新型磷酸二酯酶5抑制劑CPD1對異丙腎上腺素誘導(dǎo)心肌肥厚大鼠心臟的保護作用

劉曉晴,楊建欽,王栩林,李 斌,封文斌,高 潔,趙子建,穆云萍,李芳紅

(1.廣東工業(yè)大學(xué)生物醫(yī)藥學(xué)院,廣東 廣州 510006；2.南方醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院,廣東省人民醫(yī)院,廣東 廣州 510080)

心血管疾病依然是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡的首要原因,2019年，柳葉刀發(fā)表的前瞻性城鄉(xiāng)流行病學(xué)研究結(jié)果顯示心血管疾病死因占比達40%,且不同收入水平國家心血管疾病死亡占比存在顯著差異,收入水平越低,心血管疾病發(fā)病率和死亡率越高[1]。冠狀動脈粥樣硬化、心肌梗塞、高血壓、慢性腎功能衰竭、糖尿病和肥胖等都是常見的引起心血管疾病的危險因素,盡管病因不同,但常見的最后階段都是心力衰竭綜合征。值得注意的是,病理性心肌肥厚發(fā)展為心力衰竭越來越成為心血管疾病的重要病因[2-3],能夠引起心肌缺血和心肌病的發(fā)生,減少心臟容量,降低心臟射血分數(shù)。因此,臨床上通過抑制左心肥大，保護心臟功能作為治療心力衰竭的重要策略。目前臨床上用于治療心衰患者的一線藥物有β受體阻滯劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、血管緊張素受體阻斷劑和利尿劑,雖然很大程度上能減緩疾病的進展,但死亡率仍然很高。雖然這些藥物通常耐受性良好,但患者出現(xiàn)頭暈、咳嗽、心動過緩、高鉀血癥等不良副作用的情況并不少見[4]。因此，開發(fā)一種安全有效治療心肌肥厚的藥物對于預(yù)防嚴重心血管疾病的發(fā)生意義重大。

磷酸二酯酶(phosphodiesterase,PDEs)抑制劑是一類能夠抑制PDEs活性的藥物,在急性難治性心力衰竭、肺動脈高壓、勃起功能障礙等多種疾病中被廣泛應(yīng)用。PDE3抑制劑氨力農(nóng)和米力農(nóng)具有正性肌力作用和血管擴張作用,可加強心肌收縮力,改善左室功能[5],但因長期口服副作用大,尤其米力農(nóng)有增加死亡率的風(fēng)險,目前只限用于頑固性心力衰竭的短期靜脈用藥。心臟中存在一個與cGMP耦合的內(nèi)在信號系統(tǒng),可以抑制心肌增殖反應(yīng)。cGMP由磷酸二酯酶超家族特定成員分解代謝,研究最廣泛的cGMP酯酶是PDE5,PDE5能夠選擇性水解細胞內(nèi)cGMP,生理條件下PDE5在心臟中的表達較低,而在心力衰竭患者心肌中表達上調(diào)[6],抑制PDE5可顯著改善缺血性心肌病、阿霉素誘導(dǎo)的心肌病，以及壓力超負荷誘導(dǎo)的心肌肥厚[7-8]。PDE5抑制劑具有治療方法簡單、臨床經(jīng)驗豐富和安全性強的特點,表明這可能是治療人類肥厚性心臟病的重要方法。目前,已被批準上市的PDE5抑制劑西地那非和他達拉非等表現(xiàn)出的副作用仍未解決,中國專利(CN102020645A)公開了一種西地那非類似物(WYQ)制備方法,不僅降低了藥物副作用,且對PDE5的特異性顯著提升(IC50=0.001 4±0.000 1 μmol·L-1)。但WYQ的水溶性依然很差(室溫下<2 g·L-1),影響了藥物的生物利用度,因此,團隊對其進行成鹽和共晶篩選,評估發(fā)現(xiàn)的晶型或鹽型理化性質(zhì),最終選出水溶性高(室溫下>13 g·L-1)、理化性質(zhì)穩(wěn)定的優(yōu)良晶型CPD1(中國專利申請?zhí)枺?01910505948.5),以滿足臨床用藥對活性成分純度、水溶性、吸濕性、熱穩(wěn)定性等理化性質(zhì)的嚴格要求。我們前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),CPD1干預(yù)能夠通過抑制肺動脈平滑肌細胞中非電壓依賴性鈣通道功能,降低肺血管收縮力,減輕肺血管重塑,發(fā)揮防治肺動脈高壓的作用[9]。但CPD1對心肌肥厚大鼠心功能的保護作用有待進一步研究。

因此,本研究使用異丙腎上腺素(isoprenaline)持續(xù)腹腔注射誘導(dǎo)的心肌肥厚大鼠模型,應(yīng)用血流動力學(xué)檢測、心臟病理學(xué)分析及分子生物學(xué)技術(shù),觀察CPD1干預(yù)對心肌肥厚大鼠左心室內(nèi)壓、心臟功能、心肌細胞結(jié)構(gòu)及肥大標志基因表達量的影響,進一步探討新型PDE5抑制劑CPD1在心肌肥厚發(fā)病過程中的防治作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物 SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量(250～280) g,購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司[SCXK(湘)2016-0002]。本研究所需大鼠飼養(yǎng)于華南理工大學(xué)實驗動物中心[SYXK(粵)2017-0178],實驗方案獲得華南理工大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(No 2018-042)。

1.1.2試劑與儀器 異丙腎上腺素(I5627)購自美國Sigma公司,依那普利(enalapril,A45103)購自3A Chemicals 艾覽(上海)化工科技有限公司,蘇木素伊紅染色試劑盒(C0105)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。西地那非(139755-83-2)、CPD1(ET32637-37-P1)購自和委托天津藥明康德新藥開發(fā)有限公司合成,經(jīng)COA分析測定CPD1純度為99%。藥物配制：異丙腎上腺素：用生理鹽水配成4 g·L-1藥液；CPD1：生理鹽水配成1.25 g·L-1的藥液；西地那非：用0.5%的羧甲基纖維素鈉配成5 g·L-1的藥液；依那普利：生理鹽水配成2.5 g·L-1的藥液；所有藥物均現(xiàn)配現(xiàn)用。TRIzol reagent RNA提取試劑盒(美國Invitrogen公司)、PrimeScript? RT reagent Kit(日本TaKaRa),引物由上海生工生物有限公司合成。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。多道生理信號采集處理系統(tǒng)(RM6240BDJ)、壓力換能器(YPJ01)購自成都儀器廠；石蠟包埋機(MPS/P1,德國SLEE)；石蠟切片機(美國Thermo)；冷凍臺(中威電子儀器有限公司)；自動染色機：LEICA Autostainer ST5020；切片掃描儀：Pannoramic DESK,P-MIDI,P250(匈牙利)；-80 ℃冰箱(中國美菱)；烘箱(DH6-9143B5-Ⅲ,上海新苗)。

1.2 實驗方法

1.2.1異丙腎上腺素致心肌肥厚大鼠模型的建立和分組 持續(xù)腹腔注射異丙腎上腺素誘導(dǎo)成年大鼠心臟左心重和室壁厚度增加[10],是最早報道的心肌肥厚動物模型。大鼠隨機分為正常對照組(Con,8只)、異丙腎上腺素模型組(Iso,12只)、CPD1治療組(CPD1,10只)、西地那非治療組(Sif,10只)、陽性藥依那普利治療組(En,10只)。Iso組和各治療組大鼠,以5 mg·kg-1的劑量每天一次腹腔注射異丙腎上腺素,正常對照組則采用相同方法注射生理鹽水,2 h后治療組分別給予CPD1(5 mg·kg-1·d-1)、西地那非(20 mg·kg-1·d-1)、依那普利(10 mg·kg-1·d-1)灌胃治療,持續(xù)7 d,正常飲食飲水。

1.2.2大鼠心功能檢測 RM6240生理信號采集處理系統(tǒng)可檢測大鼠的左心室收縮壓(left ventricular systolic pressure,LVSP)和心室壓力變化速率(dp/dt),進而反映心臟的舒縮功能。實驗啟動前,需選擇血壓測量項目,調(diào)節(jié)參數(shù),定標壓力換能器。腹腔注射20%烏拉坦按照0.5 g·kg-1劑量麻醉大鼠,腹腔肝素化(500 IU·kg-1)處理,經(jīng)右頸總動脈行左心室插管術(shù),記錄各組大鼠的心率、LVSP、dp/dt,待曲線穩(wěn)定后持續(xù)記錄10 min。

1.2.3心臟質(zhì)量指數(shù)和左心室質(zhì)量指數(shù)測量 完成心功能檢測后，嚴格按照華南理工大學(xué)實驗動物倫理委員會的要求對大鼠實施安樂死,迅速取出大鼠心臟,濾紙吸干血液和水分,拍照后稱重,分離左心室并稱重記錄。分離大鼠脛骨并測量其長度,心臟質(zhì)量指數(shù)和左心室質(zhì)量指數(shù)分別用心臟-脛骨長度比(HW/Tibial)以及左心室-脛骨長度比(LV/Tibial)表示。

1.2.4大鼠心臟組織形態(tài)學(xué)檢測 心臟取出后置于10%甲醛溶液中固定24 h,常規(guī)脫水、包埋后最大橫切面連續(xù)切片(3 μm),行蘇木精-伊紅染色。利用切片數(shù)字掃描系統(tǒng)(Pannoramic Scanner)和瀏覽軟件(CaseViewer)對心臟組織切片進行全自動玻片掃描和分析,使用ImageJ軟件對每組大鼠心肌細胞橫截面積進行計算。設(shè)定Con組左心室心肌細胞橫截面積為1,模型和治療組以Con組數(shù)據(jù)為參照,計算各組心肌細胞的相對橫截面積。

1.2.5心臟組織肥大因子mRNA檢測 利用TRIzol reagent RNA試劑盒提取各組大鼠左心組織總RNA,測定濃度后,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA并對目的基因進行RT-PCR。ANP上下游引物序列分別為：5′-CTGGGGAAGTCAACCCGTCT-3′,5′-TCTGGGCTCCAATCCTGTCA-3′；BNP上下游引物序列為：5′-AGCCAGTCTCCAGAACAATCCA-3′,5′-TGTGCCATCTTGGAATTTCGA-3′；大鼠ACTB內(nèi)參上下游引物序列分別為：5′- TGTCACCAACTGGGACGATA-3′,5′- GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3′。

2 結(jié)果

2.1 CPD1對異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌肥厚大鼠心功能的影響通過左心室插管,記錄各組大鼠的左心室收縮壓和dp/dt,觀察CPD1治療對心肌肥厚大鼠左心室收縮壓、心率及心臟舒縮功能的影響。結(jié)果顯示：與正常對照組(Con)相比,Iso組大鼠的LVSP明顯降低(Con：142.3±5.1 mmHg,n=8；Iso：107.7±9.9 mmHg,n=9,P<0.01),心率明顯降低(Con：409.9±37.5 beats·min-1；Iso：359.4±59.5 beats·min-1,P<0.01),Max dp/dt(Con：9 473.7±721.7 mmHg·s-1；Iso：5 968.7±1 330.1 mmHg·s-1,P<0.01)和Min dp/dt(Con：-6 787.2±840.9 mmHg·s-1；Iso：-3 697.2±826.1 mmHg·s-1,P<0.01)絕對值均明顯降低,表明持續(xù)異丙腎上腺素腹腔注射可致大鼠心率降低,心臟收縮和舒張功能受損。CPD1治療后可明顯升高大鼠的LVSP(136.8±8.3 mmHg,n=9,P<0.01)、心率(414.1±52.9 beats·min-1,P<0.01)以及Max dp/dt(8 724.3±1 063.7 mmHg·s-1,P<0.01)和Min dp/dt(-5 856.9±1 143.1 mmHg·s-1,P<0.01)絕對值,且CPD1治療效果明顯優(yōu)于傳統(tǒng)PDE5抑制劑西地那非和陽性對照藥依那普利,表明CPD1干預(yù)能夠有效恢復(fù)由異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌肥厚大鼠心功能的損傷(Fig 1A-I)。

Fig 1 Effect of CPD1 on cardiac function in hypertrophy rats after 7 d on isoprenaline intraperitoneal n=9)

2.2 CPD1對異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌肥厚大鼠心臟質(zhì)量指數(shù)的影響與Con相比,Iso組大鼠的心臟-脛骨長度比(HW/Tibial)(Con：23.4±2.6 mg·mm-1,n=8；Iso：31.4±3.1 mg·mm-1,n=9,P<0.01)和左心室-脛骨長度比(LV/Tibial)(Con：14.1±1.7 mg·mm-1,n=8；Iso：18.8±1.6 mg·mm-1,n=9,P<0.01)均明顯增高,表明持續(xù)異丙腎上腺素腹腔注射可誘導(dǎo)大鼠發(fā)生全心肥大,左心肥大更為明顯。CPD1干預(yù)后,大鼠的HW/Tibial(26.4±2.1%,P<0.01)和LV/Tibial(15.5±1.5 mg·mm-1,P<0.01)均明顯降低,抑制效果不低于西地那非和依那普利,表明CPD1能減輕異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠心肌肥厚(Fig 2A-C)。

Fig 2 Effect of CPD1 on cardiac hypertrophy index in

2.3 CPD1對異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌肥厚大鼠心肌細胞橫截面積的影響與Con相比,Iso組大鼠心臟左心室心肌組織形態(tài)發(fā)生改變,出現(xiàn)明顯炎性細胞浸潤,左心室心肌細胞的橫截面積也明顯增大(Con：1.0±0.2,n=50；Iso：5.0±0.7,n=54,P<0.01),表明持續(xù)異丙腎上腺素腹腔注射可誘導(dǎo)大鼠心肌細胞發(fā)生肥大。CPD1可明顯減小大鼠的心肌細胞橫截面積(1.3±0.2,n=60,P<0.01),同樣,治療效果優(yōu)于西地那非和依那普利,表明在細胞層面上CPD1干預(yù)可抑制異丙腎上腺素引起的心肌肥大(Fig 3A-C)。

Fig 3 Effect of CPD1 on cardiac structure in hypertrophy rats

2.4 CPD1對異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌肥厚大鼠左心組織中肥大因子表達的影響心臟組織中肥大因子心房鈉尿肽(atrial netriuretic peptide,ANP)和腦鈉肽(brain natriuretic peptide,BNP)的表達量可作為衡量心肌肥厚的標志,本研究通過實時定量PCR檢測,觀察各組大鼠左心室組織中ANP和BNP mRNA表達量的變化。結(jié)果顯示：與Con相比,Iso組大鼠左心室中ANP mRNA(Con：1.0±0.1,n=3；Iso：17.3±3.6,n=3,P<0.01)和BNP mRNA(Con：1.0±0.1,n=3；Iso：2.1±0.7,n=3,P<0.01)含量均明顯增加,表明持續(xù)異丙腎上腺素腹腔注射成功誘導(dǎo)大鼠發(fā)生心肌肥厚。同樣,CPD1治療明顯降低ANP mRNA(6.7±0.8,n=3,P<0.01)和BNP mRNA,0.6±0.1,P<0.01)含量,治療效果優(yōu)于西地那非,表明CPD1干預(yù)對異丙腎上腺素引起的心肌肥厚有明顯保護作用(Fig 4A-B)。

Fig 4 Effect of CPD1 on markers of hypertrophy rats after 7d

3 討論

心血管疾病目前仍是最常見的住院原因和死因,且發(fā)病率在低收入和中等收入國家遠高于高收入國家[1],盡管診斷技術(shù)和治療策略已取得重大進展,死亡率降低了50%以上,但長期預(yù)后依然很差,隨著人口老齡化,負擔(dān)日益加重,患者醫(yī)療需求很難得到滿足,已成為重大公共衛(wèi)生問題。2019年柳葉刀在線發(fā)表的PURE研究評估了多種危險因素與心血管疾病和死亡率的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)高血壓是心血管疾病最大的危險因素,吸煙和糖尿病與死亡相關(guān)性最強[3]。心臟暴露于持續(xù)壓力超負荷中,多種細胞因子信號和轉(zhuǎn)錄途徑被激活,誘導(dǎo)心肌肥大性重塑,最終導(dǎo)致進行性心功能不全和心力衰竭。病理性心肌肥厚成因復(fù)雜,受多個調(diào)控因素影響,臨床上尚缺乏有效防治藥物,有研究表明,控制氧化和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣離子信號,減少心律失常和心肌細胞凋亡的風(fēng)險,抑制心肌細胞肥大的驅(qū)動因素,同時

結(jié)合營養(yǎng)、飲食和生活方式的選擇,可有利于心肌肥厚和心衰的防治[2]。

PDEs可特異性清除cAMP和cGMP的3′,5′-環(huán)磷酸酯部分,經(jīng)典的PDE3抑制劑氯力農(nóng)、米力農(nóng)通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)外鈣平衡,增加心肌組織中cAMP水平,降低全身血管阻力和左心室充盈壓,改善心臟功能,但對心率和平均動脈壓沒有影響[5]。cGMP參與心臟組織中細胞生長和凋亡等多項生理過程,一氧化氮(NO)途徑是心血管系統(tǒng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,可調(diào)節(jié)血管張力和心肌功能[11]。內(nèi)皮功能障礙引起的NO-sGC-cGMP信號軸的破壞和cGMP合成受損導(dǎo)致血管緊張素失調(diào)、血管和心室硬化、心肌纖維化和肥大,引起心臟和腎功能的下降[12-14]。因此,靶向NO-sGC-cGMP信號通路,減少cGMP的分解代謝,一直是抗心肌肥厚和治療心衰的有利途徑[15]。西地那非和其他選擇性藥物對PDE5的抑制作用在臨床上被廣泛用于增強勃起功能和治療肺動脈高壓[16]。PDE5在心肌中也有表達,并具有活性[17],西地那非抑制PDE5對靜息狀態(tài)下心功能影響不大,但對暴露于持續(xù)壓力負荷中的心功能作用重大,能夠阻止和逆轉(zhuǎn)由壓力超負荷引起的心室肌細胞和分子重構(gòu),改善心功能,甚至在超負荷持續(xù)存在的情況下,依然可以逆轉(zhuǎn)已經(jīng)發(fā)生肥大的心室肌功能[8],證明抑制PDE5是一種安全簡單、臨床經(jīng)驗豐富的治療肥厚性心臟病的重要方法。

現(xiàn)有PDE5抑制劑藥物副作用大且價格昂貴,給病人和社會帶來巨大身心和經(jīng)濟負擔(dān),中國專利文獻CN102020645A公開的WYQ,是一種吡唑并嘧啶酮衍生物,它克服了原有藥物的缺點,對PDE5特異性更強,具有低劑量高藥效的特點[18],但其水溶性較差。為了改善藥物的水溶性,我們對WYQ進行了成鹽和共晶篩選,最終選擇了水溶性及腸溶性好、理化性質(zhì)穩(wěn)定、安全性高(半數(shù)致死量LD50=1 120.650 mg·kg-1,LD50的95%可信限=(868.184～1 446.531) mg·kg-1的鉀鹽晶型CPD1。我們前期研究已經(jīng)證實其能特異性抑制PDE5,能有效防治肺動脈高壓[9]。本研究利用異丙腎上腺素持續(xù)腹腔注射7 d制備心肌肥厚大鼠模型,觀察CPD1對心肌肥厚大鼠心臟的保護作用,以及對肥大標志基因表達的影響。結(jié)果顯示CPD1治療后,顯著升高心肌肥厚大鼠的左心室壓力和壓力變化速率,且無論是治療劑量還是藥效均明顯優(yōu)于西地那非和依那普利,說明CPD1干預(yù)通過改善心臟的收縮和舒張功能,恢復(fù)心肌肥厚大鼠的心臟功能。ANP含量增加是早期心功能異常的表現(xiàn),BNP更是公認的心力衰竭生物標志物,CPD1顯著降低左心室組織中ANP和BNP基因的表達,表明CPD1治療在動物水平可改善異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌肥厚。

病理性心肌肥厚是誘發(fā)多種重大心血管疾病的重要病因,心肌細胞增大的過程中伴隨心肌細胞間質(zhì)的增加,因超過毛細血管的供應(yīng)能力,會引起心肌缺氧和心臟重構(gòu),如果不及時干預(yù),心臟會進一步發(fā)展為不可逆的失代償期,并伴有心功能障礙,最終引起心力衰竭甚至死亡。但臨床上缺乏治療心肌肥厚的藥物,只能針對誘發(fā)因素,采取一定的治療策略。本研究中,給予CPD1治療后,顯著降低心肌肥厚大鼠的心臟質(zhì)量指數(shù)和左心室質(zhì)量指數(shù),同時減小左心室心肌細胞的橫截面積,表明與PDE5、cGMP和/或PKG調(diào)節(jié)相關(guān)的潛在機制對抑制肥大是有效的,并且可能干擾多種信號途徑,改善異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌肥厚,保護心臟,具有藥物開發(fā)潛在價值。

綜上所述,本研究從心臟功能、心臟質(zhì)量指數(shù)和心肌細胞橫截面積、肥大標志因子表達水平說明了新型PDE5抑制劑CPD1對心肌肥厚的防治作用,但因心肌肥厚病因和發(fā)病機制復(fù)雜,其具體作用機制尚待進一步研究。