基于網(wǎng)絡(luò)藥理學和細胞實驗探討杜仲+續(xù)斷藥對治療骨質(zhì)疏松癥的作用機制

張玉苗,劉 洋,劉艷平,李引剛,潘亞磊

[1.陜西中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，陜西 咸陽 712046；2.陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院骨創(chuàng)傷一科，陜西 咸陽 712000；3.陜西中醫(yī)藥大學 陜西中藥資源產(chǎn)業(yè)化省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心 秦藥特色資源研究開發(fā)國家重點實驗室(培育)，陜西 咸陽 712046]

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是以低骨量和骨組織的微結(jié)構(gòu)退化，導致骨脆性增強、骨折風險增加為臨床特征的代謝性骨病。中醫(yī)將OP歸之于“骨痿”、“骨枯”等范疇，認為其發(fā)生、發(fā)展與“腎虛精虧”密切相關(guān)，以“補益肝腎”為主要治法。杜仲、續(xù)斷始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有堅筋骨、續(xù)筋骨的功效。《中國藥典》記載杜仲、續(xù)斷的功能與主治均為“補肝腎、強筋骨”。在歷代醫(yī)家的驗方中，杜仲+續(xù)斷藥對配伍十分常見，如《千金要方》中的丹參丸，《本事方》中的思仙續(xù)斷丸，《扶壽精方》中的續(xù)斷丸等[1]。臨床上杜仲和續(xù)斷常相須為用治療OP，用藥頻率在常用方劑中分別位列第6和7位[2]。

杜仲、續(xù)斷治療OP的療效確切，但由于中藥多成分、多靶點的特點，兩藥做為相須藥對配伍治療OP的作用機制仍不明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學可多層次、多角度分析中藥治療疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機制。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學及細胞分子實驗開展杜仲和續(xù)斷配伍治療OP機制研究，以期明確該藥對治療OP的作用機制，為相須藥對的研究及OP的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 杜仲+續(xù)斷藥對活性成分獲取于中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺(https：//tcmspw.com/tcmsp.php，TCMSPM)、中藥分子機制生物信息學分析工具(http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/，BATAN-TCM)分別以O(shè)B≥30%，DL≥0.18以及Score cutoff≥20、AdjustP-value≤0.05為篩選標準檢索兩藥活性成分，并結(jié)合文獻報道補充桃葉珊瑚苷、川續(xù)斷皂苷VI等有效成分[3-4]。

1.2 構(gòu)建“藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖在Pharmmapper(http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)獲取活性成分潛在靶點。在GeneCards(https：//www.genecards.org/)、OMIM(https：//www.omim.org/)以“osteoporosis”為關(guān)鍵詞檢索疾病靶點。對比活性成分潛在靶點與疾病靶點，交集靶點為杜仲+續(xù)斷藥對活性成分治療OP的預測靶點，利用Cytoscap3.7.2呈現(xiàn)“藥物-成分-靶點”相互關(guān)系。

1.3 構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)利用String(https：//string-db.org/)構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，并以Cytoscap3.7.2呈現(xiàn)靶點相互關(guān)系。

1.4 靶點通路分析及可視化在DAVID(https：//david.ncifcrf.gov/)以P<0.05為篩選條件對關(guān)鍵靶點進行基因本體(gene ontolog，GO)生物學過程富集分析與基因組百科全書(KEGG)代謝通路富集分析，在微生信(http：//www.bioinformatics.com.cn)形成氣泡圖。

1.5 細胞分子實驗

1.5.1實驗動物、試藥與試劑 2日齡SPF 級SD 乳鼠6只，(220±10) g SD大鼠32只，雌雄各半，購自成都達碩實驗動物有限公司[生產(chǎn)許可證號：SCXK(川)2020-030]，飼養(yǎng)于陜西中醫(yī)藥大學SPF 級動物飼養(yǎng)室，SYXK(陜)2017-004；杜仲(20200102)、續(xù)斷(20200426)飲片購自陜西興盛德藥業(yè)有限責任公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗購自以色列BI公司；胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶、茜素紅購自美國Sigma公司；EdU成像檢測試劑盒(KGA331-100)購自江蘇凱基生物技術(shù)有限公司；ALP試劑盒(A059-1)購自南京建成生物工程研究所；BMP-2(1 ∶1 000，PA5-85956)和β-actin(1 ∶2 000，MA5-11869)抗體購自美國Invitrogen公司，Wnt、β-catenin、p-β-catenin、p38、RUNX2、兔二抗(1 ∶1 000，2721T、8480T、2009、8690T、12556S、7074)抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.5.2主要儀器 細胞超凈操作臺( 蘇州安泰凈化有限公司)；311型CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；IX73-DP73倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；Multiskan GO 型全波長酶標儀(美國 Thermo 公司)；PAC300 型電泳儀、XRS+化學發(fā)光分析儀(美國 Bio-Rad 公司)。

1.5.3含藥血清制備 分別稱取杜仲300 g、續(xù)斷300 g、杜仲150 g+續(xù)斷150 g，加水淹沒中藥浸泡2 h；煎煮至水沸改用文火，30 min后過濾倒出藥液，重復共煎煮兩次，合并兩次濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至200 mL，得生藥含量為1.5 kg·L-1水煎液。SD大鼠隨機分為4組，每組8只，分別為空白組、杜仲組、續(xù)斷組、杜仲+續(xù)斷組，禁食12 h，以10 mL·kg-1灌胃體積給藥，空白組給予同等劑量的蒸餾水，每日1次，連續(xù)7 d。末次給藥1 h后，乙醚麻醉，腹主動脈采血，靜置30 min后，4 ℃離心，得空白血清和含藥血清，56 ℃水浴30 min滅活，微孔濾膜過濾，保存于-20 ℃冰箱備用。

1.5.4細胞增殖及堿性磷酸酶活性測定 酶消化法制備大鼠原代成骨細胞(osteoblast，OB)[5]，細胞接種于96孔板，密度為5×103個/孔，培養(yǎng)12 h后，設(shè)置空白組(CON，加入10%空白血清)、杜仲組(DZ，加入10%含杜仲血清)、續(xù)斷組(XD，加入10%含續(xù)斷血清)、杜仲+續(xù)斷組(DZ+XD，加入10%含杜仲+續(xù)斷血清)。加藥后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，采用EdU標記法檢測細胞增殖，熒光顯微鏡拍照后用ImageJ統(tǒng)計。加藥后繼續(xù)培養(yǎng)至d 7，期間每2 d換液一次，測定堿性磷酸酶ALP活性。增殖或堿性磷酸酶表達率/%=(實驗組細胞OD值/空白組細胞OD值)×100%。

1.5.5OB礦化結(jié)節(jié)形成測定 細胞接種于24孔板，密度為1×105個/孔，培養(yǎng)12 h后，更換為分化培養(yǎng)基(含10%血清，0.1 μmmol·L-1地塞米松，50 mg·L-1抗壞血酸，10 mmol·L-1β-甘油磷酸鈉)，分組加藥同“1.5.4”，每3 d換液1次。細胞培養(yǎng)21 d后，茜素紅染色并在顯微鏡下拍照并用ImageJ統(tǒng)計分析礦化結(jié)節(jié)面積。

1.5.6Western blot檢測蛋白表達 細胞接種于6孔板，密度為5×105個/孔，培養(yǎng)12 h后，分組加藥同“1.5.4”，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，提取總蛋白，BCA法進行蛋白定量。蛋白變性后用12%分離膠進行電泳，用PVDF膜進行轉(zhuǎn)膜，封閉2 h，一抗孵育過夜，洗膜后加二抗室溫孵育1 h，洗膜后進行化學發(fā)光并拍照并分析。

2 結(jié)果

2.1 杜仲+續(xù)斷治療OP活性成分篩選通過TCMSP、BATMAN-TCM、PubChem檢索及文獻報道保留有效成分杜仲42個、續(xù)斷15個，共有成分2個，見Tab 1。

Tab 1 Active components in Eucommiae ulmoides and Radix Dipsaci

NumberCompoundFormulaPubChem IDDZ31GenisteinC15H10O55280961DZ32DulcitolC6H14O611850DZ33Dimethylcaffeic acidC11H12O4717531DZ34CivetoneC17H30O5315941DZ35Cis-PinosylvinC14H12O25280457DZ36(2R,3R)-3-HydroxyprolineC5H9NO37098652DZ3711-Deoxyglycyrrhetic acidC30H48O312305517DZ387-HydroxycoumarinC9H6O35281426DZ39Gama-SitosterolC29H50O457801DZ40n-TriacontanolC30H62O68972DZ41GeniposideC17H24O10107848XD1GentisinC14H10O55281636XD2Isochlorogenic acid AC25H24O126474310XD3JaponineC18H17NO3442915XD4Sylvestroside IIIC27H36O14101967018XD5LoganinC17H26O1087691XD6Akebiasaponin DC47H76O1814284436XD7SwerosideC16H22O9161036XD8Lacceric acidC32H64O219255XD9CantleyosideC33H46O1912302406XD10SitoglusideC35H60O65742590XD11HelixinC41H66O1273296XD12Oleanolic acidC30H48O310494XD13Cauloside AC35H56O8441928XD14Isochlorogenic acid CC25H24O126474309XD15VenoterpineC9H11NO56842090AUrsolic acidC30H48O364945BBeta-SitosterolC29H50O222284CCC20H22O721582571

2.2 “藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖及分析“藥物-成分-靶點”關(guān)系見Fig 1，圖中共185個節(jié)點，1 095個邊線，圓形節(jié)點為藥物，八邊形節(jié)點為活性化合物，菱形節(jié)點為80個靶點，其中20個黃色為杜仲靶點、7個藍色為續(xù)斷靶點，53個橙色為共同靶點，邊線代表化合物與靶點間聯(lián)系。

Fig 1 Medicines-compounds-targets network

2.3 靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)及分析靶點相互關(guān)系見Fig 2，該圖有76個圓形節(jié)點、436條邊線，代表靶點之間的相互關(guān)聯(lián)，節(jié)點顏色深度、面積與其degree值成正比。杜仲+續(xù)斷藥對治療OP相關(guān)性排名前15位的靶點中的ALB、EGFR、MAPK1、MAPK8、CASP3、ESR1、HSP90AA1、AR、MAPK14、KDR、PGR共計11個為杜仲+續(xù)斷共同靶點，PLG、ANXA5、IGF1R共計3個為杜仲單獨作用靶點，SRC為續(xù)斷單獨作用靶點，提示該藥對治療OP具有協(xié)同增效作用。

Fig 2 The candidate targets interaction networkof Eucommiae ulmoides and Radix Dipsaci

2.4 GO和KEGG通路富集結(jié)果與分析GO富集分析結(jié)果見Fig 3，結(jié)果顯示：杜仲+續(xù)斷主要作用于：細胞外泌體、細胞外間隙、細胞表面、受體復合物和核染色質(zhì)等細胞組分；鋅離子結(jié)合、ATP結(jié)合、甾體激素受體活性、絲氨酸類內(nèi)肽酶活性、序列特異性DNA結(jié)合等分子功能；以及轉(zhuǎn)錄作用、 DNA誘導型、負向調(diào)節(jié)RNA聚合酶II啟動子的轉(zhuǎn)錄、肽基絲氨酸磷酸化、轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、對蛋白激酶B信號傳導的正向調(diào)節(jié)等生物過程。KEGG通路富集分析見Fig 4。結(jié)合文獻研究，癌癥相關(guān)通路、破骨細胞分化、MAPK、Estrogen、FoxO、VEGF等信號通路與OP的治療具有相關(guān)性。

Fig 3 GO pathway enrichment analysis for cellular components,biological processes, molecular function of candidate targets of active components of Eucommiae ulmoides and Radix Dipsaci

Fig 4 KEGG pathway enrichment analysis of candidate targets of active components of Eucommiae ulmoides and Radix Dipsaci

2.5 杜仲+續(xù)斷對OB增殖及堿性磷酸酶活性的影響如Fig 5所示，與空白組相比，杜仲組、續(xù)斷組和杜仲+續(xù)斷組的細胞增殖速率、堿性磷酸酶活性和礦化結(jié)節(jié)數(shù)量均提高，差異有顯著性(P<0.01)，且杜仲+續(xù)斷組增殖速率、堿性磷酸酶活性和礦化結(jié)節(jié)數(shù)量均明顯高于杜仲組或續(xù)斷組(P<0.01)。顯示杜仲續(xù)斷對OB增殖、分化和礦化具有協(xié)同增效作用。

Fig 5 Effect of Eucommiae ulmoides and Radix Dipsaci on proliferation, differentiation and mineralization in

2.6 杜仲+續(xù)斷對OB BMP2和Wnt信號通路蛋白表達的影響與空白組相比，杜仲組、續(xù)斷組和杜仲+續(xù)斷組BMP2、p38、RUNX2、Wnt和β-catenin蛋白均明顯增加(P<0.05,P<0.01)；續(xù)斷組BMP2、p38和RUNX2蛋白明顯高于杜仲組(P<0.05或P<0.01)；杜仲組Wnt和β-catenin蛋白明顯高于續(xù)斷組(P<0.01)；杜仲+續(xù)斷組BMP2、p38、RUNX2、Wnt和β-catenin蛋白均明顯高于杜仲組和續(xù)斷組(P<0.01)；杜仲組和杜仲+續(xù)斷組與空白組相比p-β-catenin蛋白表達明顯減少(P<0.05或P<0.01)，見Fig 6。提示杜仲主要調(diào)節(jié)Wnt信號通路，續(xù)斷激活BMP2信號通路更明顯，杜仲續(xù)斷配伍具有協(xié)同增效作用。

Fig 6 Effect of Eucommiae ulmoides and Radix Dipsaci on protein expression of BMP2 and Wnt signaling pathway in

3 討論

杜仲和續(xù)斷作為補肝腎、強筋骨的常用中藥，常相須用于骨科疾病的臨床治療。既往研究表明杜仲+續(xù)斷藥對不僅可治療腰椎間盤突出癥[1]，還能促進骨折愈合提高骨密度[6]。中醫(yī)常將杜仲和續(xù)斷相須合用治療OP，既可補益肝腎以固本，又兼續(xù)筋骨、行血脈以預防骨質(zhì)疏松性骨折，具有顯著的臨床療效。但該藥對治療OP的協(xié)同增效機制仍未探明。因此，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學和細胞分子實驗探究了杜仲+續(xù)斷治療OP協(xié)同增效的藥理學機制。

網(wǎng)絡(luò)藥理學研究結(jié)果顯示，杜仲+續(xù)斷治療OP的交集靶點共80個，核心靶點包括ALB、EGFR、MAPK1、MAPK8、CASP3、ESR1等。PPI及GO分析顯示這些靶點基因間具有很強的相互作用，并可通過調(diào)控細胞的增殖、分化、礦化、凋亡，參與鈣磷代謝等生物學進程，影響蛋白、酶、轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合等分子功能，這種多靶點、多途徑的作用機制體現(xiàn)了中醫(yī)藥治療疾病的整體觀。這些核心靶點基因可能通過以下機制影響OP的發(fā)生和發(fā)展：(1)調(diào)控細胞的增殖、分化、礦化：EGFR作為受體酪氨酸激酶超家族中的一員，能被生長因子家族成員結(jié)合、激活，并參與調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細胞、OB、破骨細胞、軟骨細胞等骨代謝相關(guān)細胞的增殖、分化過程[7]。MAPK家族不僅能促進骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化、提高OB活力、功能，還能阻斷RANKL介導的破骨細胞生成，進而防治OP的發(fā)生[8]，ESR1在OB中可通過CSE/H2S信號通路和骨骼中的雌激素信號傳導途徑來發(fā)揮成骨作用，并同ESR2在調(diào)控OB成熟礦化中起到調(diào)節(jié)平衡作用[9]。CASP作為傳統(tǒng)的與炎癥、細胞凋亡相關(guān)的蛋白酶，可以調(diào)節(jié)細胞的增殖和分化，CASP3缺陷小鼠的總骨密度、骨髓間充質(zhì)干細胞成骨和增殖能力下降[10]；(2)參與鈣磷代謝：ALB被證明與鈣磷代謝紊亂具有顯著相關(guān)性，而OP的進展與鈣磷代謝是密切相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)激活Wnt/Ca2+信號通路可抑制骨髓間充質(zhì)干細胞的自我更新，同時刺激OB分化[11]。

本研究對靶點基因進行了富集分析，以探尋杜仲+續(xù)斷治療OP時所調(diào)控的主要信號通路及其具體機制。結(jié)果顯示靶點蛋白涉及多條信號通路，主要包括癌癥相關(guān)通路、破骨細胞分化、MAPK、Estrogen、FoxO、VEGF等與骨代謝密切相關(guān)。(1)癌癥相關(guān)子通路眾多，大多與調(diào)控生長發(fā)育相關(guān)，其中，Wnt/β-catenin信號通路與OB、破骨細胞的生長分化以及骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化密切相關(guān)[12]。(2)MAPK信號通路主要包括ERK1/2、JNK、p38和ERK5等通路，既能作用于骨髓間充質(zhì)干細胞、OB而促進成骨，還能阻斷破骨細胞的生成，對骨代謝進行雙重調(diào)節(jié)[8]。(3)Estrogen可通過促進破骨細胞凋亡和抑制OB產(chǎn)生破骨細胞分化因子而抑制骨吸收，還可促進局部骨血管生成從而改善骨質(zhì)疏松[13]；(4)Foxo1通過調(diào)節(jié)OB增殖及氧化還原平衡控制骨形成，激活Foxo1通路可以調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細胞在OB和脂肪細胞之間的轉(zhuǎn)換[14]。(5)VEGF不僅能直接作用于OB，增加OB的堿性磷酸酶活性，促進其增殖分化及鈣結(jié)節(jié)的形成，亦能通過調(diào)節(jié)血管形成作用于骨髓間充質(zhì)干細胞和破骨細胞參與骨代謝過程[15]。由此可見，杜仲+續(xù)斷治療OP可能是通過多途徑同時調(diào)控多條信號通路，主要圍繞促進骨形成、抑制骨吸收、改善細胞增殖環(huán)境、促進血管新生等方面來延緩OP的發(fā)生發(fā)展。

本研究選取癌癥相關(guān)的子信號通路Wnt/β-catenin和MAPK信號通路中的BMP2/p38/RUNX2途徑，進行細胞分子實驗以考察杜仲+續(xù)斷藥對的協(xié)同增效作用和機制。研究結(jié)果顯示杜仲+續(xù)斷促進OB增殖、堿性磷酸酶表達和礦化結(jié)節(jié)形成的能力明顯高于兩藥單獨作用，且杜仲主要調(diào)節(jié)Wnt信號通路，續(xù)斷則能夠更明顯的激活BMP2信號通路，兩藥配伍后對Wnt和BMP2通路調(diào)控作用顯著增強，這可能是杜仲+續(xù)斷治療OP的協(xié)同增效的作用機制。既往研究表明：杜仲及其有效成分可通過Wnt及p38等多條信號通路誘導骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化[16]，續(xù)斷皂苷類成分也可通過BMP2/MAPK/RUNX2信號通路促進成骨細胞分化[17]，與本研究結(jié)果一致。

綜上所述，本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學角度對杜仲+續(xù)斷治療OP的潛在活性成分、關(guān)鍵基因和關(guān)鍵通路、機制進行了闡述，并通過細胞分子實驗證實了該藥對治療OP的協(xié)同增效作用。結(jié)果提示該藥對在OP的治療中可能涉及不同靶點和通路，通過促進成骨細胞的骨形成等相關(guān)骨代謝過程延緩OP的進展，體現(xiàn)了中醫(yī)藥治療OP多靶點、多途徑的治療特點。