胱硫醚-γ-裂解酶產(chǎn)生的H2S在小鼠腦缺血/再灌注損傷中的作用及與RhoA-ROCK2信號(hào)通路的關(guān)系

郭芳芳，陳志武

(安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理教研室,安徽 合肥 230032)

大腦是體內(nèi)極其重要的器官，供應(yīng)腦組織的血流量幾乎占心輸出量的20%[1]。缺血性腦卒中是臨床上常見(jiàn)的腦血管疾病，其主要治療方法是手術(shù)治療和使用改善腦血液循環(huán)的抗血栓藥物，從而恢復(fù)腦血流量的供應(yīng)。而腦缺血區(qū)血液供應(yīng)的恢復(fù)則可能導(dǎo)致腦缺血/再灌注(cerebral ischemia /reperfusion, I/R)損傷，從而可能產(chǎn)生更嚴(yán)重的腦損傷[2]。因此，尋找對(duì)腦I/R損傷具有保護(hù)作用的藥物非常重要。

近十多年研究表明硫化氫(hydrogen sulfide, H2S)也是機(jī)體中一種重要的氣體信號(hào)分子，具有抗炎、抗氧化、抗細(xì)胞凋亡等作用，還可通過(guò)調(diào)節(jié)離子通道活性發(fā)揮抗缺血/再灌注所引起的腦損傷[3]。內(nèi)源性H2S在體內(nèi)主要由胱硫醚-β-合成酶(l-cystathionine-β-synthetase, CBS)，3-巰基丙酮酸硫基轉(zhuǎn)移酶(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase, 3-MST)和胱硫醚-γ-裂解酶(l-cystathionine-γ-lyase, CSE)等三種酶產(chǎn)生。其中，CBS主要分布在神經(jīng)細(xì)胞中；CSE主要分布在血管組織中，以血管內(nèi)皮中含量最為豐富；而3-MST在各種細(xì)胞中均有分布[4]。我們以前的研究表明CSE產(chǎn)生的H2S對(duì)腦血管有明顯的舒張作用，對(duì)腦I/R損傷可產(chǎn)生保護(hù)作用[5]，但其確切的機(jī)制不明確。

RhoA-ROCK信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)一種重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、遷移和發(fā)育密切相關(guān)[6]。RhoA是Rho家族中的一個(gè)小GTPase蛋白。人類(lèi)的RhoA由RHOA基因編碼，位于3號(hào)染色體上，由一個(gè)效應(yīng)結(jié)構(gòu)域、四個(gè)外顯子、一個(gè)高變區(qū)和一個(gè)CAAX盒基序組成(C：Cys；A：脂肪族殘基；X：任何殘基)。Rho相關(guān)蛋白激酶 (Rho associated protein kinase,ROCK)是RhoA最直接的下游效應(yīng)分子，分為ROCK1和ROCK2兩種亞型。ROCK1在幾乎所有組織中普遍表達(dá)，但在大腦和骨骼肌中表達(dá)較少，而ROCK2在大腦、肌肉、心臟、肺和胎盤(pán)中的含量較高[7]。有研究表明RhoA-ROCK信號(hào)通路在血管內(nèi)皮功能及血管張力的調(diào)節(jié)中發(fā)揮了重要的作用，并可能參與了I/R損傷過(guò)程[8-10]，假說(shuō)提示RhoA-ROCK信號(hào)通路有可能參與了CSE產(chǎn)生的H2S對(duì)腦I/R損傷的保護(hù)作用。因此，本文就RhoA-ROCK信號(hào)通路在小鼠腦血管CSE產(chǎn)生的H2S保護(hù)腦I/R損傷中的作用及機(jī)制進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1儀器 激光散斑血流視頻監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，由瑞典帕瑞醫(yī)學(xué)公司出品；冷凍研磨儀，由上海凈信公司出品；自動(dòng)組織包埋機(jī)，由德國(guó)Leica公司出品；全自動(dòng)輪轉(zhuǎn)切片系統(tǒng)，由德國(guó)Leica公司出品；全自動(dòng)封閉式脫水機(jī)，由德國(guó)Leica公司出品；超速低溫離心機(jī)，迪黑馬(珠海)醫(yī)學(xué)儀器有限公司出品；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，由美國(guó)Thermo公司出品。

1.1.2藥品與試劑 硫氫化鈉(sodium hydrosulfide, NaHS)，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，批號(hào)為#SHBL6872V；半胱氨酸(L-Cysteine, L-Cys)，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，批號(hào)為#MKBC0049；DL-炔丙基甘氨酸(DL-ProPargylglycine, PPG)，購(gòu)自美國(guó)默克公司，批號(hào)為#BCBW6478；ROCK2抗體, 購(gòu)自Abcam公司，批號(hào)為ab45171；ROCK2、RhoA活性試劑盒，購(gòu)自江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司, 批號(hào)分別為：1195M1，45317M1；NSE (神經(jīng)特異性烯醇化酶)試劑盒，購(gòu)自江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào)為：0063M1；LDH乳酸脫氫酶試劑盒，購(gòu)自南京建成生物工程研究所, 批號(hào)為：20210731；硫化氫(H2S)含量測(cè)定試劑盒，購(gòu)自江蘇菲亞生物科技有限公司, 批號(hào)為：G20210728S。

NaHS溶液的配置：使用生理鹽水配置為4.8 mg·kg-1濃度的溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

L-Cys溶液的配置：使用生理鹽水配置為300 mg·kg-1濃度的溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。可置于4 ℃短時(shí)間保存。

PPG溶液的配置：使用生理鹽水配置為50 mg·kg-1濃度的溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配，可置于-20 ℃保存。

1.1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康C57BL/6J小鼠(SPF級(jí))，(20～22) g，全部由河南斯克貝斯生物科技股份有限公司提供。飼養(yǎng)環(huán)境內(nèi)通風(fēng)良好，飼養(yǎng)溫度為(22±3) ℃。實(shí)驗(yàn)所用動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為：SCXK(豫)2020-0005。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1小鼠腦I/R模型[5]采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎法建立腦I/R模型。小鼠腹腔注射4%水合氯醛麻醉后，沿頸正中切口，鈍性分離出兩側(cè)頸總動(dòng)脈，穿5-0號(hào)絲線(xiàn)于血管下備用，待兩側(cè)都分離后結(jié)扎兩側(cè)絲線(xiàn)，扎緊，結(jié)扎30 min后小心松開(kāi)絲線(xiàn)并緩慢抽出，恢復(fù)血流供應(yīng)，然后縫合傷口，并涂抹2%的氨芐青霉素鈉。待小鼠清醒后放回籠子，正常飼養(yǎng)。

在造模前2 h，小鼠分別腹腔注射所需濃度NaHS、L-Cys以及PPG。實(shí)驗(yàn)分組為假手術(shù)組、模型組、L-Cys 組、NaHS 組、PPG組、以及PPG和L-Cys合用組。缺血后10 h各組小鼠再次分別注射同樣藥物，缺血后20 h時(shí)處死小鼠，取材置于-80 ℃冰箱，測(cè)量相應(yīng)指標(biāo)。

1.2.2腦血流量的測(cè)定[11]小鼠腹腔注射麻醉劑后，在造模前將小鼠頭部皮膚剪開(kāi)十字口，面積約1 cm2，分離皮下筋膜暴露頭骨。將小鼠俯臥姿勢(shì)置于激光散斑血流儀待測(cè)區(qū)域下，激光正中部位對(duì)準(zhǔn)小鼠暴露的頭骨部位，血流儀的高度維持在10 cm左右。結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈前測(cè)定一次血流量，維持時(shí)間為30 s，結(jié)扎后立即測(cè)定腦血流量改變，維持時(shí)間30 s。結(jié)扎30 min后松開(kāi)血管，進(jìn)行再灌注過(guò)程中，自松開(kāi)后一分鐘開(kāi)始計(jì)時(shí)，檢測(cè)小鼠腦部再灌注20 min內(nèi)的血流量的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后縫合頭部，并涂抹2%的氨芐青霉素鈉。按如下公式計(jì)算血流量變化率：

腦血流量變化率/%=再灌注血流量/缺血前血流量×100%

1.2.3HE染色 將小鼠處死后，小心取出完整的腦組織，浸泡于4%的多聚甲醛溶液中固定24～48 h后脫水，進(jìn)行石蠟包埋，切片，封片，置于顯微鏡下觀(guān)察海馬區(qū)損傷。

1.2.4血清H2S含量和LDH活性的檢測(cè) 小鼠眼眶取血，靜置1 h后4 ℃下以3 000 r·min-1離心15 min，取上清液。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟在665 nm波長(zhǎng)處讀取吸光值，并計(jì)算H2S含量。LDH的測(cè)定按照試劑盒步驟于667 nm處讀取吸光值，并計(jì)算LDH活性。

1.2.5小鼠腦組織中NSE以及RhoA和ROCK2活性的檢測(cè) 將小鼠處死后，小心取出完整的腦組織，用手術(shù)刀取下0.1 g腦組織樣本，加入到預(yù)先準(zhǔn)備好的含有900 μL的PBS溶液的離心管中，4 ℃下勻漿，5 000 r·min-1離心15 min取上清液待檢。分別按照NSE、RhoA和ROCK2試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟操作，于450 nm波長(zhǎng)處讀取吸光值，并計(jì)算其活性。

1.2.6Western blot法檢測(cè)ROCK2蛋白的表達(dá) 將小鼠處死后，各組腦組織裂解提取總蛋白，采用CBA試劑盒進(jìn)行定量后，加入蛋白上樣緩沖液 100 ℃ 煮沸10 min變性。將每組蛋白樣品進(jìn)行凝膠電泳，再將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，TBST溶液清洗3次，4 ℃孵一抗(ROCK2：1 ∶5 000)過(guò)夜，次日用TBST洗3次，室溫孵二抗(1 ∶5 000)1 h后顯色，用ImageJ圖像處理系統(tǒng)分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 L-Cys和NaHS對(duì)腦I/R小鼠的腦血流量的影響Fig 1，Tab 1結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組在腦I/R后20 min內(nèi)腦血流均有明顯減少(P<0.01)。與模型組相比，L-Cys組和NaHS組小鼠腦血流量分別在再灌注5 min和10 min時(shí)就有明顯的恢復(fù)(P<0.05)，在20 min時(shí)基本恢復(fù)到假手術(shù)組水平(與假手術(shù)組比較，P>0.05)。CSE抑制劑PPG對(duì)腦血流沒(méi)有明顯的影響，但可明顯地減弱L-Cys對(duì)血流量的恢復(fù)作用(P<0.05)。結(jié)果提示L-Cys可通過(guò)CSE促進(jìn)腦I/R損傷小鼠腦血流量的恢復(fù)。

Fig 1 Effects of L-Cys and NaHS on cerebral blood flow after cerebral ischemia and reperfusion in mice

2.2 L-Cys和NaHS對(duì)I/R小鼠腦海馬組織病理形態(tài)學(xué)變化的影響Fig 2結(jié)果顯示，假手術(shù)組海馬區(qū)的神經(jīng)元細(xì)胞體積較大且為圓形，具有明顯的核仁。細(xì)胞排列成多層，整齊而致密。然而，模型組海馬區(qū)神經(jīng)元或錐體細(xì)胞呈三角形或不規(guī)則形狀，細(xì)胞皺縮，具有看不見(jiàn)的核仁和無(wú)序排列。與模型組相比，NaHS組和L-Cys組可以明顯改善海馬區(qū)的病理?yè)p傷，大多數(shù)神經(jīng)細(xì)胞恢復(fù)正常，只有少數(shù)神經(jīng)細(xì)胞皺縮，神經(jīng)元壞死得到改善，正常細(xì)胞數(shù)量增加。PPG組損傷并沒(méi)有改善，但PPG可以降低L-Cys的保護(hù)作用。結(jié)果表明L-Cys可通過(guò)CSE對(duì)小鼠腦海馬神經(jīng)元I/R損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。

Fig 2 Effects of L-Cys and NaHS on pathomorphological changes of hippocampus after cerebral ischemia and reperfusion in mice (HE staining, ×200, n=5).

2.3 L-Cys和NaHS對(duì)I/R小鼠血清中H2S和LDH含量的影響Fig 3A和3B結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組血清中H2S的含量明顯降低(P<0.01)，而LDH活性明顯升高(P<0.05)。與模型組相比，NaHS組和L-Cys組的血清中H2S的含量均有明顯的升高(P<0.05)，LDH活性明顯降低(P<0.05)。PPG對(duì)血清中H2S和LDH活性無(wú)明顯的影響，但可明顯地減弱L-Cys升高血清H2S含量和降低LDH活性的作用(P<0.05)，表明L-Cys可通過(guò)CSE抑制腦I/R損傷誘導(dǎo)的小鼠血清中H2S的降低和LDH的升高。

Fig 3 Effects of L-Cys and NaHS on H2S content and LDH activity in serum of mice with cerebral ischemia and reperfusion n=6)

2.4 L-Cys和NaHS對(duì)I/R小鼠腦組織中NSE、RhoA和ROCK2活性的影響Fig 4A結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組腦組織中的神經(jīng)特異性的NSE含量明顯降低(P<0.01)。與模型組相比，NaHS組和L-Cys組的NSE的含量有明顯升高(P<0.05)。PPG對(duì)NSE的含量沒(méi)有影響，但可明顯減弱L-Cys抑制I/R損傷誘導(dǎo)的NSE含量的降低作用(P<0.05)；Fig 4B和Fig 4C結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組的腦組織中RhoA和ROCK2的活性明顯升高(P<0.01)。而NaHS和L-Cys組腦組織中RhoA和ROCK2的活性低于模型組(P<0.01或P<0.05)。PPG對(duì)腦組織中RhoA和ROCK2活性無(wú)明顯的影響，但可明顯的減弱L-Cys抑制I/R損傷引起的RhoA和ROCK2活性的升高(P<0.01或P<0.05)。結(jié)果表明L-Cys可通過(guò)CSE降低小鼠腦I/R損傷引起的腦組織中NSE降低和RhoA和ROCK2活性升高。

2.5 L-Cys和NaHS對(duì)I/R小鼠腦組織中ROCK2蛋白表達(dá)的影響Fig 5結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組的腦組織中ROCK2蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)，NaHS和L-Cys可明顯地降低小鼠腦I/R引起的腦組織中ROCK2蛋白的表達(dá)的升高(P<0.05)。PPG對(duì)ROCK2表達(dá)無(wú)明顯影響，但可明顯減弱L-Cys對(duì)I/R損傷誘導(dǎo)的ROCK2蛋白表達(dá)增高的降低作用(P<0.05)。結(jié)果表明，L-Cys可通過(guò)CSE抑制I/R損傷誘導(dǎo)的小鼠腦組織中ROCK2蛋白表達(dá)的增高。

Fig 5 Effects of L-Cys and NaHS on expression of ROCK2 protein in brain tissues of mice after cerebral ischemia and reperfusion (Western blotting, n=3)

3 討論

缺血性卒中是導(dǎo)致人類(lèi)死亡的主要疾病之一，而愈后患者常伴有高致殘率[12-13]。腦I/R 損傷的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，涉及氧自由基誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷、谷氨酸介導(dǎo)的興奮性毒性、鈣離子超載和神經(jīng)炎癥等多種調(diào)控機(jī)制[14]。然而，臨床上使用靶向這些致病因素的藥物(如自由基清除劑、鈣通道抑制劑和興奮性氨基酸抑制劑)的治療效果并不理想。因此，迫切需要開(kāi)發(fā)治療有效的藥物。

H2S作為一種重要的內(nèi)源性氣體信號(hào)分子，也是一種血管活性物質(zhì)，具有血管舒張、促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶、抗炎等多種生物學(xué)效應(yīng)[15]。H2S可調(diào)節(jié)血管穩(wěn)態(tài)并對(duì)腦損傷有保護(hù)作用。在大鼠大腦中動(dòng)脈中，CSE酶抑制劑PPG可有效減弱H2S誘導(dǎo)的的血管舒張作用，而用CBS酶抑制劑氨基氧乙酸酯(AOAA)沒(méi)有明顯減弱H2S誘導(dǎo)的的血管舒張作用，表明腦血管系統(tǒng)中的H2S可能主要由CSE產(chǎn)生。本研究通過(guò)該方法發(fā)現(xiàn)與NaHS一樣，CSE酶底物L(fēng)-Cys可顯著地促進(jìn)小鼠腦I/R損傷后腦血流量的恢復(fù)。

在腦I/R損傷過(guò)程中，由于腦細(xì)胞的損傷，腦組織中的一些酶如LDH、NSE等可釋放進(jìn)入血液中，使這些酶在血清中水平升高，腦組織中水平下降。本研究表明CSE底物L(fēng)-Cys可明顯抑制腦I/R引起的小鼠血清中LDH活性的升高、腦組織中NSE降低及海馬組織神經(jīng)細(xì)胞的損傷，表明L-Cys對(duì)小鼠腦I/R損傷有明顯的保護(hù)作用。本研究還發(fā)現(xiàn)NaHS也有相同的保護(hù)作用。

PPG是一種CSE特異性的抑制劑，本研究表明PPG本身對(duì)腦I/R小鼠腦血流量的恢復(fù)和腦損傷雖無(wú)明顯的影響，但可明顯減弱L-Cys促進(jìn)腦血流量恢復(fù)和腦保護(hù)作用，表明L-Cys的這些作用是通過(guò)CSE產(chǎn)生的。結(jié)合外源性H2S供體NaHS也有促進(jìn)腦I/R小鼠腦血流量恢復(fù)和腦保護(hù)作用，我們的結(jié)果表明CSE生成的H2S對(duì)小鼠腦缺血性損傷有保護(hù)作用，其機(jī)制之一可能與增加腦血流量有關(guān)，這與我們之前研究的CSE生成的H2S有腦血管舒張作用是一致的[5]。

RhoA-ROCK通路是一種細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)傳導(dǎo)通路，參與了創(chuàng)傷性腦損傷、蛛網(wǎng)膜下腔出血、脊髓損傷、神經(jīng)退行性疾病腦損傷后的變化，以及一些神經(jīng)退行性疾病等多種神經(jīng)相關(guān)疾病的病理過(guò)程[16]，有望成為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療靶點(diǎn)。本研究表明小鼠腦I/R明顯地升高腦組織中RhoA和ROCK2活性及ROCK2蛋白的表達(dá)，CSE底物L(fēng)-Cys可降低I/R損傷誘導(dǎo)的腦組織中RhoA和ROCK2活性及ROCK2蛋白表達(dá)的升高，但其作用可被CSE抑制劑PPG明顯減弱，表明CSE產(chǎn)生的H2S可抑制小鼠腦I/R損傷導(dǎo)致的RhoA-ROCK信號(hào)通路的上調(diào)，這可能也是CSE產(chǎn)生的H2S發(fā)揮抗小鼠I/R損傷的機(jī)制。至于CSE產(chǎn)生的H2S是直接抑制腦組織中RhoA-ROCK信號(hào)通路的上調(diào)，還是繼發(fā)與腦血管舒張和隨后的腦血流量增加，有待于今后的進(jìn)一步研究。

綜上所述，CSE產(chǎn)生的H2S對(duì)小鼠腦I/R損傷有保護(hù)作用，其作用可能與抑制RhoA-ROCK信號(hào)通路及增加腦血流量有關(guān)。