性別差異對小鼠抗原誘導型干燥綜合征模型的影響

張 靜，田倩雯，侯仕強，周彤彤，黃 磊，顧 芳，林 寧，魏 偉，吳華勛

(1.安徽醫科大學臨床藥理研究所，抗炎免疫藥物教育部重點實驗室，抗炎免疫藥物安徽協同創新中心，安徽 合肥 230032；2.安徽醫科大學附屬滁州醫院(滁州市第一人民醫院)神經外科，安徽 滁州 239000)

干燥綜合征(Sjogren′s syndrome， SS)是一種全身性自身免疫性疾病，主要影響外分泌腺，出現大量淋巴細胞浸潤，導致黏膜表面嚴重干燥，臨床表現為口干和眼干[1-2]；也可累及肺、皮膚等其他器官[3]。目前，SS的具體發病機制尚不清楚，臨床暫無理想的藥物，以局部替代對癥治療為主，對SS的深入研究具有重要意義[4]。C57BL/6J小鼠是實驗研究常用的小鼠，具有繁殖快和遺傳穩定的特點，通過對其頜下腺勻漿作為抗原背部多點皮內注射，誘導成為SS動物模型[5]。SS動物模型的研究為SS的發病機制和治療干預提供了重要實驗方法，在SS的研究中較少涉及到對影響動物成模的因素的研究[6]。

SS具有明顯的性別差異，男女比例約為1 ∶9[7]，提示性別差異可能影響SS的發病過程。研究人員常采用雌性動物作為SS的動物模型，很少采用雄性動物，為探討性別差異對抗原誘導型SS模型的影響，并比較雌、雄SS動物模型在SS樣表現和病理表現的差異，選用雌性和雄性C57BL/6J小鼠，背部多點皮內注射自身抗原，誘導小鼠SS模型，成模后對雌性和雄性小鼠的SS模型小鼠造模成功率、全身表現、病理評分及脾臟T、B細胞的比例進行分析，對比雌性和雄性C57BL/6J小鼠對抗原誘導SS模型的成模過程以及成模效果的影響，為以后研究SS選取雌、雄動物提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物C57BL/6J小鼠購買自斯貝福(北京)生物技術有限公司，生產許可證號為SCXK(京)2019-0010。選取60只SPF級，8周左右的雌、雄C57BL/6J小鼠，飼養于安徽醫科大學臨床藥理研究所SPF動物實驗室。動物實驗計劃由安徽醫科大學臨床藥理研究所動物倫理委員會同意實施(倫理審查批號：LLSC20200667)。

1.2 試劑弗氏完全佐劑(Freund′s adjuvant complete，FCA)(批號：F5881)，弗氏不完全佐劑(Freund′s incomplete adjuvant，FIA)(批號：F5506)購自美國Sigma-Aldrich公司，注射用鹽酸替來他明鹽酸唑拉西泮(Zoletil50)(2020外獸藥證字06號)購自法國Virbac公司；毛果蕓香堿(pilocarpine hydrochloride)(批號：ab141301)購自英國Abcam公司；流式抗體CD4(批號：553650)、IL-17(批號：560184)、RORγ(批號：562607)、CD25(批號：557192)、Foxp3(批號：560408)、CD19(批號：553785)、CD138(批號：558626)、CD27(批號：558754)購自美國BD公司。

1.3 動物分組將雌、雄小鼠各隨機分為兩組，即雌性和雄性小鼠造模組(每組各20只)，雌性和雄性小鼠正常組(每組各10只)，共計4組。

1.4 SS模型的建立另取雌、雄C57BL/6J小鼠各4只，處死小鼠后新潔爾滅浸泡10 min，超凈工作臺上解剖小鼠，取頜下腺組織，分離黏膜和結締組織，用PBS洗凈，置于高壓滅菌后的紗布吸干多余液體，稱質量，剪碎，每0.1 g加1 mL PBS，在冰上用研缽研磨，研磨約20 min至組織完全研碎。4 ℃離心機3 000 r·min-1離心15 min，棄上層脂質，吸取上清液，置15 mL無菌離心管。BCA法蛋白定量后用PBS將抗原稀釋成5 g·L-1，加等量FCA，使抗原最終濃度調整為2.5 g·L-1[8]。以第一次注射抗原為d 0，d 0、7、14，模型組小鼠背部消毒后多點皮內注射同性別小鼠的抗原，注射劑量為 0.1 mL·20 g-1。d 21用FIA注射加強小鼠免疫，注射抗原劑量和方式同前。

1.5 體質量和全身情況觀察從造模開始d 0、d 7、d 14、d 21、d 28、d 35、d 42稱取小鼠體質量，觀察小鼠有無舔舌，抓撓口唇、全身皮膚破損等現象。

1.6 唾液量造模6周后，測量所有小鼠的唾液量。測量前麻醉，小鼠肌肉注射鹽酸替來他明鹽酸唑拉西泮(替來他明 ∶唑拉西泮=1 ∶1)(稀釋10倍，濃度為5 g·L-1，以體重20 g的小鼠為例，肌肉注射60 μL)，完全麻醉后立刻腹腔注射0.025 g·L-1毛果蕓香堿溶液，注射劑量為0.1 mL·20 g-1[9]，注射5 min后收集唾液，將已經稱好質量(M1)的棉球放入小鼠口頰內，收集10 min(注意觀察棉球是否掉落)，取出棉球分析天平上稱質量(M2)[唾液分泌量(mg)=M2-M1]。對造模組唾液量無顯著變化的小鼠進行剔除，計算造模成功率。

1.7 頜下腺指數和頜下腺病理d 42處死小鼠，取頜下腺稱質量計算頜下腺指數[頜下腺指數=頜下腺質量(mg)·小鼠體質量(g)-1]，立即將頜下腺用4%多聚甲醛固定[10]，固定24 h后，石蠟包埋切片制作病理切片，HE染色后，顯微鏡下觀察拍照，對頜下腺組織進行病理評價。采用Chisholm和Mason評判標準分級，0級，無淋巴細胞浸潤；1級，輕度淋巴細胞浸潤；2級，中度浸潤，即在每4 mm2內小于1個浸潤灶(浸潤灶是指有50個或更多的淋巴細胞)；3級，每4 mm2內有1～2個浸潤灶；4級每4 mm2內有2個或以上浸潤灶[11]。

1.8 脾臟T淋巴細胞分析處死小鼠后，新潔爾滅浸泡5 min 后無菌操作臺取小鼠脾臟，淋巴細胞分離液提取小鼠脾臟淋巴細胞，鋪板、刺激、洗細胞、表面抗體4 ℃孵育30 min、洗細胞、固定10 min、洗細胞、破膜10 min、洗細胞、胞內抗體4 ℃孵育30 min、洗細胞、過濾網上機，流式細胞術分析小鼠脾臟Treg細胞、Th17細胞的變化。

1.9 脾臟B淋巴細胞分析提取小鼠脾臟淋巴細胞，加入相應抗體4 ℃孵育30 min，清洗細胞過濾網上機，流式細胞術分析小鼠脾臟漿細胞、記憶B細胞的變化。

1.10 統計學處理數據分析使用GraphPad Prism 6.0軟件，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。

2 結果

2.1 雌性和雄性小鼠造模后體質量及全身情況變化在SS的造模過程中，雌、雄模型組小鼠體質量均低于同性別正常組，在d 28雌性小鼠模型組和正常組開始出現顯著性差異，d 35、d 42雌、雄性模型組差異均有顯著性。對比雌性模型組和雄性模型組小鼠體質量發現，與同性別正常小鼠相比，雌性SS小鼠體質量下降比雄性SS小鼠體質量下降更早更明顯(Fig 1)。全身情況觀察顯示，從d 21起，模型組小鼠先后出現抓撓口唇、皮膚，舔舌等現象，隨時間的進展這種現象越明顯，而正常組并無明顯異常，雌性SS模型組和雄性SS模型組之間差異無顯著性。

Fig 1 Changes in body weight of female and male mice

2.2 SS模型的建立，唾液量的變化及雌、雄小鼠造模成功率d 42測量所有小鼠唾液，模型組小鼠唾液量相比與同性別正常小鼠明顯下降，提示SS模型建立成功。雌性SS模型組與雄性SS模型組唾液量差異無顯著性(Fig 2)。剔除雌性和雄性模型組未成模動物，得出雌性造模成功率為75%，雄性造模成功率為60%，對比雌性和雄性C57BL/6J小鼠造模成功率發現，雌性C57BL/6J小鼠比雄性更易成模(Fig 2)。

Fig 2 Saliva flow of female and male mice n=10)

2.3 頜下腺指數SS模型小鼠與同性別正常組小鼠頜下腺指數相比，SS模型小鼠頜下腺指數明顯升高，對比雌性小鼠和雄性小鼠頜下腺指數發現，雄性SS模型小鼠頜下腺指數明顯高于雌性SS模型小鼠，雄性正常組小鼠頜下腺指數也高于雌性正常組小鼠(Fig 3)。

Fig 3 Salivary gland indexes of female and male

2.4 頜下腺病理病理切片顯示，SS模型小鼠頜下腺組織出現淋巴細胞浸潤，浸潤主要出現在頜下腺組織的導管附近(黑色箭頭)，雌、雄SS模型浸潤程度差異無顯著性，正常小鼠頜下腺中無淋巴細胞浸潤(Fig 4)[12]。頜下腺病理評分結果顯示，SS模型小鼠與同性別正常小鼠頜下腺病理評分對比差異具有顯著性，雌性和雄性SS小鼠頜下腺病理評分差異無顯著性(Fig 5)。

Fig 4 Pathology of submandibular gland of female and male mice(×50)

Fig 5 Submandibular gland pathological score of femaleand male mice n=5)

2.5 脾臟T淋巴細胞小鼠脾臟流式細胞術結果表明，與同性別正常組相比，雌性SS小鼠Th17(CD4+IL-17+RORγ+)細胞比例明顯升高(差異具有高度顯著性)，雄性SS小鼠差異無顯著性，雌性SS小鼠Treg(CD4+CD25+Foxp3+)細胞比例明顯降低(差異具有高度顯著性)，雄性SS小鼠明顯降低(Fig 6)。

Fig 6 Proportion of Th17 and Treg cells in spleen of female and male mice

2.6 脾臟B淋巴細胞脾臟流式細胞術結果表明，與正常小鼠相比，SS模型小鼠漿細胞(CD19+CD138+)比例明顯升高，記憶B細胞(CD19+CD27+)比例明顯降低；與同性別正常小鼠比較，雌性SS模型小鼠漿細胞和記憶B細胞比例變化相比雄性SS小鼠差異無顯著性(Fig 7)。

Fig 7 Proportion of plasma cells and memory B cells in spleen of female and male mice

3 討論

SS是一種慢性全身性自身免疫性疾病，臨床上尚無理想的治療藥物，可能與遺傳、自身免疫、激素等多種因素有關，確切的發病機制尚不清楚[13]。SS發病機制的研究需要合適的動物模型，C57BL/6J小鼠SS模型與SS患者疾病狀態相似，且具有模型制備簡單、成模較快、可很好的模擬SS患者臨床表現等優點[14]，常用于研究SS的發病機制、藥效學研究的動物模型。SS性別差異明顯，臨床患者多以中年女性為主，男女比例約為1 ∶9[7]。

為探討動物性別差異對SS模型建立的影響，采用8周左右的雌、雄C57BL/6J小鼠，通過對其背部多點皮內注射同批同性別頜下腺蛋白制成的抗原，誘導建立SS動物模型，在第5周雌性SS模型組小鼠體質量與正常組差異有顯著性，雄性SS模型組小鼠第6周差異出現顯著性，與雄性SS模型小鼠比，雌性SS小鼠體質量下降更早，出現顯著性差異，可能相比雄性小鼠，雌性小鼠對炎癥反應更強烈，導致食欲減退；造模后的第4周起，開始出現舔舌、抓撓口唇等現象；第6周測量所有小鼠唾液量，SS模型組小鼠唾液量與正常組比差異有顯著性，剔除未成模的小鼠，雌性和雄性SS模型小鼠唾液量差異無顯著性，雌性SS模型造模成功率高于雄性，這與女性患者發病率高的研究結果相符合；對小鼠脾臟淋巴細胞分析結果表明，與正常小鼠相比，SS模型小鼠Treg細胞和記憶B細胞比例明顯降低，Th17細胞和漿細胞比例明顯升高，提示細胞免疫和體液免疫的異常，T、B淋巴細胞的異常變化，可能與自身免疫系統的紊亂有關，導致過度自身免疫反應，與臨床SS患者免疫系統異常變化結果相符合，提示SS模型的成功建立[15-17]；雌性SS小鼠Th17和Treg細胞比例變化相比雄性SS小鼠更具有統計意義，提示雌性SS小鼠疾病情況更加嚴重，雌性激素可能加重SS的進展[18]；SS模型小鼠頜下腺指數明顯高于同性別正常組，從另一方面提示模型的成功建立，雄性SS小鼠頜下腺指數明顯高于雌性SS小鼠，這與性別本身差異有關，與SS病理嚴重程度無關。本實驗所構建的SS小鼠模型，雌性與雄性小鼠之間的SS樣表現與整體病理情況存在差異，雌性小鼠更早更易于誘導成模，且表現出更顯著的SS樣表現和病理情況。在大多數研究中，研究人員采用雌性動物作為SS的動物模型，很少采用雄性動物，在本實驗中雄性小鼠可以誘導成為實驗所需的SS動物模型，成模率偏低，嚴重程度較雌性低，可作為對男性SS發病機制、藥效學研究的一種動物模型。期望本文能對研究SS雄性與雌性的小鼠選擇提供新的參考依據，從而能更加全面的研究SS。