商陸藥效伴隨藥代動力學及其藥效機制的研究

孫文學，盛云華，黃 堅，孫 杰，魏舒婷，唐黎明

(上海市食品藥品檢驗研究院藥理室，上海 201203)

商陸為商陸科植物商陸(PhytolaccaacinoseRoxb.)或垂序商陸(PhytolaccaamerrcanaL.)的干燥根，主產于河南、安徽、陜西等全國大部分地區。性味苦，寒；有毒。歸肺、脾、腎、大腸經。功效為逐水消腫，通利二便；外用解毒散結[1]。其在臨床上有非常良好的利尿作用，常與其它利尿中藥麻黃、澤瀉等組成復方制劑，如商陸麻黃湯、商陸豆方、商陸散等，應用于治療水腫、急性腎小球腎炎、肝硬化腹水等疾病[2-5]。三萜皂苷、酚酸、黃酮、多糖等成分是商陸的主要化學成分，其中以三萜皂苷為主，主要包括商陸皂苷甲(esculentoside A，EsA)、商陸皂苷乙(esculentoside B，EsB)、商陸皂苷C(esculentoside C，EsC)。EsA是藥典規定的指標性成分，2020年版《中國藥典》一部規定商陸藥材中EsA含量不得少于0.15%。

本研究旨在探索商陸的利尿作用、利尿作用機制與藥代動力學，明確商陸的“量-時-效”關系。主要包括三部分內容：首先，大鼠造模水負荷模型后灌胃給予商陸水提物，探究商陸利尿作用；其次，采用蛋白質免疫法(Western blot)測定大鼠的水通道蛋白以及腎素-血管緊張素度-醛固酮(RAAS)系統的蛋白表達，探索商陸的利尿作用機制；最后，通過藥代動力學研究，進行大鼠血漿內EsA的血藥濃度測定并進行利尿藥效相關性分析。

1 材料與方法

1.1 試劑商陸藥材飲片購于上海市藥材有限公司，產地為安徽省，批號180511；商陸皂苷甲購于成都麥卡希化工有限公司，HPLC法含量≥98%，1 g；氫氯噻嗪片購于上海上藥信誼藥廠有限公司，產品批號053180502，規格25 mg/片；氯化鈉注射液購于華裕(無錫)制藥有限公司，產品批號20191202，規格100 mL ∶0.9 g。

Western blot試劑均購自毓秀生物科技(上海)有限公司。ELISA檢測試劑購于南京建成生物工程研究所。

人參皂苷Rg 1標準品購于上海源葉科技生物有限公司，HPLC法含量≥98%，規格20 mg，批號G30N10Y104330；乙腈(批號：JA076230)為色譜純，甲醇為色譜純，磷酸為分析純。

1.2 儀器超純水儀：Millipore Advantage A10超純水儀；超聲波清洗器：上海科導超聲儀器有限公司；分析天平：XS205DU電子天平；高效液相色譜儀：Waters e2695；液質聯用儀：API5000 LC-MS/MS三重四級桿液質聯用儀；色譜柱：Waters ACQUITY UPLC CSH C18(1.7 μm，3.0×100 mm)；純水儀：Millipore Elix 3純水儀；超純水儀：Millipore Advantage A10超純水儀；分析天平：XS205DU電子天平、PL403-IC電子天平；高速離心機：3K30離心機。

1.3 實驗動物SPF級雄性SD大鼠，180～200 g，購于浙江維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證號為SCXK(浙)2019-0001。飼養溫度為22 ℃～24 ℃，濕度為40%～70%，光照周期為12 h，自由飲食飲水。

1.4 試劑的制備與配制

1.4.1商陸水提物的提取工藝 取商陸藥材飲片1 kg，加10倍量純水浸泡90 min，于武火煮沸后，文火煎煮1 h，趁熱過濾，收集濾液。6倍量純水浸泡殘余藥渣，同法煎煮。合并2次濾液，然后以文火濃縮至1 kg/600mL浸膏[6]。

1.4.2商陸水提物、陽性藥物、商陸皂苷甲溶液的配制 取商陸水提物浸膏適量，加純水稀釋至0.045 kg·L-1作為低劑量組，加純水稀釋至0.09 kg·L-1作為中劑量組，加純水稀釋至0.18 kg·L-1作為高劑量組。

取氫氯噻嗪片一片(25 mg)研磨為粉末，加入50 mL純水中混勻得0.5 g·L-1的氫氯噻嗪溶液作為陽性對照品溶液。

取商陸皂苷甲標準品粉末12.5 mg，加入50 mL容量瓶中定容，置于超聲器中超聲溶解混勻，得0.25 g·L-1的商陸皂苷甲溶液。

1.5 實驗動物的篩選、分組、造模與給藥

1.5.1實驗動物的篩選與分組 實驗大鼠適應性飼養3 d，實驗前禁食不禁水，按25 mL·kg-1灌胃生理鹽水，收集6 h尿液，每2 h收集一次，挑選出2 h內收集到的尿量大于40%的生理鹽水灌胃量的大鼠作為合格大鼠，記錄6 h總尿量作為基礎尿量值[7]。

將合格大鼠按體質量與基礎尿量值分組，分別為空白對照組、模型組、陽性對照組、商陸低、中、高劑量組、商陸皂苷甲組，每組7只。同步設置TK衛星組，每組3只，用于PK采血。

1.5.2造模與給藥 空白對照組與模型組給與純水，陽性對照組給與氫氯噻嗪溶液(劑量為10 mg·kg-1)，商陸各劑量組依次灌胃商陸水提物(劑量依次為0.9、1.8、3.6 g生藥·kg-1)，商陸皂苷甲組灌胃商陸皂苷甲溶液(劑量為5 mg·kg-1)，各組給藥體積均為20 mL·kg-1，連續給藥3 d。

d 3給藥前，需要造模水負荷模型：提前18 h禁食，自由飲水，除空白對照組外各組分別灌胃30 mL·kg-1生理鹽水，輕按大鼠下腹部，促其排盡余尿，造模水負荷狀態大鼠[8]。造模30 min后，即可按上述方式灌胃給藥。

給藥后將大鼠放入代謝籠，每2 h收集一次，收集0～6 h尿液，測量尿量。試驗結束后，烏拉坦腹腔注射麻醉，取左腎于-80 ℃冷凍保存，用于利尿機制探索；衛星組大鼠于給藥前、給藥后15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、8 h、24 h 采血點取血0.3 mL，加入EDTA-2K抗凝EP管中，3 000 r·min-1、15 min離心取上清得血漿，置于-80 ℃冰箱保存待測。

1.5.3利尿作用機制探索 分別選取空白對照組、陽性對照組、商陸低劑量組、商陸皂苷甲組各3只大鼠的腎臟。剪碎組織、冰浴裂解并于12 000 r·min-1、4 ℃、離心10 min，取上清，為總蛋白溶液。總蛋白溶液與5×還原型蛋白上樣緩沖液按照4 ∶1混合，置于沸水中15 min，完成變性，置于-20 ℃保存。

分別配制不同濃度(8%、10%、12%、15%、18%、20%)的分離膠與5%的濃縮膠；設置分離膠電壓為120 V，濃縮膠電壓為75 V。溴酚藍里最底部僅1 cm時應停止電泳并轉膜。選用脫脂牛奶，置于脫色搖床上，室溫下封閉30 min。將稀釋好的一抗倒入，4 ℃于搖床上慢搖過夜并洗脫。二抗加入孵育槽，室溫下置于搖床上慢搖30 min。先后進行膠片的顯影與定影，調節曝光條件實現化學發光，使用PhotoShop軟件整理去色、Alpha軟件處理系統分析目標帶的光密度值。

1.6 藥代動力學研究

1.6.1標準溶液、隨行質控樣品(QC)及內標溶液的配制與前處理 配制1 g·L-1的商陸皂苷甲儲備液并稀釋該儲備液配制濃度為10、4、2、1、0.4、0.2、0.1 mg·L-1的標準工作溶液。質控工作溶液的配制同標準工作溶液的配制，質控工作溶液的質量濃度為8、2、0.2 mg·L-1。同方法以1 g·L-1的人參皂苷Rg1儲備液配制濃度10、2、1 mg·L-1的內標工作溶液。

取95 μL空白血漿加5 μL的標準工作溶液，配制為標準曲線樣品，質量濃度依次為500、200、100、50、20、10、5 μg·L-1；隨行質控樣品溶液配制同標準曲線樣品溶液的配制，質量濃度為400、100、10 μg·L-1。

取配制好的標準曲線樣品溶液與隨行質控樣品溶液，加入10 μL內標工作溶液(1 mg·L-1)渦旋30 s充分混勻；加入300 μL乙腈，渦旋3 min，15 000 r·min-1、10 min離心2次，取上清，加入放內襯管的進樣瓶中用于下一步分析。

取100 μL空白血漿，加入300 μL乙腈后同樣渦旋與離心取上清。單空白溶液：取100 μL空白血漿，加入10 μL內標工作溶液后渦旋，再加入乙腈，然后同步驟操作。

將采集到的待測血漿樣品，按蛋白沉淀法進行前處理。取待測血漿樣品100 μL，加入10 μL內標工作溶液(1 mg·L-1)渦旋30 s充分混勻；加入300 μL乙腈，渦旋3 min，15 000 r·min-1、10 min離心兩次，取上清，加入放內襯管的進樣瓶中用于分析。

1.6.2液質分析條件 色譜分析條件：采用Waters ACQUITY UPLC CSH C18色譜柱(1.7 μm，3.0×100 mm)；流動相0.1%甲酸溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫，0～1 min，90%(A)- 10%(B)，1～3 min，10%(A)-90%(B)，3～4 min，90%(A)-10%(B)；流速0.2 mL·min-1，柱溫30 ℃，樣品室溫度10 ℃，進樣量2 μL。

質譜分析條件：采用電噴霧離子源(ESI)，正離子方式監測。離子源噴霧電壓(IS)：5 500 V；溫度：400 ℃；源內氣體1(GS1，N2)壓力：30 psi；氣體2(GS2，N2)壓力：45 psi；氣簾氣體(N2)壓力：30 psi；碰撞氣(CAD，N2)壓力：30 psi；掃描方式為多反應監測(MRM)；用于定量分析的離子反應分別為m/z 849.5→m/z 805.6(商陸皂苷甲)和m/z 823.7→m/z 643.8(內標)，去簇電壓(DP)為100 V，射入電壓(EP)為8 V，碰撞能量(CE)分別為67 eV，碰撞室射出電壓(CXP)為33 V[9-10]。

2 結果

2.1 商陸利尿作用與空白對照組相比，模型組尿量在0～4 h與0～6 h均明顯升高(P<0.01)，說明水負荷模型造模成功；與模型組相比，陽性對照組尿量在0～2 h、0～4 h、0～6 h均明顯增加(P<0.01)，商陸低劑量組(0.9 g生藥·kg-1)尿量在0～2 h、0～4 h、0～6 h均顯著升高(P<0.01)，商陸中劑量組(1.8 g生藥·kg-1)尿量在0～6 h明顯增加(P<0.01)，商陸高劑量組(3.6 g生藥·kg-1)尿量在4～6 h(P<0.05)、0～6 h(P<0.01)明顯增加，商陸皂苷甲組尿量在0～6 h明顯升高(P<0.05)。因此，商陸低、中、高劑量組以及商陸皂苷甲均有明顯的利尿作用。每組大鼠各時間段的尿量值見Fig 1。

Fig 1 Urine volume value of each group of rats in each time

2.2 商陸利尿作用機制Western blot結果以及相對灰度值統計顯示，與空白對照組相比，陽性對照組大鼠腎臟組織中水通道蛋白AQP2、AQP4的蛋白表達明顯被抑制(P<0.01)，血管緊張素Ⅱ1型受體(ATGR1)、血管緊張素Ⅱ2型受體(ATGR2)、腎素(Renin)的蛋白表達無明顯改變；與空白對照組相比，商陸(0.9 g生藥·kg-1)組大鼠腎臟組織中水通道蛋白AQP2、AQP4的蛋白表達明顯被下調(P<0.01)，ATGR1、Renin的蛋白表達明顯降低(P<0.01)，ATGR2蛋白的表達無明顯改變；與空白對照組相比，商陸皂苷甲(EsA)組大鼠腎臟組織中水通道蛋白AQP2、AQP4的蛋白表達明顯下調(P<0.01)，ATGR1(P<0.05)、Renin(P<0.01)蛋白的表達明顯降低，ATGR2蛋白的表達無明顯改變。見Fig 2。

Fig 2 Protein expression of aquaporin and RAAS system and relative gray

2.3 藥代參數應用建立的LC-MS/MS方法，商陸低、中、高劑量組的藥代動力學參數見Tab 1。商陸低劑量組大鼠血漿中EsA的Cmax為(23.2±8.32) μg·L-1、AUC0-t為(147.56±30.82) h·ng·mL-1，商陸中劑量組大鼠血漿中EsA的Cmax為(61.13±6.96) μg·L-1、AUC0-t為(152.00±51.00) h·ng·mL-1，商陸高劑量組Cmax大鼠血漿中EsA的為(75.67±14.08) μg·L-1、AUC0-t為(179.3±36.96) h·ng·mL-1。商陸皂苷甲(5 mg·kg-1)組組大鼠血漿中EsA的Cmax為(46.70±23.98) μg·L-1、AUC0-t為(130.18±31.76) h·ng·mL-1。EsA在SD大鼠體內吸收迅速，0.5～1 h內即可達到血藥濃度峰值。商陸低、中、高劑量組與商陸皂苷甲組的藥-時曲線見Fig 3。

Fig 3 The drug-time curve of EsA in rat plasma after administration

3 討論

本研究結果顯示，商陸0.9 g生藥/kg利尿作用最為顯著。藥典記載商陸的人臨床用量為3～9 g/60 kg(即0.05～0.15 g·kg-1)，大鼠等效劑量為0.3～0.9 g·kg-1，大鼠藥效劑量與藥典中人臨床用量9 g/60 kg等效劑量相同，確證藥典中商陸的人臨床使用量有效，同時EsA也具有利尿作用，EsA為商陸利尿作用的主要成分之一。商陸中、高劑量組(1.8、3.6 g生藥·kg-1)的利尿效果并未隨劑量的升高而升高，反而低劑量利尿作用最好，具體原因還有待進一步研究。

根據Western blot結果，氫氯噻嗪可以下調AQP2、AQP4蛋白的表達，但沒有影響ATGR1、ATGR2、Renin、ALD的蛋白表達，說明氫氯噻嗪可以通過抑制水通道蛋白的表達而發揮利尿作用，其利尿機制與RAAS系統無關。

文獻中報道，商陸的利尿機制為抑制水通道蛋白的表達以及調節血液內體液代謝相關激素的水平[11-12]。本研究表明商陸可以明顯下調AQP2、AQP4、蛋白的表達，驗證了文獻中商陸抑制水通道蛋白表達的利尿機制。

文獻報道，其他利尿中藥的利尿機制與腎素-血管緊張素-醛固酮系統相關[13- 14]，說明中藥的利尿機制可能涉及腎素-血管緊張素-醛固酮系統。本文檢測腎臟中RAAS系統中相關蛋白的表達情況，結果顯示商陸明顯下調ATGR1、Renin蛋白的表達，ATGR2與ALD的表達無明顯改變，說明商陸可以抑制血管緊張素Ⅱ1型受體與腎素的表達，進而減少血管緊張素Ⅱ的產生，從而減少醛固酮與抗利尿激素的產生，降低腎小管與集合管的重吸收，從而加大尿量，發揮利尿作用。

藥效試驗中商陸水提物濃度較低(0.9、1.8、3.6 g生藥·kg-1)，本批次商陸藥材中藥效成分商陸皂苷甲的含量在我們課題組其它試驗中經測量為0.27%，因此大鼠血漿中檢測到的EsA的含量也較低。從檢測結果看，體內暴露量與給藥劑量存在一定的量效關系，商陸皂苷甲體內暴露量與商陸水提物低劑量組接近，進一步提示商陸皂苷甲為商陸藥效的主要成分之一。

綜上所述，0.9、1.8、3.6 g生藥·kg-1的商陸水提物皆有顯著利尿作用，0.9 g生藥·kg-1的商陸水提物的利尿作用最為顯著，商陸皂苷甲(5 mg·kg-1)也顯示利尿作用，為商陸利尿藥效的主要成分之一。商陸的利尿作用機制為：一為抑制水通道蛋白AQP2、AQP4蛋白的表達，二為抑制腎素與血管緊張素Ⅱ1型受體蛋白的表達，從而抑制腎小管與集合管的重吸收，達到利尿作用。商陸皂苷甲的利尿機制與商陸利尿機制相同，提示EsA為商陸的藥效成分。商陸“量-時-效”關系研究表明商陸水提物低、中、高劑量組的Cmax與AUC0-t隨劑量升高而升高，但非線性關系。