遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)治療聯(lián)合阿替普酶對腦梗死患者miR-199a、miR-137表達(dá)的影響

丁文婷 王心穎 高倩 魏琰 崔永健

(衡水市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 衡水 053000)

腦梗死是一種常見的腦血管疾病，指的是腦部血液循環(huán)出現(xiàn)障礙，缺氧、缺血所導(dǎo)致的局限性的腦組織的軟化及缺血性壞死，患者常會出現(xiàn)偏癱、嘔吐、感覺障礙等癥狀〔1〕。發(fā)病的部位在顱腦、頭部，主要病因是心源性栓塞、大動脈粥樣硬化及小動脈閉塞，平時可以通過控制血壓、血脂及血糖的方法來預(yù)防此病的發(fā)生〔2〕。研究表明，miR-199a、miR-137的高表達(dá)與腦梗死的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系〔3，4〕。遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)治療指的是對人體組織的器官進(jìn)行非致死及短暫的缺血后，維持缺血的過程，并提高機(jī)體對缺血的耐受能力〔5～7〕。阿替普酶為腦梗死的常用治療藥物〔8～11〕。本研究主要探討遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)治療聯(lián)合阿替普酶對腦梗死患者miR-199a、miR-137表達(dá)的影響。

1 對象與方法

1.1研究對象 選取2018年6月至2019年6月衡水市人民醫(yī)院收治的腦梗死患者158例，按照完全隨機(jī)法分為阿替普酶組和適應(yīng)聯(lián)合組各79例。阿替普酶組男40例，女39例，病程：Ⅱ期：42例，Ⅲ期：37例；年齡60～75歲，平均年齡(64.12±7.13)歲，適應(yīng)聯(lián)合組男41例，女38例，病程：Ⅱ期：43例，Ⅲ期：36例；年齡60～76歲，平均年齡(64.60±7.60)歲，兩組年齡、性別、病程差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，研究對象及家屬均簽署了知情同意書。納入標(biāo)準(zhǔn)：均為腦梗死患者，同時伴有偏癱、腦部血液循環(huán)障礙、感覺障礙等癥狀。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并腦外傷、免疫系統(tǒng)出現(xiàn)障礙、腦部腫瘤、再發(fā)腦梗死、合并腦出血、藥物過敏。藥物來源：阿替普酶(BoehringerIngelheim Pharma Gmb H & Co.KG，國藥準(zhǔn)字：S20160054)，規(guī)格：20 mg×1支/盒。

1.2方法

1.2.1治療方法 阿替普酶組使用阿替普酶治療：劑量為0.9 mg/kg，最大劑量為90 mg，將阿替普酶與100 ml的生理鹽水混合，將總劑量的10%在2 min內(nèi)進(jìn)行靜脈注射，將剩余的90%注射液在60 min內(nèi)給予靜脈滴注治療，在滴注后的24 h內(nèi)避免使用抗凝藥物及抗血小板藥物，連續(xù)治療2 w。適應(yīng)聯(lián)合組采用遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)治療聯(lián)合阿替普酶治療：血壓計袖帶壓迫一側(cè)的肱動脈充氣直至缺血5 min，接著放氣后再灌注5 min，重復(fù)3個放氣松氣的循環(huán)，接著在另一側(cè)的上肢致患者缺血5 min，接著再放氣灌注5 min，一直重復(fù)3個循環(huán)，2次1 d，治療7 d，阿替普酶用法用量同阿替普酶組。

1.2.2神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、神經(jīng)生長因子(NGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、超敏C反應(yīng)蛋白(hsCRP)檢測 抽取所有研究對象清晨空腹靜脈血5 ml，以離心半徑5 cm、3 000 r/min進(jìn)行離心處理10 min，分離上層血清，在-49℃保存待檢備用。采用酶聯(lián)吸附試驗(yàn)檢測NSE、NGF、BDNF、hsCRP，制作標(biāo)準(zhǔn)品，以1∶2的稀釋液稀釋樣品；在反應(yīng)孔中加入已稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品100 μl/孔，在37℃恒溫孵育箱中濕育2 h；用洗滌液將反應(yīng)板洗3次后，加入1∶100倍稀釋后的抗體工作液100 μl/孔，放于37℃恒溫孵育箱中濕育47.19 min；繼續(xù)清洗反應(yīng)板2次后，在反應(yīng)孔內(nèi)加入3，3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶液100 μl/孔，置于37℃恒溫孵育箱中濕育47.19 min后在反應(yīng)孔內(nèi)加入終止液100 μl/孔終止反應(yīng)，在451 nm波長測定吸光度，顏色反應(yīng)深淺與NSE、NGF、BDNF、hsCRP呈正比，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計算NSE、NGF、BDNF、hsCRP。

1.2.3同型半胱氨酸(Hcy)、纖維蛋白原(FIB)水平檢測 采用化學(xué)發(fā)光法檢測Hcy、FIB；將取出的Hcy、FIB血清制成抗體后加入發(fā)光物質(zhì)的抗體里，等待血清Hcy、FIB抗體和發(fā)光物質(zhì)抗體發(fā)生反應(yīng)后，立刻洗去多余標(biāo)記物后加入氧化反應(yīng)體系里，測定發(fā)光強(qiáng)度，將測定出來的發(fā)光強(qiáng)度換算成對應(yīng)的被檢測物的數(shù)據(jù)，即可得出Hcy、FIB的檢測結(jié)果。

1.2.4miR-199a、miR-137表達(dá)量檢測 采用熒光定量PCR檢測所有研究對象miR-199a、miR-137表達(dá)量。反應(yīng)體系：8 μl cDNA模板、10 μl SYBRP Green mix、2 μl PCR Primer mix。反應(yīng)條件：95℃ 10 min；95℃ 10 s；60℃ 1 min；40個循環(huán)。以U6為內(nèi)參，采用2-△△Ct方法計算miR-199a、miR-137表達(dá)量。內(nèi)參引物序列：5′-CTGGCACCACACCTTCTACAATGAGC-3′，下游：5′-GAGGATCTTCATGAGGTA GTCAGT-3′。miR-199a引物序列：上游：5′-GAGGATCTTCATGAGGTAGTCAGT-3′，下游：5′-CTGGCA CCACACCTTCTACAATGAGC-3′。miR-137引物序列：上游：5′-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3′，下游：5′-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′。

1.2.5臨床療效評價 根據(jù)患者臨床癥狀評價治療效果，顯效：治療后大腦缺氧、眩暈、惡心等癥狀完全消失，不會出現(xiàn)偏癱的情況。有效：大腦缺氧、眩暈等癥狀幾乎消失，但是偶爾還會出現(xiàn)惡心的癥狀。無效：治療后沒有得到任何有效的改善，甚至癥狀及病情比之前更嚴(yán)重。治療總有效率=(有效例數(shù)+顯效例數(shù))/總例數(shù)×100%。

1.2.6不良反應(yīng)情況 統(tǒng)計治療過程中患者食欲不振、癲癇發(fā)作、紅疹等不良反應(yīng)情況。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1NSE、NGF、BDNF水平比較 治療前兩組NGF、NSE、BDNF比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；治療后兩組NGF、BDNF高于治療前，NSE低于治療前，且適應(yīng)聯(lián)合組NGF、BDNF高于阿替普酶組，NSE低于阿替普酶組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見表1。

2.2Hcy、hsCRP、FIB水平比較 治療前兩組Hcy、hsCRP、FIB水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；治療后兩組Hcy、hsCRP、FIB水平低于治療前，且適應(yīng)聯(lián)合組Hcy、hsCRP、FIB水平低于阿替普酶組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見表2。

表1 兩組治療前后NSE、NGF、BDNF水平比較

表2 兩組治療前后Hcy、hsCRP、FIB水平比較

2.3miR-199a、miR-137水平比較 治療前兩組miR-199a、miR-137差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；治療后兩組miR-199a、miR-137低于治療前，且適應(yīng)聯(lián)合組miR-199a、miR-137低于阿替普酶組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見表3。

表3 兩組治療前后miR-199a、miR-137水平比較

2.4臨床療效比較 適應(yīng)聯(lián)合組治療總有效率(97.47%，顯效58例、有效19例、無效2例)高于阿替普酶組(81.01%,顯效47例、有效17例、無效15例)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=14.140,P<0.001)。

2.5不良反應(yīng)發(fā)生情況比較 適應(yīng)聯(lián)合組總不良反應(yīng)率(3.79%，食欲不振、癲癇發(fā)作、紅疹各1例)高于阿替普酶組(1.26%，紅疹1例)，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

3 討 論

腦梗死是常見的腦血管疾病，可造成神經(jīng)元的不可逆損傷，導(dǎo)致神經(jīng)功能損害，因此腦梗死治療的重點(diǎn)與難點(diǎn)是尋找有效改善神經(jīng)功能的治療手段。缺血后適應(yīng)的概念最早源于低氧預(yù)適應(yīng)，目前該方法已作為一種新型治療手段在器官移植、心腦血管病等領(lǐng)域得到運(yùn)用，并取得了確實(shí)可靠的臨床療效〔11〕。但是對患病器官開展原位缺血預(yù)適應(yīng)治療容易引起靶器官損傷，且難度較大，作為常規(guī)治療無法得到推廣，遠(yuǎn)隔缺血預(yù)適應(yīng)治療則是運(yùn)用于上肢的相對安全的缺血預(yù)適應(yīng)，并能夠有效改善腦及心臟等器官對缺血損傷的耐受性〔12〕。遠(yuǎn)隔缺血預(yù)適應(yīng)治療用于腦梗死的保護(hù)腦組織及耐受缺血損傷作用的主要原理在于，通過向上肢局部施加壓力，導(dǎo)致肢體局部缺血缺氧，機(jī)體適應(yīng)缺血缺氧狀態(tài)，并通過神經(jīng)、體液及全身反應(yīng)性調(diào)節(jié)，調(diào)動內(nèi)源性保護(hù)因子，從多角度、多靶點(diǎn)抵御腦組織缺血性損傷〔13〕。阿替普酶屬于第二代溶栓藥物，溶栓時間較尿激酶更短，溶解血栓后在腦梗死治療中臨床表現(xiàn)為神經(jīng)功能改善〔14〕。本研究提示，遠(yuǎn)隔缺血預(yù)適應(yīng)聯(lián)合阿替普酶治療在神經(jīng)功能改善方面發(fā)揮了協(xié)同作用。

BDNF、NGF均是人體神經(jīng)營養(yǎng)家族因子，能夠維持神經(jīng)元生長、分化及損傷后的修復(fù)。有研究認(rèn)為，神經(jīng)元損傷后BDNF、NGF 表達(dá)水平上升能夠加快損傷神經(jīng)元的修復(fù)，促進(jìn)神經(jīng)功能改善〔15〕。NSE則是腦灰質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞的特異性蛋白質(zhì)，缺血、缺氧損傷時細(xì)胞膜被破壞，NSE大量釋放進(jìn)入腦脊液，被認(rèn)為是一種神經(jīng)細(xì)胞損傷的標(biāo)志物〔16〕。本研究結(jié)果說明遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)聯(lián)合阿替普酶治療相較于單獨(dú)使用阿替普酶能夠促進(jìn)神經(jīng)功能改善，這與二者在神經(jīng)功能改善方面發(fā)揮協(xié)同作用有關(guān)。Hcy與動脈粥樣硬化關(guān)系密切，高Hcy被認(rèn)為是腦梗死的獨(dú)立危險因素，與腦梗死的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切〔17〕。FIB是參與凝血和止血過程中的重要蛋白纖維蛋白，與腦梗死血栓形成有直接的關(guān)聯(lián)〔18〕。hsCRP是炎癥反應(yīng)的敏感標(biāo)志物，腦梗死后病灶部位及周圍會出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)，其血清水平與腦梗死嚴(yán)重程度具有正相關(guān)關(guān)系〔19〕。本研究結(jié)果提示，遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)治療聯(lián)合阿替普酶治療在改善腦梗死病情方面效果更佳。

miRNA表達(dá)所調(diào)控的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和炎癥性疾病、代謝性疾病、免疫性疾病等疾病可作為基因靶向藥物，均說明miRNA不僅與疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，還可用于疾病的診治，miR-199a、miR-137主要來源于病變的組織細(xì)胞，與臨床預(yù)后相關(guān)〔20〕。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在治療后腦梗死患者miR-199a、miR-137的水平明顯降低，說明遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)治療聯(lián)合阿替普酶可增強(qiáng)患者身體功能的恢復(fù)，提高患者預(yù)后感，有良好的治療效果。

綜上所述，遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)治療聯(lián)合阿替普酶治療腦梗死，可顯著改善患者神經(jīng)因子的水平，促進(jìn)臨床癥狀恢復(fù)，對腦梗死有良好的療效，效果顯著。