胞焦亡首先被定義為由炎性caspase(caspase-1/4/5/11)介導，以膜打孔蛋白家族GSDMs為最終效應蛋白的細胞程序性死亡方式。隨后大量相關研究將人們對于細胞焦亡的認識推向更深的層面，細胞死亡命名委員會(the Nomenclature Committee on Cell Death，NCCD)在2018年修正了對細胞焦亡的定義，將其更正為“一種依賴于GSDM蛋白家族形成質膜膜孔的可調控的細胞程序性死亡，經常但不總因炎癥性caspase活化來完成[3]”，即GSDMs才是細胞焦亡的真正執行者。

細胞焦亡的最終效應蛋白GSDMs在細胞膜上打孔形成離子孔道，使細胞內外滲透壓失衡，其形態學特征是細胞呈氣球樣脹大，出現DNA損傷和染色質固縮，但細胞器和細胞核保持完整，最終細胞膜脫離細胞骨架致使細胞溶解。細胞焦亡通常伴隨IL-18和IL-1β等促炎細胞因子的大量釋放，并引起強烈的炎癥反應[4]。

1.2 細胞焦亡的途徑目前所知的細胞焦亡途徑包括炎性小體激活caspase-1介導的經典途徑和由LPS激活caspase-4/5/11介導的不依賴炎癥小體的非經典途徑，以及其他一些通過凋亡caspase或顆粒酶A(granzyme A，GZMA)等介導的途徑。

典型的炎性小體復合物(如IPAF、AIM2、NLRP1、NLRP3和NLRC4)在響應細胞質模式識別受體信號時被組裝，隨后這些受體識別病原體相關分子模式(PAMPs)、內源性危險信號(DAMPs)或由細胞死亡、損傷或感染引起的細胞穩態變化，再通過招募凋亡相關的speck樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)以活化，繼而進一步招募pro-caspase-1，或不經過ASC直接招募pro-caspase-1。最后，在炎癥小體中caspase-1被激活，進而處理GSDMD以及細胞因子前體如pro-IL-1β和pro-IL-18等。活化的GSDMD通過其N端結構域在細胞膜上形成直徑為10～16 nm的孔洞，使質膜通透化后促使細胞發生焦亡，并促進成熟的IL-1β和IL-18釋放。

非典型的炎性小體途徑則導致人體內caspase-4/5(或小鼠體內caspase-11)激活。革蘭陰性細菌細胞外膜表面的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)與炎癥小體相結合成復合物或不經過炎癥小體的參與直接誘導caspase-4/5/11的聚集和活化，使之具備切割GSDMD的功能。這種焦亡途徑引起的細胞死亡分兩步進行：第一步，GSDMD在細胞膜上形成的孔洞釋放鉀離子，導致NLRP3炎癥小體活化和細胞因子IL-1β、IL-18成熟；第二步，GSDMD形成的孔洞引起細胞脹破死亡，從而促使成熟的細胞因子釋放。

除通過炎性caspase引起細胞焦亡外，近年來多項研究發現凋亡caspase也可激活GSDMs引發細胞焦亡，從而證實了GSDMs才是細胞焦亡的最終效應分子。Shao等[4]和Rogers等[5]發現，GSDME可被caspase-3識別并水解，進而誘導細胞發生焦亡，其過程與GSDMD介導的焦亡途徑類似。此外，Orning等[6]和Sarhan等[7]也發現Yersinia菌感染巨噬細胞后，caspase-8可以水解GSDMD引起細胞焦亡。以上研究結果都證實了決定細胞是否發生焦亡的不是caspase的種類，而是有GSDMs的參與。

既往對于細胞焦亡的研究通常都是以巨噬細胞參與為主，Shao等[8]發現細胞毒性淋巴細胞如CTLs、NK細胞中的顆粒酶A(granzyme A, GZMA)可經這些細胞釋放的穿孔素進入靶細胞，進而水解GSDMB分子中的Lys229/244位點，引起靶細胞的焦亡，并且這種焦亡不受炎性caspase抑制劑的影響。

2 細胞焦亡與重癥COVID-19的關系

SARS-CoV-2屬于冠狀病毒科β冠狀病毒屬，是一種有包膜的單正鏈RNA病毒[9]，現已發現有α、β、γ、δ、λ等亞型，可導致COVID-19。盡管到目前為止COVID-19的確切發病機制仍不清楚，但已有大量研究表明細胞焦亡(尤其是最經典的caspase-1-GSDMD途徑)參與了重癥COVID-19及其并發癥的發生與發展，且焦亡通路上的一些關鍵分子與病情的變化密切相關。

2.1 細胞焦亡與SARS-CoV-2感染的關系SARS-CoV-2通過與Ⅱ型肺泡上皮細胞和呼吸道上皮細胞表達的血管緊張素轉換酶2(angiotensin converting enzyme 2，ACE2)結合而進入人體，觸發腎素-血管緊張素-醛固酮系統(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)，使正常的肺部細胞受損，在肺臟中產生大量的PAMPs和DAMPs，從而驅動炎癥性巨噬細胞活化NLRP3炎癥小體[10]。NLRP3的活化可導致細胞焦亡，而細胞焦亡的發生則又可加重SARS-CoV-2感染的嚴重程度，使COVID-19患者向著重癥方向發展。有證據顯示，重癥COVID-19患者的肺臟組織和血清中可檢測到IL-1β、IL-6、TNF-α等細胞因子水平的顯著升高[11]，而細胞焦亡的產生也伴隨著大量炎性細胞因子的釋放，這證實了SARS-CoV-2在肺泡巨噬細胞中誘導炎癥小體NLRP3的激活和細胞焦亡，可加重肺炎癥狀，包括引起急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)和細胞因子釋放綜合征(cytokine release syndrome，CRS)，且與COVID-19的不良預后有著密切關系。

2.2 細胞焦亡在ARDS中的作用機制ARDS是SARS-CoV-2感染的主要并發癥之一，是全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)的肺部表現。ARDS的具體發病機制尚未闡明，但其本質是多種炎癥細胞及其釋放的炎性介質和細胞因子間接介導的肺部炎癥反應，其病理特點是強烈且迅速的固有免疫反應，觸發Nod樣受體家族并激活NLRP3炎癥小體信號通路，繼而引發細胞焦亡和釋放促炎細胞因子IL-6/IL-1β。

有研究表明，NLRP3炎癥小體和IL-1β在介導ARDS相關炎癥中發揮重要作用[12]。與健康對照組相比，ARDS患者的支氣管和血漿中的IL-1β水平顯著升高，且與更差的臨床預后具有相關性。在其他冠狀病毒(如MERS-CoV和SARS-CoV)和呼吸道病毒感染中，ARDS患者的IL-1β、IL-6和IL-8水平同樣很高[13]。在動物研究中，缺乏炎癥小體的小鼠肺損傷概率減少且存活率升高[14]。

綜上作為細胞焦亡主要標志物的IL-1β等促炎細胞因子可能在ARDS的發生發展中起著關鍵作用，因此，抑制此類細胞因子可能會導致NLRP3信號通路和細胞焦亡的發生減少，從而減輕與重癥COVID-19相關的ARDS癥狀。

2.3 細胞焦亡在CRS中的作用機制CRS也被稱為細胞因子風暴，是一種全身炎癥反應，可由感染或藥物等多種因素誘發。SARS-CoV-2感染的重癥患者常常伴隨著CRS的出現，發生CRS的患者血漿細胞因子水平顯著升高，包括IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-1RA、CXCL10等[15]，這些炎性細胞因子主要由活化的巨噬細胞釋放。

有研究表明，COVID-19患者外周血中單核細胞是炎性的，且肺臟中有單核/巨噬細胞浸潤[16]，而NLRP3炎癥小體的激活主要發生在巨噬細胞中。IL-1β和IL-6是細胞因子風暴中常見的促炎細胞因子，對COVID-19引起細胞因子風暴的患者使用IL-1β受體拮抗劑阿那白滯素(anakinra)或抗IL-6受體的托珠單抗(tocilizumab)，病情能夠得到明顯的改善[17]，而IL-1β和IL-6是細胞焦亡釋放的主要細胞因子。在COVID-19患者的肺臟組織中，調控ROS積累、NOD樣受體信號、病毒感染相關受體信號、低氧信號、代謝失調的基因表達上調，而ROS、病毒感染相關受體信號和代謝失調都屬于細胞內的內源性危險信號(DAMPs)，可活化NLRP3炎癥小體[18]。這些都表明SARS-CoV-2感染觸發了體內的DAMPs并激活NLRP3炎癥小體，導致caspase-1-GSDMD介導的細胞焦亡發生，且與CRS的發生有關。

上述結果表明，SARS-CoV-2感染使患者肺臟中的炎性巨噬細胞接受到各種危險信號，并通過GSDMD介導的細胞焦亡來啟動細胞因子風暴，使重癥COVID-19患者出現CRS等并發癥。故針對caspase-1-GSDMD焦亡通路的藥物將有可能逆轉重癥COVID-19患者的病情，使其向好的方向發展。

3 針對細胞焦亡途徑治療重癥COVID-19

目前用于治療重癥COVID-19的一線藥物仍為糖皮質激素地塞米松，糖皮質激素是具有強大的抗炎、抗休克等廣泛作用的免疫抑制藥物，對嚴重的急性病毒感染類疾病療效較好，但在治療疾病的同時對患者的免疫功能會造成一定的影響，且其副作用較大，可能會引起患者消化道出血、骨質疏松等不良反應。由于細胞焦亡參與了SARS-CoV-2感染與COVID-19疾病的發生發展，故針對細胞焦亡通路上一些關鍵分子開發合適的藥物將是治療重癥COVID-19值得考慮的方向。以SARS-CoV-2介導的經典caspase-1-GSDMD焦亡途徑為例，現已研究出許多藥物可針對其通路上的關鍵分子發揮治療重癥COVID-19的作用，見Fig 1。

3.1 作用于NLRP3炎癥小體NLRP3炎癥小體處于經典細胞焦亡caspase-1-GSDMD通路的上游，NLRP3的活化與細胞焦亡的發生有著密切的關系。因此，多項研究表明作用于NLRP3的藥物在治療重癥COVID-19中發揮著極大作用。

NLRP3的各種專用抑制劑可以直接靶向NLRP3核心蛋白或其成分，也可以間接抑制NLRP3，例如抑制其上游的ASC或下游的caspase-1。已有一些對NLRP3炎癥小體活性具有調節作用的藥物目前正在臨床試驗中被評估為COVID-19的治療方法。

曲尼司特(tranilast)是一種對NLRP3具有直接抑制作用的色氨酸類似物，可通過結合NLRP3的NACHT結構域并抑制NLRP3-NLRP3的直接相互作用，以阻止NLRP3寡聚和激活,且對AIM2和NLRC4等其他炎癥小體的激活無影響[19]。目前曲尼司特正在COVID-19患者中進行隨機對照試驗(在中國臨床試驗注冊處注冊號：ChiCTR2000030002)，因為具有廣泛的治療效果和較小的副作用,其或將成為COVID-19合并癥患者較有效的干預藥物[2]。

此外，Ⅰ型干擾素(IFN-Ⅰ)和NLRP3炎癥小體之間的交叉調節通過還未定義的機制參與了對SARS-CoV-2相關ARDS的免疫抑制引起的促炎反應[11]。早期IFN-Ⅰ給藥可治療性調節NLRP3，并已證明可以消除SARS-CoV感染的獼猴[20]和小鼠[21]的臨床癥狀。在一項小型隊列SARS-CoV試驗中，皮質類固醇-IFN-Ⅰ雙重聯合治療在小鼠、獼猴和人類中都能觀察到較好的治療效果，盡管病毒載量不變[22]。

3.2 作用于炎性細胞因子及其受體SARS-CoV-2導致的一系列嚴重疾病都是由大規模炎癥反應介導的，而細胞焦亡的典型特征之一是伴有大量促炎細胞因子的釋放，與細胞因子釋放綜合征(CRS)及其引起的急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)的發生密不可分。有嚴重并發癥的COVID-19患者血清中可檢出IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等細胞因子，靶向這些促炎細胞因子以及其受體的治療效果已在實驗和臨床中得到證實。

IL-1受體(IL-1R)拮抗劑阿那白滯素(anakinra)廣泛用于改善CAR-T細胞療法導致的CRS，并且有研究顯示其還能夠抑制NLRP3炎癥小體過度活躍，進而提高SARS-CoV-2感染小鼠的存活率[23]。在一項回顧性分析中，靜脈注射大劑量阿那白滯素可極大改善COVID-19急性呼吸窘迫綜合征患者的臨床癥狀和生存率[24]。IL-6和IL-6受體(IL-6R)阻斷劑也均已用于臨床治療CRS[23]。司妥昔單抗(siltuximab)是一種直接靶向IL-6的藥物，通過直接結合IL-6，從而抑制IL-6與靶細胞結合以達到緩解IL-6所帶來的炎癥效應[25]。托珠單抗(tocilizumab)是一種IL-6R阻斷抗體，通過結合IL-6R以阻斷其與IL-6的結合，抑制下游信號通路，以緩解體內高炎癥水平，已在CAR-T細胞療法和SARS-CoV-2感染中用于治療嚴重CRS[11]。

另外，谷氨酸衍生物沙利度胺(thalidomide)對TNF-α、IL-6等炎性細胞因子也有著較好的抑制作用，同時有助于促進T細胞增殖。Li等[26]發現沙利度胺聯合糖皮質激素治療可抑制炎性細胞因子IL-6和TNF-α的產生，改善COVID-19重癥患者臨床癥狀，與單純地塞米松對照組相比，沙利度胺(100 mg·d-1)聯合地塞米松有效縮短了住院時間和SARS-CoV-2陽性轉陰性所需的時間，IL-6和TNF-α的水平也有明顯下降。

3.3 抑制GSDMD由于SARS-CoV-2感染與NLRP3炎癥小體的激活密切相關，而NLRP3是細胞焦亡經典caspase-1-GSDMD的上游物質，故直接靶向GSDMD或將成為治療COVID-19的有效方法，并且通過直接抑制細胞焦亡的最終效應分子GSDMD，可降低NLRP3炎癥小體介導的細胞焦亡水平和減少細胞因子的釋放以限制細胞內的病毒復制，而對炎癥小體介導的細胞凋亡無明顯影響。

膿毒癥(sepsis)是一種由于病原微生物感染而引起的宿主抗感染免疫功能失調所致的系統性炎癥反應綜合征，與炎性細胞死亡過程即細胞焦亡緊密相關。膿毒癥病情進展迅速，死亡率可高達50%，膿毒癥休克也是重癥COVID-19患者的主要臨床癥狀之一。目前，針對COVID-19繼發的膿毒癥的臨床治療手段仍十分有限，主要依賴于抗病毒藥物和臨床重癥監護。Liu等[27]通過脂質體滲漏實驗體統對大量小分子化合物進行了高通量篩選，發現了能夠靶向GSDMD的小分子抑制劑雙硫侖(disulfiram)。該研究發現雙硫侖并不影響炎性caspase對GSDMD的剪切，但可以對GSDMD的191位半胱氨酸殘基進行修飾，以直接抑制經剪切活化后GSDMD-N端結構域的成孔活性，并在膿毒癥小鼠模型中證明了雙硫侖對該類疾病的緩解效果。這一研究為膿毒癥以及其他重癥COVID-19并發癥相關藥物的研發開拓了新的前景。

3.4 天然藥物治療重癥COVID-19抑制NF-κB介導的炎癥途徑可以提高SARS-CoV感染小鼠的生存能力，天然多酚類黃酮類化合物是一組天然的多酚分子，具有多種生物活性，包括抗氧化作用，如植物倍半萜內酯小白菊內酯、水飛薊素等，都能抑制NF-κB途徑，從而阻止NLRP3激活的啟動步驟和炎癥細胞因子的轉錄，以降低COVID-19患者體內的細胞焦亡水平。

Talita等[28]發現，槲皮素(quercetin)通過防止ASC寡聚化抑制NLRP3和AIM2炎癥小體并以劑量依賴的方式抑制IL-1β的分泌。另外，Jeremy等[29]在傳統中草藥(如菝梗的根)中發現的另一種植物衍生的去氫木香內酯(denydcrostus lactone)，也可通過阻斷ASC寡聚化來抑制NLRP3炎性小體的活性，同時還減少了中性粒細胞的募集。Kim等[30]發現從水飛薊中提取的水飛薊素(silymarin)能抑制脂多糖(LPS)誘導的小鼠巨噬細胞RAW264.7的形態學改變，且能抑制NF-κB的反式激活活性，這對降低巨噬細胞激活相關的細胞焦亡和炎癥細胞因子的基因表達是十分重要的。

Fig 1 Pyroptosis pathway of caspase-1-GSDMD induced by SARS-CoV-2 and its drug targets

4 總結

隨著細胞焦亡通路中的分子及其下游事件的機制被逐步解析，近幾年國內外相關的研究工作日益增多，該領域蘊藏著巨大的前景，并且細胞焦亡的角度有望逐漸解決COVID-19治療、腫瘤免疫治療、心血管疾病治療等過程中產生的一系列問題。但在細胞焦亡這條道路上需要研究的還不僅于此，目前仍存在著許多難以解釋的現象。隨著人們對焦亡分子機制認識的不斷更新，焦亡通路中的關鍵分子需要被重新審視，相同的分子在不同GSDMs誘導的焦亡途徑中可能發揮著不同的作用，并且是否存在著更多不同分子參與的焦亡通路也值得深入思考。

對于目前流行全球的2019冠狀病毒病(COVID-19)，使用針對NLRP3以及其他細胞焦亡通路中的關鍵分子相應的抑制劑是很有前景的干預措施，但免疫系統的功能性和平衡性對于感染的控制和病原體的清除同樣至關重要。另外，細胞焦亡的抑制劑與其他一些藥物聯合使用的有效性值應得到重視，且具有抗炎特性的天然藥物對治療重癥COVID-19也極具潛力。