替米沙坦對大鼠胰島素分泌作用的影響及其機制研究

崔麗娟，楊歡歡，支淋萍，劉 濤，3

(山西醫科大學基礎醫學院1.機能實驗室、2.藥理教研室，山西 太原 030001，3.山西白求恩醫院，山西醫科大學第三醫院普通外科，山西 太原 030032)

替米沙坦是經典的血管緊張素受體阻斷劑，在臨床上廣泛用于高血壓病和心力衰竭的治療[1]。近年來，大量的文獻表明，替米沙坦可以使糖尿病病人獲益，機制包括保護胰島β細胞功能[2]，緩解周圍胰島素抵抗[3]，改善糖尿病腎病[4]，抑制高血糖的引起的心血管損害[5]，改善肥胖病人的能量代謝，維持瘦素的敏感性[6]，減輕高糖帶來的抑郁[7]等。2型糖尿病以胰島素分泌不足和胰島素抵抗為主要特征，其中胰島素分泌不足被認為是決定糖尿病發生發展的重要因素。但是，目前替米沙坦可以調控胰島素分泌，直接影響胰島素的分泌卻鮮有報道。本研究旨在研究替米沙坦對胰島素分泌的影響，同時由于β細胞的胰島素分泌是電生理過程[8]，我們通過鈣成像及膜片鉗技術進一步研究其相關的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 ♂Wistar大鼠，體質量為(240～260)g，清潔級，由山西醫科大學實驗動物中心提供。生產許可證號：SYXK (晉)2019-0007。

1.1.2藥品及試劑 替米沙坦，美國MCE公司(批號144701-48-4)；膠原酶P(collagenase P)：瑞士Roche公司(批號11213865001)；Histopaque-1077：美國Sigma-Aldrich公司(RNBJ0578)；Fluo-2AM染料：日本同仁化學研究所(批號11213865001)；RPMI 1640培養基：上海生工(批號C518FA0002)；胎牛血清：上海生工(批號B326FA0092)。

1.1.3實驗儀器 體式顯微鏡：上海中恒(型號SM262)；倒置顯微鏡：日本OLYMPUS(型號AE-2000)；CO2細胞培養箱，德國Eppendorf(型號Galaxy 170)；電極拉制儀：日本Narishige(型號PB-830)；膜片鉗系統：德國HEKA(型號MP-285)；鈣成像系統：北方MDE公司(型號LAMBDA 10-B)。

1.2 實驗方法

1.2.1大鼠胰島及胰島細胞的分離與培養 斷頭處死大鼠后迅速打開腹腔，經膽總管向胰管內注入1 g·L-1的膠原酶P，將膨脹的胰腺完整剝離后置于37 ℃恒溫振蕩器中水浴消化11 min。培養液終止消化后加入Histopaque-1077分離液，梯度離心法分層制得大鼠胰島。在體式顯微鏡下挑取形態飽滿、大小適中的胰島。在含胰島的培養液中加入5 g·L-1DispaseⅡ溶液分離胰島制得胰島細胞。大鼠胰島和胰島細胞均在含10%胎牛血清和青鏈霉素的RPMI 1640培養液中，置于37 ℃含5% CO2的細胞培養箱中培養。方法參考實驗室傳統成熟技術[9]。

1.2.2胰島素分泌實驗 將分離出的胰島培養過夜后，根據實驗目的分組，每組7管，每管放置挑選好的大小均等的胰島5個。首先各組胰島在含2.8 mmol·L-1葡萄糖的培養液中預孵育30 min，棄去上清液。再加入含不同葡萄糖濃度和藥物的培養液繼續孵育30 min，取上清液采用放射免疫法測定胰島素含量。

1.2.3鈣成像實驗 將分離好的胰島細胞置于載玻片上，在培養皿中用配好的含2.8 mmol·L-1葡萄糖和2 μmol·L-1Fura-2AM(鈣離子熒光指示劑)的培養液中避光孵育30 min，清洗去除多余的染液，避光轉移至含2.8 mmol·L-1葡萄糖培養液的鈣離子成像系統的浴槽中。激發光波長分別設置為340 nm和380 nm，發射光波長設置為510 nm，熒光值F340/F380的改變即反映出細胞內鈣離子濃度的變化。分別用含不同濃度的葡萄糖和藥物的培養液干預細胞，觀察細胞內熒光值比值隨時間的變化情況。

1.2.4膜片鉗實驗 配置相應離子通道的電極內外液。電壓門控性鉀(Kv)通道電極內液各成分濃度依次為(mmol·L-1)：NaCl 10，KCl 140，MgCl 1，EGTA 0.05，HEPES 10，Mg-ATP 0.3；外液為NaCl 138，KCl 5.6，MgCl21.2，CaCl22.6，HEPES 5。電壓門控性鈣通道(VGCC)的電極內液：CsCl 120，MgCl21，EGTA 0.05，TEA 20，HEPES 10，CAMP 0.1，Mg-ATP 5；外液為CsCl，NaCl 100，BaCl220，MgCl21，TEA 20，HEPES 5。用電極拉制儀和拋光儀制備電極，電阻大小為5～8 MΩ，充灌相應的電極內液，高阻封接后破膜，改為全細胞模式，快電容補償。設置鉗制電壓為-70 mV，刺激步階為10 mV，Kv通道序貫給予-70 mV到+80 mV的電壓刺激，刺激時程為400 ms，VGCC則給予-50 mV到+30 mV的電壓刺激，刺激時程為50 ms，記錄時程內的各通道的電流變化。

2 結果

2.1 替米沙坦對離體大鼠的胰島素分泌的影響如Tab 1所示：不同濃度的(10、50 μmol·L-1)的替米沙坦在低葡萄糖濃度(2.8 mmol·L-1)下對離體大鼠的胰島素分泌沒有影響，但在高葡萄糖濃度下(8.3 mmol·L-1)卻表現出藥物濃度依賴性的促胰島素分泌作用。進一步我們在更高的葡萄糖濃度(11.1和16.7 mmol·L-1)下，采用10 μmol·L-1的替米沙坦干預，Tab 2顯示隨葡糖糖濃度的升高，替米沙坦的促胰島素分泌作用逐漸增強。

Tab 1 Effect of telmisartan on insulin secretion

Tab 2 Insulin secretion glucose-dependently potentiated

2.2 替米沙坦對胰島β細胞內Ca2+濃度的影響分別在低(2.8 mmol·L-1)和高(16.7 mmol·L-1)葡萄糖濃度下鈣成像實驗，Fig 1結果表明，在低糖濃度下濃度逐漸增高的替米沙坦并沒有提高胰島β細胞內的Ca2+濃度，而作為陽性對照的Tolbutamide卻出現了明顯的Ca2+濃度升高。在高糖濃度替米沙坦可以升高細胞內的Ca2+濃度，且隨著替米沙坦劑量的逐漸增大(10、50 μmol·L-1)，升鈣作用逐漸增強(Fig 2)。

Fig 1 Effect of telmisartan on intracellular Ca2+concentration ([Ca2+]i) in low glucose condition

Fig 2 Effect of telmisartan on intracellular Ca2+concentration([Ca2+]i)in high glucose condition

2.3 替米沙坦對胰島β細胞Kv通道的作用分別用不同劑量的替米沙坦行膜片鉗實驗，比較Kv通道電流-電壓曲線中各組細胞在+80 mV時的電流密度。結果顯示：10 μmol·L-1和50 μmol·L-1替米沙坦對胰島β細胞的Kv通道具有明顯的抑制作用(見Tab 3)。

2.4 Kv通道不是替米沙坦發揮作用的唯一因素在高糖濃度(8.3 mmol·L-1)下，采用Kv通道的抑制劑TEA(20 mmol·L-1)行胰島素分泌實驗，可以看出TEA明顯促進了胰島素分泌(P<0.01)，但是，10 μmol·L-1的替米沙坦在TEA存在的情況下仍然可以明顯地促進胰島素分泌(P<0.01)，這表明Kv通道不是替米沙坦促進胰島素分泌的唯一因素(見Tab 4)。

Tab 4 Kv channels not alone involved in mediating telmisartan-induced insulin secretion(μIU·L-1)

2.5 替米沙坦對胰島β細胞VGCC的作用進一步行VGCC的膜片鉗實驗，觀察替米沙坦對其的作用。電流-電壓曲線中在0 mV時各組細胞的電流密度比較表明，隨著劑量的逐漸增加，替米沙坦顯示出逐漸增強的激活β細胞VGCC的作用(Tab 5)。

3 討論

糖尿病和高血壓是臨床上最為常見的兩種疾病，而且它們之間通過多種病理生理機制相互聯系，形成惡性循壞，導致較高的死亡率和發病率，嚴重威脅人類的健康。由于血管緊張素受體阻滯劑可以使糖尿病和糖尿病前期的患者獲益，因此被美國糖尿病協會等機構推薦作為糖尿病合并有高血壓的病人降壓治療的一線藥物[10]。但目前尚未見到關于此類藥物對胰島素分泌作用影響的報道。即使有可見的有關替米沙坦促進胰島素分泌的文獻，也僅僅是替米沙坦由于抑制高糖引起的炎癥反應和氧化應激，進而避免胰島β細胞功能失衡，抑制β細胞凋亡的長期保護作用的結果[2，11]。本次研究我們首次發現替米沙坦作為胰島素促泌劑，可以“急性”地促進胰島素分泌。

本實驗表明，替米沙坦不僅可以迅速地促進胰島素的分泌，而且更為關鍵的是，這種促分泌作用是葡萄糖濃度依賴性的，即只在高糖濃度下發揮作用，低糖濃度下無促進作用。這說明替米沙坦可以在促進胰島素分泌的前提下最大可能地避免低血糖的發生。低血糖是目前糖尿病治療過程中最為常見也是最為嚴重的并發癥；不僅僅是因為通常所認識的“顯性”的低血糖可以引起昏迷和神志不清，影響日常生活，更為重要的是反復的“隱匿”的低血糖可以引起一些致死性的心臟并發癥，如心律失常、心肌缺血梗死，而且引起神經認知系統的損害，可能加劇中老年糖尿病人發生癡呆的風險[12]。所以，避免低血糖并發癥的發生，目前成為評價治療糖尿病藥物的一個重要指標[13]。同時目前關于“胰島素的過分泌”的理論逐漸受到重視，很多文獻指出持續地促進胰島素的分泌，具有潛在的加劇胰島β細胞功能惡化的趨勢，有可能加速2型糖尿病的進程[14]。臨床報道也證實如甲苯磺丁脲一類的葡萄糖濃度非依賴性的胰島素促泌劑，確實存在比其它如格列本脲、二甲雙胍等抗糖尿病藥物整體長期療效差的不足[15]。而我們的實驗結果表明，替米沙坦可以在適當的時候根據葡萄糖濃度的需要成比例地“智能化”促進胰島素的分泌，這無疑可以最大程度地避免以上弊端。

細胞內鈣離子濃度在胰島β細胞分泌胰島素中發揮著重要作用，包括胰島素的合成、分泌[8]。我們進一步研究了替米沙坦與胰島β細胞內鈣離子濃度的關系，與其促胰島素分泌作用一致，只有在高糖濃度下才可見明顯的升高細胞內鈣離子濃度，且隨著藥物濃度的增高，細胞內的鈣離子濃度進一步升高。β細胞分泌胰島素是一個電生理過程。考慮到Kv通道在葡萄糖濃度依賴性地促進胰島素分泌和提高細胞內鈣離子濃度中起重要作用[16-18]，所以進一步我們用膜片鉗技術探索替米沙坦對Kv通道的影響，結果表明替米沙坦確實抑制Kv通道的電流。高糖濃度下，葡萄糖代謝轉化為ATP濃度的升高，使得ATP/ADP 比例升高，這會導致β細胞的KATP通道關閉，引起細胞膜去極化。細胞的去極化會同時激活細胞的Kv通道和鈣通道，引起鉀離子外流和鈣離子內流，這兩種電流相互對抗共同構成了細胞的復極化階段[16，18]。抑制Kv通道影響分泌和鈣離子濃度的機制在于其可以延緩鉀離子外流，削弱對鈣離子內流的對抗而延長復極化的時間，也就是鈣內流的時間，因而提高了鈣離子濃度，促進了胰島素的分泌。

TEA是Kv通道的抑制劑，文獻報道20 mmol·L-1的TEA可以抑制幾乎85%～90%的鉀電流，從而促進胰島素分泌[17]。但我們的實驗卻表明，即使在TEA顯著提高細胞內鈣離子濃度，促進胰島素分泌的基礎上，替米沙坦仍然可以繼續發揮作用，這表明Kv通道不是替米沙坦發揮作用的唯一因素。隨之的結果也表明了這一點，替米沙坦還可以激活VGCC。正是因為鉀通道和鈣通道的激活均必須在高糖狀態下關閉KATP通道引起細胞去極化的前提下，所以替米沙坦的電生理特征，即抑制Kv通道延長鈣內流的時間，激活鈣通道促進鈣內流，決定了替米沙坦促進胰島素分泌的葡糖糖濃度依賴性。

作用于胰島β細胞的KATP通道、Kv通道和VGCC這三種通道的藥物都會影響胰島素的分泌。而關閉KATP通道的藥物如臨床中常見的磺酰脲類降糖藥，其促進胰島素分泌的途徑繞過了細胞內葡萄糖代謝這一環節，降糖作用不依賴于體內的血糖水平。而由于本實驗中，替米沙坦在低糖濃度(2.8 mmol·L-1)下沒有增強胰島素分泌(Tab 1，2)。另外，在低糖濃度下亦未增加β細胞內的鈣離子濃度，而作為陽性對照的KATP通道阻斷劑的磺酰脲類藥物甲苯磺丁脲干預后，卻明顯升高了β細胞內的鈣離子水平(Fig 1)。這亦說明替米沙坦和甲苯磺丁脲作用于不同的靶點。

綜上，本實驗表明，替米沙坦通過影響β細胞的離子通道而發揮與既往文獻不同的調控胰島素分泌的作用，這為替米沙坦在治療糖尿病中的應用展示了一個新的視野。同時，令我們感到欣喜的是，替米沙坦的促分泌作用是葡糖糖濃度依賴性的，不會出現一般的降血糖藥物的“低血糖”和引起“胰島細胞過度分泌”的副作用，這也將為葡萄糖濃度依賴性胰島素促泌劑的開發提供了一個新的思路。