1，25-二羥維生素D3通過NLRP3/caspase-1/GSDMD信號軸干預中性粒細胞性哮喘

張景鴻，韋麗瑩，陳一平

(1.廣西醫科大學第二附屬醫院急診科，廣西 南寧 530007；2.廣西醫科大學附屬民族醫院全科醫學科，廣西 南寧 530001)

支氣管哮喘是呼吸道常見的慢性疾病，近年來其發病率有上升趨勢。哮喘也是一種異質性疾病，具有復雜的病理生理機制和不同的表型。根據支氣管哮喘氣道炎癥特征的不同將支氣管哮喘分為嗜酸性粒細胞性哮喘和非嗜酸性粒細胞性哮喘，非嗜酸性粒細胞性哮喘中以中性粒細胞氣道浸潤為主的稱為中性粒細胞性哮喘(neutrophilic asthma，NA)。中性粒細胞性哮喘對糖皮質激素治療不敏感，是非嗜酸性粒細胞性哮喘中最主要的類型，需要進一步探索其機制并尋找針對性的治療方案。

維生素D3是一種脂溶性維生素，可調節鈣磷代謝。研究發現，維生素D3具有免疫調節作用。流行病學方面的調查已觀察到維生素D缺乏與哮喘發作之間的相關性，我們的實驗也發現血清維生素D3濃度降低和肥胖哮喘的癥狀表現相關，和NLRP3炎性小體的活性也有相關性[1]。炎性小體是一種細胞內多聚體蛋白復合物，可以識別應激相關的內源性信號分子并參與先天免疫系統的激活。已證明NLRP3炎性小體在中性粒細胞哮喘的發病機制中起重要作用。NLRP3炎性小體活化過程中，促進細胞因子IL-18和IL-1β分泌，同時誘導caspase-1依賴的細胞焦亡。細胞焦亡主要由casepase-1、gasdermin D (GSDMD)介導。GSDMD是casepase-1的底物，經切割形成的GSDMD-N端通過寡聚化在細胞膜上形成孔洞，導致細胞裂解死亡，并釋放炎癥因子，級聯放大炎癥反應。維生素D3具有抗炎、免疫調節作用，可用于哮喘控制，但其作用機理尚不清楚。本研究通過制作中性粒細胞性哮喘小鼠模型，使用1，25-二羥維生素D3[1，25-(OH)2D3]進行干預，觀察NLRP3、caspase-1、GSDMD蛋白表達、炎性細胞因子分泌及哮喘氣道炎癥表現，探討1，25-(OH)2D3治療中性粒細胞性哮喘的效果及作用機制。

1 材料與方法

1.1 試劑雞卵清蛋白(OVA，Grade V，美國Sigma公司，# A5503)，氫氧化鋁凝膠(美國Sigma公司，# 1017502)，小鼠IL-17、IL-1β、IL-18酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測試劑盒(美國R&D公司，# MHS170、#MLB00C、#DY7625-05)，蘇木精-伊紅染液試劑盒(江蘇凱基生物技術股份有限公司KGA224)，瑞氏染色液，小鼠抗Ly6G抗體(美國Thermo Fisher scientific公司，Thermo 14-5931-82)，Western blot檢測試劑盒(江蘇凱基生物技術股份有限公司，# KGP1201)，Anti-GAPDH(江蘇凱基生物技術股份有限公司，# KGAA002)，Anti-cleaved caspase-1、Anti-GSDMD、Anti-NLRP3抗體(美國Cell Signaling Technology公司，#89332S、#93709S、#15101S)

1.2 儀器多功能酶標儀(美國 MD Spectramac M3)，電泳儀(美國Bio-Rad Power Supplies Basic)，Trans-Blot Turbo全能型蛋白轉印系統(美國Bio-Rad 170-4150)，凝膠成像系統(英國SYNGENE G，BOXChemiXR5)，病理圖像分析系統(德國Leica公司)，5810R高速低溫離心機(德國Eppendorf 5810R)，超聲霧化器及自制霧化吸入箱等。

1.3 方法

1.3.1實驗動物和分組 BALB/c♀小鼠，無特定病原體(SPF)級，4～6周齡，體質量(20～25)g。由廣西醫科大學實驗動物中心提供并飼養于SPF級屏障系統內。動物飼養及實驗方案均嚴格按照廣西醫科大學動物倫理委員會動物實驗規范執行。許可證號：SCXK(桂)2020-0003。動物分組與模型制備：將24只BALB/c雌鼠隨機(隨機數字表法)分為3組：正常對照組(A)、模型組(B)、VD3治療組(C)，每組8只。B組和C組采取卵清蛋白結合脂多糖的方法制作小鼠中性粒細胞性哮喘模型。適應性喂養后，每只小鼠分別于d 0、d 7和d 14給予雞卵清蛋白(OVA)混懸液(25 μg OVA和1 mg氫氧化鋁混合于0.2 mL的PBS液中)腹腔注射致敏。正常對照組以等量PBS代替致敏原腹腔注射。OVA致敏后，d 21開始行激發。將小鼠置于密閉容器中，給予2%OVA磷酸鹽緩沖液20 mL霧化刺激，每天1次，連續7 d，每次20 min。正常對照組以PBS代替行霧化刺激。用LPS誘導中性粒細胞性炎癥，每只小鼠于d 21、22、23、25、27在OVA激發之前30 min予以LPS 10 μg鼻腔滴入給藥。C組另予以0.1%的1，25-(OH)2D3，按4 μg·kg-1在每次氣道給予LPS激發前1 h腹腔注射。

1.3.2氣道反應性測定 使用美國BUXCO公司TBL3999雙腔體積描記系統進行無創氣道反應性測定，于末次激發24 h后測定小鼠氣道阻力，以乙酰甲膽堿相應濃度激發下的特殊氣道阻力(sRaw)平均值與PBS激發下的特殊氣道阻力平均值來反映，公式為：sRaw值=Mch sRaw值-PBS sRaw值，單位為：cmH2O。將小鼠放入密閉艙內適應時間為5 min，以PBS4和12.5、25、50 g·L-13個乙酰甲膽堿的濃度進行激發霧化，記錄數據，分析小鼠氣道反應性。

1.3.3標本收集 小鼠于最后1次氣道激發后24 h，處死收集標本，使用500 μL冰PBS灌洗肺3次，收集支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)。將BALF的上清液保存在-20 ℃供檢測細胞因子。收取肺組織，右肺組織福爾馬林固定，以進行病理檢查；左肺葉保存在-80 ℃低溫冰箱，用于Western blot分析。

1.3.4炎癥細胞計數 將BALF懸浮液的上清液用于檢測細胞因子。剩余的細胞沉淀重懸于200 μL PBS中。用血細胞計數器測定50 μL細胞懸液，計數細胞總數。另一部分懸液進行離心重懸，行瑞氏染色，每張玻片至少計數200個炎癥細胞，根據形態學標準和染色特性，按嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞進行細胞分類；由3位病理科醫師進行盲法閱片，取平均值。

1.3.5肺組織病理 肺組織用4%多聚甲醛固定并進行石蠟包埋，4 μm連續切片，脫蠟后分別進行用蘇木精伊紅(HE)和阿辛藍-過碘酸雪夫(AB-PAS)染色，觀察小鼠肺部炎癥細胞浸潤、氣道黏膜上皮中杯狀細胞增生和黏液分泌情況，用于評估肺組織的病理變化。

1.3.6細胞因子IL-1β、IL-18、IL-17水平 ELISA法檢測BALF中IL-1β、IL-18、IL-17細胞因子濃度，根據說明書提供的方法嚴格操作。終止反應后，用酶標儀檢測450 nm波長吸光度值(OD值)，繪制標準曲線，根據標準曲線計算出細胞因子IL-1β、IL-18、IL-17濃度。

1.3.7肺組織切片免疫組化染色測定中性粒細胞浸潤情況 免疫組化法檢測中性粒細胞表面抗原Ly6G表達。常規脫蠟至水,pH 9.0的抗原修復緩沖液覆蓋切片，微波加熱10 min修復抗原。用配制好的3%過氧化氫(H2O2)溶液浸泡10 min以阻斷內源性過氧化物酶。5%牛血清蛋白(BSA)室溫封閉切片1 h進行血清封閉。小鼠Ly6G抗體(1 ∶50)4 ℃下孵育過夜(15 h)。加HRP標記的山羊抗兔二抗，室溫孵育1 h。DAB顯色試劑盒顯色，然后蘇木素復染2 min，水洗返藍。常規脫水、二甲苯透明、中性樹膠進行封固。在顯微鏡下鏡檢觀察染色結果并采集圖像。

1.3.8Western blot檢測NLRP3、caspase-1和GSDMD蛋白 Western blot檢測肺組織NLRP3、caspase-1和GSDMD蛋白水平的表達變化。肺組織加入含蛋白酶抑制劑的cocktails裂解細胞。胞質蛋白的提取按照試劑盒的操作步驟進行。采用Bradford法測定蛋白濃度。并獲取20 μL蛋白用于SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，隨后采用半干轉印方法將其轉印至硝酸纖維素膜上。纖維素膜用5%牛血清白蛋白室溫封閉2 h，隨后分別用相應的一抗和二抗孵育，ECL顯影、拍照。用圖像分析系統分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內參蛋白GAPDH條帶灰度值的比值反映蛋白表達水平。

2 結果

2.1 小鼠氣道反應性測定結果3組小鼠經無創肺功能檢測，中性粒細胞性哮喘模型組在不同濃度Mch激發時(12.5、25、50 g·L-1)，氣道反應性均高于對照組小鼠，其sRaw增長值與對照組小鼠差異均具有統計學意義(P<0.05)；1，25-(OH)2D3治療組小鼠在25 g·L-1和50 g·L-1Mch的濃度激發下，其氣道反應性較模型組小鼠有明顯下降，sRaw增長值差異有統計學意義(P<0.05)，見Fig 1。

Fig 1 Airway hyper-responsiveness test results

2.2 BALF中細胞分類計數中性粒細胞性模型組BALF中細胞總數、嗜酸性粒細胞和中性粒細胞細胞比例明顯增高，與正常對照組比較，差異有統計學意義(P<0.01)；1，25-(OH)2D3治療組細胞總數、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞比例較模型組降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見Fig 2。

Fig 2 Bronchoalveolar lavage fluid cell counts

2.3 支氣管肺組織病理觀察小鼠肺組織經HE染色以及阿辛藍-過碘酸雪夫(AB-PAS)染色：對照組可見肺泡壁及支氣管結構完整，上皮黏膜完整，杯狀細胞少見，管腔內無粘性分泌物，肺泡壁無明顯增厚，肺小血管壁無增厚，肺泡間、氣道周圍無炎癥細胞浸潤。中性粒細胞性哮喘模型組可見肺臟結構破壞，肺泡壁明顯增厚和肺泡大小不一致，支氣管管腔內充滿分泌物，可見支氣管上皮出現脫落；血管和支氣管周圍有較多炎性細胞浸潤，肺泡及間質充血明顯，有出血和分泌物。PAS著色細胞明顯增加，氣道上皮杯狀細胞增生，氣道管腔內黏液滲出明顯。治療組炎癥浸潤減輕，支氣管管腔通暢，黏膜層完整，肺泡及間質有輕度充血，對比模型組肺泡壁增厚減輕，PAS染色見杯狀細胞增生及管腔內黏液分泌減輕，見Fig 3。

Fig 3 Histologic changes in lung tissues by HE and AB-PAS staining (×200)

2.4 BALF中細胞因子IL-17、IL-18、IL-1β濃度比較ELISA檢測BALF中細胞因子，結果提示，中性粒細胞性哮喘模型組BALF中IL-17、IL-18、IL-1β水平較正常對照組增高，差異有統計學意義(P<0.05)，治療組BALF中IL-17、IL-18、IL-1β濃度水平較模型組下降，差異有統計學意義(P<0.05)，見Fig 4。

Fig 4 Cytokine levels in bronchoalveolar lavage fluid

2.5 中性粒細胞Ly6G免疫組織化學染色各組小鼠肺組織免疫組化染色顯示，對照組小鼠肺組織未見明顯中性粒細胞浸潤；與對照組相比，中性粒細胞性哮喘模型組肺組織可見中性粒細胞浸潤數量明顯增加；而1，25-(OH)2D3治療組小鼠肺組織Ly6G陽性染色降低，提示中性粒細胞浸潤減少，見Fig 5。

Fig 5 Immunohistochemical staining for Ly6G+ neutrophils in lung tissues (×400)

2.6 肺組織NLRP3、caspase-1和GSDMD蛋白表達通過Western blot方法檢測各組小鼠肺組織NLRP3、caspase-1、GSDMD蛋白的表達水平，中性粒細胞性哮喘模型組小鼠肺組織NLRP3、caspase-1、GSDMD蛋白水平與對照組相比均明顯增高，差異有統計學意義(P<0.05)；1，25-(OH)2D3治療組NLRP3、caspase-1、GSDMD的蛋白表達明顯降低，較模型組差異有統計學意義(P<0.05)，見Fig 6。

Fig 6 Detection of NLRP3，caspase-1，GSDMD protein in lung tissues by Western blot and relative expression of protein

3 討論

NA是一種重要的支氣管哮喘炎癥表型，與疾病嚴重程度、糖皮質激素耐藥相關，其機制尚不明確。因其具有自身特殊的免疫病理學機理和表征特點，且占非嗜酸性粒細胞性哮喘的半數以上，已成為當前哮喘研究中關注的焦點。NA對糖皮質激素治療抵抗，而且臨床癥狀相比于其它類型的哮喘嚴重，因此需要對NA的發病機制加深探討，以期獲得新的治療靶點或干預藥物[2]。Th17細胞通過分泌IL-17A、IL-17F等細胞因子促進中性粒細胞氣道炎癥，與對糖皮質激素治療的不敏感有關。目前研究表明，炎性小體活化是機體各種炎性反應的中心環節。Simpson等[3]證明，在中性粒細胞性哮喘中NLRP3炎性小體相關基因表達增加，并且在患者誘導痰巨噬細胞和中性粒細胞中檢測到NLRP3、caspase-1蛋白。中性粒細胞性哮喘的氣道炎癥程度及糖皮質激素抵抗都和NLRP3炎性小體、IL-1β水平明顯相關。Kim等[4]研究提示，阻斷NLRP3炎性小體能有效改善合并衣原體和嗜血桿菌呼吸道感染的卵清蛋白誘導的小鼠動物模型的中性粒細胞性氣道炎癥。牛蒡子苷元可以通過SIRT1/NLRP3通路有效減輕哮喘模型小鼠氣道炎癥細胞浸潤情況、降低組織炎癥細胞因子，改善哮喘的氣道炎癥[5]。在本實驗研究中，經OVA及LPS誘導的中性粒細胞性哮喘模型小鼠出現氣道反應性增高，支氣管肺組織炎癥反應增強，BALF中中性粒細胞增多和肺組織中性粒細胞浸潤增加，IL-17增高；并檢測到NLRP3相關的細胞因子IL-18、IL-1β水平增加，肺組織NLRP3蛋白表達的增強，提示NLRP3炎性小體可能在哮喘的氣道中性粒細胞性炎癥形成中發揮重要作用。

維生素D3是一種脂溶性維生素，在體內調節鈣磷的代謝，促進骨骼發育。攝入體內的維生素D分別經肝臟25-羥化酶、腎臟1-α羥化酶的作用轉化為生物活性最強的1，25-(OH)2D3。實驗證明維生素D3對固有免疫和特異性免疫功能都具有明顯的調節效應。張路等[6]報道1，25-(OH)2D3可以減輕慢性哮喘小鼠的氣道重塑及氣道上皮細胞凋亡。Agrawal等[7]觀察到使用1，25-(OH)2D3減輕了哮喘小鼠氣道炎癥和氣道高反應性。這些研究顯示了維生素D3用于控制哮喘的作用。我們近期發表的研究觀察了維生素D3及NLRP3炎性小體表達和肥胖性哮喘的關系，發現血清維生素D3濃度水平和哮喘小鼠的氣道反應性、IL-1β mRNA表達水平成負相關，提示血清維生素D3濃度降低和肥胖哮喘的癥狀表現相關，和NLRP3炎性小體的活性也有相關性[1]。活性維生素D3在人體內表現的抗炎作用與NLRP3炎性小體有關，有研究報道，1，25-(OH)2D3可以通過激活Nrf2從而抑制ROS-NLRP3-IL-1β信號軸，減輕高滲誘導的人角膜上皮細胞炎癥[8]。維生素D3運用于預防和治療糖尿病性視網膜病等炎癥，研究發現維生素D3可降低糖尿病誘導的活性氧上升并抑制ROS/TXNIP/NLRP3炎性小體途徑，減輕視網膜血管損傷和細胞凋亡[9]。本實驗中，我們研究發現，予以中性粒細胞性哮喘小鼠1，25-(OH)2D3治療降低了氣道AHR和BALF中性粒細胞量，抑制了肺組織中性粒細胞浸潤和杯狀細胞的增生，提示1，25-(OH)2D3對中性粒細胞性炎癥的抑制作用。IL-17是促進中性粒細胞浸潤的主要因子，IL-18和IL-1β是NLRP3炎性小體的下游因子。研究觀察到1，25-(OH)2D3治療降低了細胞因子IL-17、IL-18和IL-1β水平，結果表明1，25-(OH)2D3治療抑制哮喘氣道炎癥的作用和其調節IL-17和NLRP3炎性小體有關。

NLRP3炎性小體是由NOD樣受體NLRP3骨架蛋白、接頭蛋白ASC和caspase-1組成的寡聚復合物。NLRP3炎性小體活化caspase-1，促進IL-1β和IL-18的成熟和分泌，增強炎癥并介導細胞焦亡。炎性小體-焦亡途徑激活過程中，IL-1β前體裂解成具有活性的IL-1β，以及GSDMD切割形成GSDMD-N端和GSDMD-C端，GSDMD-N端與胞膜磷脂酰肌醇磷酸酯結合形成孔洞，導致細胞裂解死亡，釋放成熟的IL-1β和IL-18，募集、激活其他免疫細胞，誘導其它炎癥因子、趨化因子、粘附分子等，引發級聯反應，起到放大炎癥的作用。NLRP3/caspase-1/GSDMD信號軸介導的細胞焦亡與相關疾病的密切關系受到了較大的關注。Jia等[10]在腸缺血/再灌注損傷研究中發現，二甲雙胍通過抑制TXNIP-NLRP3-GSDMD途徑減輕了氧化應激和炎癥反應，防止腸道缺血/再灌注損傷。高糖誘導NLRP3-caspase-1-GSDMD活化和膜孔形成，導致視網膜周細胞焦亡和炎性細胞因子IL-1β、IL-18釋放，即高糖通過NLRP3-caspase-1-GSDMD介導的細胞焦亡誘導糖尿病視網膜病變[11]。Jiang等[12]的研究揭示，維生素D/維生素D受體可以通過抑制NF-κB介導的NLRP3/caspase-1/GSDMD細胞焦亡來減輕順鉑誘導的急性腎損傷。GSDMD對促炎細胞因子IL-1β和IL-18的釋放以及細胞焦亡起到控制作用[13]。我們實驗中使用1，25-(OH)2D3治療使肺組織NLRP3、caspase-1、GSDMD表達水平降低，提示其可能通過抑制NLRP3/caspase-1/GSDMD信號軸而干預中性粒細胞哮喘炎癥反應。

維生素D通過其對先天性免疫和適應性免疫反應的作用而發揮免疫調節和抗炎效力。已有較多的研究探討了1，25-(OH)2D3在支氣管哮喘中的治療作用，顯示1，25-(OH)2D3可以調節多種免疫細胞途徑，抑制過度的炎癥反應，如淋巴細胞、肥大細胞、抗原呈遞細胞和結構細胞等，干預哮喘發病機制的眾多方面。重癥哮喘具有糖皮質激素治療抵抗和氣道中性粒細胞浸潤的特點，與細胞因子IL-17的作用有關，而1，25-(OH)2D3也能調節氣道中性粒細胞性炎癥，增強中性粒細胞性哮喘對類固醇的反應[14]。我們的實驗結果顯示，1，25-(OH)2D3能減輕中性粒細胞性哮喘小鼠氣道炎癥和炎性細胞因子分泌，抑制NLRP3、caspase-1、GSDMD蛋白表達。1，25-(OH)2D3可能通過調節NLRP3/caspase-1/GSDMD信號軸改善中性粒細胞性哮喘。因此，本研究揭示了1，25-(OH)2D3干預中性粒細胞性哮喘的積極作用，為其臨床應用于治療中性粒細胞性哮喘或難治性哮喘提供了研究基礎，但仍需更多的研究去探明1，25-(OH)2D3的作用機制及其臨床使用的效果。