糖尿病腎病患者外周血LncRNA KCNQ1OT1表達(dá)與氧化應(yīng)激水平及TGF-β1/p38MAPK通路的關(guān)系

張玉靜 劉倩

(邢臺(tái)市人民醫(yī)院腎內(nèi)科，河北 邢臺(tái) 054000)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病(DM)的一種重要微血管病變，其發(fā)病率占DM的30%～35%，同時(shí)也是導(dǎo)致終末期腎病的一個(gè)主要原因〔1〕。由于DN呈漸進(jìn)式緩慢發(fā)展，患者起病較為隱匿，加之目前由于臨床診斷手段的局限性，給患者的早期診斷及治療帶來(lái)了阻礙〔2〕。目前研究顯示〔3〕，長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)異常表達(dá)在多種疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演重要角色。LncRNA作為一類長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸的功能性RNA，可在多水平調(diào)控機(jī)體基因表達(dá)，從而發(fā)揮相應(yīng)的調(diào)控作用〔4〕。研究顯示〔5〕，LncRNA的表達(dá)調(diào)控與多種內(nèi)分泌及代謝疾病密切相關(guān)。本研究探討DN患者外周血LncRNA電壓門(mén)控鉀通道亞家族Q1重疊轉(zhuǎn)錄物(KCNQ1OT)1表達(dá)與氧化應(yīng)激水平及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1/p38絲裂素活化蛋白激酶(MAPK)通路的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選擇2017年3月至2019年12月邢臺(tái)市人民醫(yī)院收治的2型糖尿病(T2DM)患者162例，其中T2DM合并DN患者75例作為DN組，其余單純T2DM患者87例作為DM組。此外，選擇同期醫(yī)院健康體檢人員80例作為對(duì)照組。3組受試者性別、年齡、收縮壓、舒張壓、體重指數(shù)(BMI)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，DN組與DM組DM病程比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2納入標(biāo)準(zhǔn)與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①T2DM診斷符合世界衛(wèi)生組織(WHO)T2DM相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)；②DN符合《內(nèi)科學(xué)》相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)〔6〕；③受試者自愿簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并惡性腫瘤、心血管疾病、肝損傷及其他腎臟疾病者；②合并原發(fā)性高血壓；③合并嚴(yán)重認(rèn)知功能障礙者；④合并外傷、感染及自身免疫性疾病者；⑤繼發(fā)性DM患者。

表1 3組臨床資料比較

1.3LncRNA KCNQ1OT1、TGF-β1、P38MAPK、半胱天冬酶(Caspase)-3 mRNA檢測(cè) 抽取各組受試者清晨空腹靜脈血，應(yīng)用Trizol(美國(guó)Invitrogen公司)試劑提取血清中總RNA。提取外周血RNA，參照AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用2×SYBR Green PCR Master Mix，以cDNA為模板，進(jìn)行qRT-PCR。根據(jù)目標(biāo)基因設(shè)計(jì)合成上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以GAPDH作為內(nèi)參基因，引物序列：LncRNA KCNQ1OT1上游引物：5′-CCCAGAAAT CCACACCTCGG-3′，下游引物：5′-TCCTCAGEGAGCAGATGGAGA-3′；TGF-β1上游引物：5′-CGCGAG CTGTCAATTGACTT-3′，下游引物：5′-TCGACTGCAC TTGCAGGTGC-3′；P38MAPK上游引物：5′-GCTTGTT TCCTGGTACAGACC-3′，下游引物：5′-CAGTTTCT CTTGGTCAAGGG-3′；Caspase-3上游引物：5′-ATGGACAACTTGGAAACCTCCGTG-3′，下游引物：5′-CC ACTCCCAGTCAAACCTTTAGTG-3′；GAPDH上游引物：5′-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3′，下游引物：5′-GTCCACCACCCGATTGCTGTAG-3′。引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR條件：95℃ 10 min，95℃ 15 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。以2-△△Ct值表達(dá)各目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.4氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè) 抽取各組受試者空腹靜脈血，4 000 r/min離心10 min分離血清，然后置于-20℃冰箱內(nèi)保存待測(cè)。采用分光光度計(jì)檢測(cè)血清超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)活性。采用比色法檢測(cè)血清活性氧(ROS)，檢測(cè)嚴(yán)格參照試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS22.0進(jìn)行方差分析、t檢驗(yàn)、秩和檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)、受試者工作特征(ROC)曲線。

2 結(jié) 果

2.13組外周血LncRNA KCNQ1OT1表達(dá)比較 DN組和DM組外周血LncRNA KCNQ1OT1相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(4.585±1.470、3.227±1.027、1.974±0.602，P<0.05)，其中DN組外周血LncRNA KCNQ1OT1相對(duì)表達(dá)量顯著高于DM組(P<0.05)。

2.23組外周血TGF-β1、p38MAPK及Caspase-3 mRNA表達(dá)比較 DN組和DM組外周血TGF-β1、p38MAPK、Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，其中DN組外周血TGF-β1、p38MAPK、Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于DM組(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 3組外周血TGF-β1、p38MAPK及Caspase-3 mRNA表達(dá)比較

2.33組血清氧化應(yīng)激指標(biāo)比較 DN組和DM組血清MDA、ROS顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，SOD顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，其中DN組血清MDA、ROS顯著高于DM組(P<0.05)，DN組血清SOD顯著低于DM組(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 3組血清氧化應(yīng)激指標(biāo)比較

2.4LncRNA KCNQ1OT1表達(dá)與TGF-β1/p38MAPK通路相關(guān)性 DN患者外周血LncRNA KCNQ1OT1表達(dá)與TGF-β1、p38MAPK、Caspase-3 mRNA、MDA、ROS呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，外周血LncRNA KCNQ1OT1表達(dá)與SOD呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 DN患者外周血LncRNA KCNQ1OT1表達(dá)與TGF-β1/p38MAPK通路相關(guān)性

2.5ROC曲線分析LncRNA KCNQ1OT1對(duì)DN的診斷價(jià)值 T2DM患者中LncRNA KCNQ1OT1對(duì)DN的診斷價(jià)值ROC曲線下面積為0.875，見(jiàn)圖2。

圖2 ROC曲線分析LncRNA KCNQ1OT1對(duì)DN的診斷價(jià)值

3 討 論

DN的發(fā)生及發(fā)展主要原因與長(zhǎng)期血糖控制不佳而導(dǎo)致的腎單位局部氧化應(yīng)激損傷等有關(guān)，尤其在具有相關(guān)高危因素的人群當(dāng)中具有更高的DN發(fā)生率〔7〕。目前臨床上對(duì)于DN患者的總體治療有效率較低，雖然可在短期內(nèi)抑制患者腎功能的惡化，但患者治療后病情復(fù)發(fā)率仍較高〔8〕。因此對(duì)于DN發(fā)病機(jī)制過(guò)程中相關(guān)生物學(xué)因子的研究，可揭示疾病發(fā)病原因提供相應(yīng)的理論基礎(chǔ)，從而也為DN的治療，尤其是免疫及生物學(xué)靶向治療提供相應(yīng)的依據(jù)〔9〕。

LncRNA KCNQ1OT1是一個(gè)位于KCNQ1位點(diǎn)上的長(zhǎng)鏈非編碼RNA基因，近年來(lái)研究顯示，印跡基因的異常表達(dá)可引發(fā)伴有復(fù)發(fā)突變和表型缺陷的多種人類疾病，同時(shí)印跡基因的異常表達(dá)與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，也與機(jī)體炎癥及血管相關(guān)性疾病有關(guān)〔10〕。本研究結(jié)果與相關(guān)研究報(bào)道結(jié)果相似〔11〕，LncRNA KCNQ1OT1在T2DM及DN的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用。本研究ROC曲線提示T2DM患者外周血LncRNA KCNQ1OT1對(duì)DN具有良好的診斷價(jià)值。

DN發(fā)生時(shí)，高血糖及代謝紊亂所產(chǎn)生的糖基化終末產(chǎn)物可導(dǎo)致患者機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)之下，從而引發(fā)腎臟局部炎癥、腎臟血流動(dòng)力學(xué)的改變，進(jìn)而促進(jìn)各種細(xì)胞因子的大量釋放，最終可導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的增多，引發(fā)腎小球基底增厚及腎小球硬化〔12，13〕。目前研究顯示〔14，15〕，TGF-β1高表達(dá)與多種原因所引起的腎小球硬化及腎臟纖維化具有密切聯(lián)系。且近年來(lái)研究顯示〔16,17〕，TGF-β1介導(dǎo)的足細(xì)胞損傷在DN蛋白尿發(fā)生、發(fā)展及腎小球硬化過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其中腎臟氧化應(yīng)激是導(dǎo)致足細(xì)胞凋亡的一種主要原因，而TGF-β1及Caspase-3是氧化應(yīng)激所導(dǎo)致足細(xì)胞損傷凋亡的重要細(xì)胞因子。而p38MAPK作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的交匯點(diǎn)，能夠被多種細(xì)胞外刺激所活化，從而對(duì)細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)及分化發(fā)生相應(yīng)的調(diào)控作用，可介導(dǎo)TGF-β1誘發(fā)的系膜區(qū)基質(zhì)沉積〔18〕。此外，氧化應(yīng)激所誘導(dǎo)的p38MAPK激活可進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞凋亡因子Caspase-3引起的足細(xì)胞凋亡〔19〕。本研究結(jié)果與相關(guān)研究結(jié)果相似〔20〕，DN患者LncRNA KCNQ1OT1的異常表達(dá)與TGF-β1/p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活有關(guān)。

有研究提出〔21〕，機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)的增強(qiáng)將導(dǎo)致巨大的損害，大大加速了DN的病程進(jìn)展。在DN患者腎組織中ROS濃度的升高，過(guò)量的ROS將導(dǎo)致腎臟負(fù)擔(dān)，進(jìn)一步引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)〔22〕。SOD作為一種自由基清除劑，可間接反映機(jī)體氧自由基水平；MDA作為一種脂質(zhì)過(guò)氧化物，可反映機(jī)體過(guò)氧化強(qiáng)度；ROS由線粒體產(chǎn)生，過(guò)量的ROS也是導(dǎo)致腎臟損傷的重要因素〔23〕。本研究MDA、ROS、SOD結(jié)果與學(xué)者研究結(jié)果相似〔24〕，提示DN患者存在明顯的氧化應(yīng)激，氧化應(yīng)激損傷可能是導(dǎo)致DN進(jìn)展的重要原因，DN患者LncRNA KCNQ1OT1表達(dá)與MDA、ROS呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，與SOD呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。進(jìn)一步提示糖尿病腎病患者LncRNA KCNQ1OT1的異常表達(dá)與機(jī)體的氧化應(yīng)激狀態(tài)有關(guān)。

由于本研究納入樣本量較小，且DN疾病發(fā)展機(jī)制較為復(fù)雜，受多通路多基因調(diào)控的影響，進(jìn)一步研究還需要擴(kuò)大樣本量，并進(jìn)行進(jìn)一步深入研究分析。

綜上所述，DN患者可出現(xiàn)外周血LncRNA KCNQ1OT1異常表達(dá)，且其表達(dá)情況與患者氧化應(yīng)激水平及TGF-β1/p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活有關(guān)，LncRNA KCNQ1OT1對(duì)DN具有良好的診斷價(jià)值。