胱硫醚-γ-裂解酶產生的H2S在小鼠腦缺血/再灌注損傷中的作用及與RhoA-ROCK2信號通路的關系

郭芳芳，陳志武

(安徽醫科大學基礎醫學院藥理教研室,安徽 合肥 230032)

大腦是體內極其重要的器官，供應腦組織的血流量幾乎占心輸出量的20%[1]。缺血性腦卒中是臨床上常見的腦血管疾病，其主要治療方法是手術治療和使用改善腦血液循環的抗血栓藥物，從而恢復腦血流量的供應。而腦缺血區血液供應的恢復則可能導致腦缺血/再灌注(cerebral ischemia /reperfusion, I/R)損傷，從而可能產生更嚴重的腦損傷[2]。因此，尋找對腦I/R損傷具有保護作用的藥物非常重要。

近十多年研究表明硫化氫(hydrogen sulfide, H2S)也是機體中一種重要的氣體信號分子，具有抗炎、抗氧化、抗細胞凋亡等作用，還可通過調節離子通道活性發揮抗缺血/再灌注所引起的腦損傷[3]。內源性H2S在體內主要由胱硫醚-β-合成酶(l-cystathionine-β-synthetase, CBS)，3-巰基丙酮酸硫基轉移酶(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase, 3-MST)和胱硫醚-γ-裂解酶(l-cystathionine-γ-lyase, CSE)等三種酶產生。其中，CBS主要分布在神經細胞中；CSE主要分布在血管組織中，以血管內皮中含量最為豐富；而3-MST在各種細胞中均有分布[4]。我們以前的研究表明CSE產生的H2S對腦血管有明顯的舒張作用，對腦I/R損傷可產生保護作用[5]，但其確切的機制不明確。

RhoA-ROCK信號通路是細胞內一種重要的信號轉導通路，與細胞的生長、分化、遷移和發育密切相關[6]。RhoA是Rho家族中的一個小GTPase蛋白。人類的RhoA由RHOA基因編碼，位于3號染色體上，由一個效應結構域、四個外顯子、一個高變區和一個CAAX盒基序組成(C：Cys；A：脂肪族殘基；X：任何殘基)。Rho相關蛋白激酶 (Rho associated protein kinase,ROCK)是RhoA最直接的下游效應分子，分為ROCK1和ROCK2兩種亞型。ROCK1在幾乎所有組織中普遍表達，但在大腦和骨骼肌中表達較少，而ROCK2在大腦、肌肉、心臟、肺和胎盤中的含量較高[7]。有研究表明RhoA-ROCK信號通路在血管內皮功能及血管張力的調節中發揮了重要的作用，并可能參與了I/R損傷過程[8-10]，假說提示RhoA-ROCK信號通路有可能參與了CSE產生的H2S對腦I/R損傷的保護作用。因此，本文就RhoA-ROCK信號通路在小鼠腦血管CSE產生的H2S保護腦I/R損傷中的作用及機制進行了研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1儀器 激光散斑血流視頻監測系統，由瑞典帕瑞醫學公司出品；冷凍研磨儀，由上海凈信公司出品；自動組織包埋機，由德國Leica公司出品；全自動輪轉切片系統，由德國Leica公司出品；全自動封閉式脫水機，由德國Leica公司出品；超速低溫離心機，迪黑馬(珠海)醫學儀器有限公司出品；全波長酶標儀，由美國Thermo公司出品。

1.1.2藥品與試劑 硫氫化鈉(sodium hydrosulfide, NaHS)，購自美國Sigma公司，批號為#SHBL6872V；半胱氨酸(L-Cysteine, L-Cys)，購自美國Sigma公司，批號為#MKBC0049；DL-炔丙基甘氨酸(DL-ProPargylglycine, PPG)，購自美國默克公司，批號為#BCBW6478；ROCK2抗體, 購自Abcam公司，批號為ab45171；ROCK2、RhoA活性試劑盒，購自江蘇酶免實業有限公司, 批號分別為：1195M1，45317M1；NSE (神經特異性烯醇化酶)試劑盒，購自江蘇酶免實業有限公司，批號為：0063M1；LDH乳酸脫氫酶試劑盒，購自南京建成生物工程研究所, 批號為：20210731；硫化氫(H2S)含量測定試劑盒，購自江蘇菲亞生物科技有限公司, 批號為：G20210728S。

NaHS溶液的配置：使用生理鹽水配置為4.8 mg·kg-1濃度的溶液，現用現配。

L-Cys溶液的配置：使用生理鹽水配置為300 mg·kg-1濃度的溶液，現用現配。可置于4 ℃短時間保存。

PPG溶液的配置：使用生理鹽水配置為50 mg·kg-1濃度的溶液，現用現配，可置于-20 ℃保存。

1.1.3實驗動物 健康C57BL/6J小鼠(SPF級)，(20～22) g，全部由河南斯克貝斯生物科技股份有限公司提供。飼養環境內通風良好，飼養溫度為(22±3) ℃。實驗所用動物生產許可證號為：SCXK(豫)2020-0005。

1.2 實驗方法

1.2.1小鼠腦I/R模型[5]采用雙側頸總動脈結扎法建立腦I/R模型。小鼠腹腔注射4%水合氯醛麻醉后，沿頸正中切口，鈍性分離出兩側頸總動脈，穿5-0號絲線于血管下備用，待兩側都分離后結扎兩側絲線，扎緊，結扎30 min后小心松開絲線并緩慢抽出，恢復血流供應，然后縫合傷口，并涂抹2%的氨芐青霉素鈉。待小鼠清醒后放回籠子，正常飼養。

在造模前2 h，小鼠分別腹腔注射所需濃度NaHS、L-Cys以及PPG。實驗分組為假手術組、模型組、L-Cys 組、NaHS 組、PPG組、以及PPG和L-Cys合用組。缺血后10 h各組小鼠再次分別注射同樣藥物，缺血后20 h時處死小鼠，取材置于-80 ℃冰箱，測量相應指標。

1.2.2腦血流量的測定[11]小鼠腹腔注射麻醉劑后，在造模前將小鼠頭部皮膚剪開十字口，面積約1 cm2，分離皮下筋膜暴露頭骨。將小鼠俯臥姿勢置于激光散斑血流儀待測區域下，激光正中部位對準小鼠暴露的頭骨部位，血流儀的高度維持在10 cm左右。結扎雙側頸總動脈前測定一次血流量，維持時間為30 s，結扎后立即測定腦血流量改變，維持時間30 s。結扎30 min后松開血管，進行再灌注過程中，自松開后一分鐘開始計時，檢測小鼠腦部再灌注20 min內的血流量的變化。實驗結束后縫合頭部，并涂抹2%的氨芐青霉素鈉。按如下公式計算血流量變化率：

腦血流量變化率/%=再灌注血流量/缺血前血流量×100%

1.2.3HE染色 將小鼠處死后，小心取出完整的腦組織，浸泡于4%的多聚甲醛溶液中固定24～48 h后脫水，進行石蠟包埋，切片，封片，置于顯微鏡下觀察海馬區損傷。

1.2.4血清H2S含量和LDH活性的檢測 小鼠眼眶取血，靜置1 h后4 ℃下以3 000 r·min-1離心15 min，取上清液。按照試劑盒說明書步驟在665 nm波長處讀取吸光值，并計算H2S含量。LDH的測定按照試劑盒步驟于667 nm處讀取吸光值，并計算LDH活性。

1.2.5小鼠腦組織中NSE以及RhoA和ROCK2活性的檢測 將小鼠處死后，小心取出完整的腦組織，用手術刀取下0.1 g腦組織樣本，加入到預先準備好的含有900 μL的PBS溶液的離心管中，4 ℃下勻漿，5 000 r·min-1離心15 min取上清液待檢。分別按照NSE、RhoA和ROCK2試劑盒說明書步驟操作，于450 nm波長處讀取吸光值，并計算其活性。

1.2.6Western blot法檢測ROCK2蛋白的表達 將小鼠處死后，各組腦組織裂解提取總蛋白，采用CBA試劑盒進行定量后，加入蛋白上樣緩沖液 100 ℃ 煮沸10 min變性。將每組蛋白樣品進行凝膠電泳，再將目的蛋白轉移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，TBST溶液清洗3次，4 ℃孵一抗(ROCK2：1 ∶5 000)過夜，次日用TBST洗3次，室溫孵二抗(1 ∶5 000)1 h后顯色，用ImageJ圖像處理系統分析結果。

2 結果

2.1 L-Cys和NaHS對腦I/R小鼠的腦血流量的影響Fig 1，Tab 1結果顯示，與假手術組相比，模型組在腦I/R后20 min內腦血流均有明顯減少(P<0.01)。與模型組相比，L-Cys組和NaHS組小鼠腦血流量分別在再灌注5 min和10 min時就有明顯的恢復(P<0.05)，在20 min時基本恢復到假手術組水平(與假手術組比較，P>0.05)。CSE抑制劑PPG對腦血流沒有明顯的影響，但可明顯地減弱L-Cys對血流量的恢復作用(P<0.05)。結果提示L-Cys可通過CSE促進腦I/R損傷小鼠腦血流量的恢復。

Fig 1 Effects of L-Cys and NaHS on cerebral blood flow after cerebral ischemia and reperfusion in mice

2.2 L-Cys和NaHS對I/R小鼠腦海馬組織病理形態學變化的影響Fig 2結果顯示，假手術組海馬區的神經元細胞體積較大且為圓形，具有明顯的核仁。細胞排列成多層，整齊而致密。然而，模型組海馬區神經元或錐體細胞呈三角形或不規則形狀，細胞皺縮，具有看不見的核仁和無序排列。與模型組相比，NaHS組和L-Cys組可以明顯改善海馬區的病理損傷，大多數神經細胞恢復正常，只有少數神經細胞皺縮，神經元壞死得到改善，正常細胞數量增加。PPG組損傷并沒有改善，但PPG可以降低L-Cys的保護作用。結果表明L-Cys可通過CSE對小鼠腦海馬神經元I/R損傷產生保護作用。

Fig 2 Effects of L-Cys and NaHS on pathomorphological changes of hippocampus after cerebral ischemia and reperfusion in mice (HE staining, ×200, n=5).

2.3 L-Cys和NaHS對I/R小鼠血清中H2S和LDH含量的影響Fig 3A和3B結果顯示，與假手術組相比，模型組血清中H2S的含量明顯降低(P<0.01)，而LDH活性明顯升高(P<0.05)。與模型組相比，NaHS組和L-Cys組的血清中H2S的含量均有明顯的升高(P<0.05)，LDH活性明顯降低(P<0.05)。PPG對血清中H2S和LDH活性無明顯的影響，但可明顯地減弱L-Cys升高血清H2S含量和降低LDH活性的作用(P<0.05)，表明L-Cys可通過CSE抑制腦I/R損傷誘導的小鼠血清中H2S的降低和LDH的升高。

Fig 3 Effects of L-Cys and NaHS on H2S content and LDH activity in serum of mice with cerebral ischemia and reperfusion n=6)

2.4 L-Cys和NaHS對I/R小鼠腦組織中NSE、RhoA和ROCK2活性的影響Fig 4A結果顯示，與假手術組相比，模型組腦組織中的神經特異性的NSE含量明顯降低(P<0.01)。與模型組相比，NaHS組和L-Cys組的NSE的含量有明顯升高(P<0.05)。PPG對NSE的含量沒有影響，但可明顯減弱L-Cys抑制I/R損傷誘導的NSE含量的降低作用(P<0.05)；Fig 4B和Fig 4C結果顯示，與假手術組相比，模型組的腦組織中RhoA和ROCK2的活性明顯升高(P<0.01)。而NaHS和L-Cys組腦組織中RhoA和ROCK2的活性低于模型組(P<0.01或P<0.05)。PPG對腦組織中RhoA和ROCK2活性無明顯的影響，但可明顯的減弱L-Cys抑制I/R損傷引起的RhoA和ROCK2活性的升高(P<0.01或P<0.05)。結果表明L-Cys可通過CSE降低小鼠腦I/R損傷引起的腦組織中NSE降低和RhoA和ROCK2活性升高。

2.5 L-Cys和NaHS對I/R小鼠腦組織中ROCK2蛋白表達的影響Fig 5結果顯示，與假手術組相比，模型組的腦組織中ROCK2蛋白表達明顯升高(P<0.05)，NaHS和L-Cys可明顯地降低小鼠腦I/R引起的腦組織中ROCK2蛋白的表達的升高(P<0.05)。PPG對ROCK2表達無明顯影響，但可明顯減弱L-Cys對I/R損傷誘導的ROCK2蛋白表達增高的降低作用(P<0.05)。結果表明，L-Cys可通過CSE抑制I/R損傷誘導的小鼠腦組織中ROCK2蛋白表達的增高。

Fig 5 Effects of L-Cys and NaHS on expression of ROCK2 protein in brain tissues of mice after cerebral ischemia and reperfusion (Western blotting, n=3)

3 討論

缺血性卒中是導致人類死亡的主要疾病之一，而愈后患者常伴有高致殘率[12-13]。腦I/R 損傷的發病機制較為復雜，涉及氧自由基誘導的氧化應激損傷、谷氨酸介導的興奮性毒性、鈣離子超載和神經炎癥等多種調控機制[14]。然而，臨床上使用靶向這些致病因素的藥物(如自由基清除劑、鈣通道抑制劑和興奮性氨基酸抑制劑)的治療效果并不理想。因此，迫切需要開發治療有效的藥物。

H2S作為一種重要的內源性氣體信號分子，也是一種血管活性物質，具有血管舒張、促進學習記憶、抗炎等多種生物學效應[15]。H2S可調節血管穩態并對腦損傷有保護作用。在大鼠大腦中動脈中，CSE酶抑制劑PPG可有效減弱H2S誘導的的血管舒張作用，而用CBS酶抑制劑氨基氧乙酸酯(AOAA)沒有明顯減弱H2S誘導的的血管舒張作用，表明腦血管系統中的H2S可能主要由CSE產生。本研究通過該方法發現與NaHS一樣，CSE酶底物L-Cys可顯著地促進小鼠腦I/R損傷后腦血流量的恢復。

在腦I/R損傷過程中，由于腦細胞的損傷，腦組織中的一些酶如LDH、NSE等可釋放進入血液中，使這些酶在血清中水平升高，腦組織中水平下降。本研究表明CSE底物L-Cys可明顯抑制腦I/R引起的小鼠血清中LDH活性的升高、腦組織中NSE降低及海馬組織神經細胞的損傷，表明L-Cys對小鼠腦I/R損傷有明顯的保護作用。本研究還發現NaHS也有相同的保護作用。

PPG是一種CSE特異性的抑制劑，本研究表明PPG本身對腦I/R小鼠腦血流量的恢復和腦損傷雖無明顯的影響，但可明顯減弱L-Cys促進腦血流量恢復和腦保護作用，表明L-Cys的這些作用是通過CSE產生的。結合外源性H2S供體NaHS也有促進腦I/R小鼠腦血流量恢復和腦保護作用，我們的結果表明CSE生成的H2S對小鼠腦缺血性損傷有保護作用，其機制之一可能與增加腦血流量有關，這與我們之前研究的CSE生成的H2S有腦血管舒張作用是一致的[5]。

RhoA-ROCK通路是一種細胞內重要的信號傳導通路，參與了創傷性腦損傷、蛛網膜下腔出血、脊髓損傷、神經退行性疾病腦損傷后的變化，以及一些神經退行性疾病等多種神經相關疾病的病理過程[16]，有望成為神經系統疾病的治療靶點。本研究表明小鼠腦I/R明顯地升高腦組織中RhoA和ROCK2活性及ROCK2蛋白的表達，CSE底物L-Cys可降低I/R損傷誘導的腦組織中RhoA和ROCK2活性及ROCK2蛋白表達的升高，但其作用可被CSE抑制劑PPG明顯減弱，表明CSE產生的H2S可抑制小鼠腦I/R損傷導致的RhoA-ROCK信號通路的上調，這可能也是CSE產生的H2S發揮抗小鼠I/R損傷的機制。至于CSE產生的H2S是直接抑制腦組織中RhoA-ROCK信號通路的上調，還是繼發與腦血管舒張和隨后的腦血流量增加，有待于今后的進一步研究。

綜上所述，CSE產生的H2S對小鼠腦I/R損傷有保護作用，其作用可能與抑制RhoA-ROCK信號通路及增加腦血流量有關。