血清中乳酸標準物質的研制

丁 敏， 孟嬌然， 夏 娃

(上海市計量測試技術研究院，上海 201203)

0 引 言

乳酸是人體能量代謝過程的中間產物，它與糖、脂、蛋白質代謝以及細胞內的能量代謝有著密切的關系。乳酸廣泛應用于臨床醫學，作為糖尿病等多種代謝性疾病及膿毒癥、感染性休克、急性心衰、惡性腫瘤等多種危重疾病治療和診斷的指標，可用于確定疾病的嚴重程度及評估對治療干預的反應[1]，也廣泛應用于運動醫學的人體乳酸代謝研究[2]。近年隨著研究的深入，乳酸可能是三羧酸循環最主要的能量物質原料[3]，也有認為乳酸的升高不僅是指導疾病治療的指標，它還很可能為人體最重要的能量載體和癌細胞最重要的直接營養來源，其含量監測可能為癌癥等疾病的研究打開新的思路[4]，也有研究表明乳酸也是一種重要的臨床信號分子[5]。因此臨床乳酸含量準確檢測能為疾病的診斷、治療、轉歸預測以及腫瘤學代謝等研究提供有效的參考。目前化學實驗室常用乳酸檢測方法有滴定法[6]、氣相色譜法[7]、液相色譜法[8]，主要應用于食品添加劑中乳酸的檢測；臨床實驗室基于快速檢測需要常用的乳酸檢測方法反應機理有乳酸氧化酶和乳酸脫氫酶法，檢測方法有電化學法和光學法等，測量樣本對象包括血清、全血、尿液、腦脊液等[9-12]。在實際測量過程中，由于檢測原理和儀器類型的差異，還有同類型儀器核心耗材和校準液的不同，儀器質量參差不齊，乳酸檢測結果存在顯著性的差異。

由于我國尚未建立完整的血清乳酸量值溯源（參考測量）系統，沒有建立臨床血清乳酸參考方法，經檢索國內和國際標準物質數據庫（包括NIST、LGC、IRMM、JCTLM），未查詢到血清中乳酸標準物質，難以對血清乳酸測定值的準確性進行有效地評價，相應臨床儀器的量值溯源工作一直難以開展。基于以上問題，本文研制了血清中乳酸標準物質，采用同位素稀釋質譜法（IDMS）進行標準物質定值，IDMS是一項基準方法，具有最高的計量特性，在臨床參考系統方面有著廣泛的應用，如用于參考測量程序的建立，血清基體標準物質的定值以及國際比對等[13]，該標準物質能為臨床乳酸檢測提供量值溯源的依據。由于人體只具有代謝L-（+）-乳酸的酶（L-乳酸脫氫酶），因此本文研究的標準物質為血清中的 L-（+）-乳酸標準物質。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

超高效液相色譜-串聯質譜聯用儀(ACQUITY UPLC I-Class/Xevo TQ-S，美國 waters 公司)；電子天平（XS205型，瑞士梅特勒-托利多公司）；酶膜法乳酸分析儀（YSI2500，美國YSI公司）。

L-（+）-乳酸 ： ≥98%，L6402（美國 Sigma-Aldrich 公司) ；同位素標記 L-乳酸鈉：13C3，CLM-1579-0（美國劍橋同位素實驗室) ；氫氧化鈉滴定溶液標準物質：GBW(E)080494，0.5 mol/L，Urel=0.3%（k=2）（上海市計量測試技術研究院）；硫酸滴定溶液標準物質：GBW(E)080496，0.1 mol/L，Urel=0.3%（k=2）（上海市計量測試技術研究院）；其他試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準物質的制備和封裝

標準物質采用人血清作為基質，血清需經生物安全性檢測未檢出乙肝表面抗原 (HbsAg)、人類免疫缺陷病毒(HIV)抗體 、丙型肝炎病毒(HCV)，具有良好的生物安全性保障。將冷凍血清采用逐步解凍法解凍至常溫后，搖晃均勻，在酶膜法乳酸分析儀上檢測初始濃度為（5±0.5） mol/L，平均分為3份，根據臨床乳酸分析儀測量范圍0～30 mol/L設定目標濃度為 5 mol/L、10 mol/L、15 mol/L。使用 L-（+）-乳酸純物質配制5 mol/L乳酸濃溶液，根據初始濃度添加適量乳酸溶液，低速混勻使乳酸充分溶解，得到3個濃度水平的血清中乳酸標準物質候選物。采用酶膜法乳酸分析儀對每個濃度水平的候選物進行均勻性初檢，符合要求后分裝于滅菌后的0.5 mL離心管，-80 ℃速凍。

1.2.2 均勻性評估

根據 JJF 1343—2012《標準物質定值的通用原則及統計學原理》[14]，每個濃度水平標準物質隨機抽取15個單元，采用酶膜法乳酸分析儀進行均勻性檢測，該方法可直接對樣本進行分析，避免引入樣本處理過程中的隨機影響因素，經評定該方法的精密度水平優于標準物質的定值方法，靈敏度能有效滿足標準物質的檢測要求，且每次檢測前采用經滴定溯源的乳酸溶液進行儀器校準，確保方法的溯源性。以隨機次序進行檢測，每個單元平行檢測3次，采用單因素方差分析法對檢測結果進行評價。

1.2.3 穩定性評估

1）長期穩定性。采用經典穩定性評估法對標準物質的長期穩定性進行評估。參考均勻性評估對方法精密度的要求，采用酶膜法乳酸分析儀對-80 ℃條件保存的標準物質的乳酸濃度進行監測，該方法可直接對樣本進行分析，避免引入樣本處理過程中的隨機影響因素，經評定該方法的精密度水平優于標準物質的定值方法，靈敏度能有效滿足標準物質的檢測要求，且每次檢測前采用經滴定溯源的乳酸溶液進行儀器校準，確保方法的溯源性。檢測時間間隔先密后疏，分別在樣品制備完成后當天、0.5，1，2，3，6，9個月進行檢測，每次檢測抽取每個濃度水平標準物質各3個單元，每個單元平行測定3次取算術平均值為乳酸濃度檢測結果。在動力學機理未知的情況下，對時間和濃度值進行線性擬合，得到穩定性評估模型為：

式中：Y——乳酸濃度值；

X——時間；

β0和β1——擬合曲線的截距和斜率。

對監測數據統計，用t檢驗法進行評價，若β1小于t（0.95,7-2）與 β1的標準偏差s（β1）的乘積則判定標準物質量值在監測時間段在相應保存條件下穩定。

2）短期穩定性。采用同步穩定性評估法對標準物質的短期穩定性進行評估。制備好血清標準物質凍入-80 ℃ 冰箱后，第 1，15，22，26，28 天分別取出置于-20 ℃冰箱中冷凍保存，每次取3瓶，第29天-20 ℃冰箱中保存的標準物質連同-80 ℃冰箱保存的每個濃度3瓶標準物質全部取出（-20 ℃保存天數分別為第 0，1，3，7，14，28 天），采用酶膜法乳酸分析儀進行檢測，以長期穩定性同樣方法統計評價。

1.2.4 標準物質的定值

標準溶液配制：采用液相色譜質譜聯用法對血清中乳酸標準物質進行定值，配制1 g/L乳酸標準溶液和1 g/L乳酸鈉同位素內標溶液，移取相應體積的乳酸標準溶液和乳酸鈉同位素內標溶液按照表1配制系列質量比標準溶液，檢測時以20%甲醇水溶液稀釋標準溶液5倍進樣。

表1 乳酸與乳酸鈉內標質量比標準溶液配制方法

血清標準物質處理：移取100 μL待測血清樣品至1.5 mL離心管中，加入50 μL 1 g/L乳酸鈉同位素內標溶液。加入1 000 μL甲醇，渦旋30 s后以14 000 r/min的轉速離心15 min。上清液用0.22 μm尼龍濾膜過濾。移取200 μL濾液至進樣瓶中再加入800 μL去離子水，渦旋10 s將溶液充分混勻作為標準物質處理液。

以液相色譜質譜聯用儀對標準溶液和標準物質處理液進行分析。色譜條件：色譜柱Waters ACQUITY BEH C18 2.1 mm × 100 mm，1.7 μm；流動相：A相為H2O，含0.1%（V/V）甲酸，B相為乙腈；流量：0.2 mL/min；進樣體積：2 μL；柱溫：40℃；標準溶液檢測方法梯度：95%A相，等度運行2.5 min；血清樣品檢測方法梯度見表2。

表2 血清樣品檢測方法梯度

質譜條件：掃描方式為負離子模式；檢測方式為多重反應監測（MRM）；乳酸及內標離子對檢測參數見表3；毛細管電壓1.0 kV；脫溶劑氣流量800 L/h；脫溶劑氣溫度500 ℃。

表3 乳酸及內標離子對檢測參數

以乳酸峰面積與乳酸鈉同位素的峰面積比值作為縱坐標，乳酸與乳酸鈉同位素質量比0.2～2.0、1.0～3.0和2.0～4.0范圍分別作為橫坐標，分別用最小二乘法擬合建立標準曲線，將血清樣品的峰面積比值帶入對應標準曲線計算得到血清中乳酸含量。

乳酸標準溶液配制用乳酸純物質參照GB 1886.173—2016 《食品安全國家標準 食品添加劑乳酸》[6]中的滴定法進行定值，以氫氧化鈉、硫酸有證標準物質滴定，以離子色譜法對滴定的干擾因素中的有機酸、無機酸進行定值和扣除后的結果作為標準值[15]。定值用液相色譜質譜聯用法經方法學檢驗，回收率大于95%，通過比較乳酸和乳酸鈉同位素內標在校準溶液和基質匹配校準溶液中的曲線斜率來判斷基質效應，結果證明同位素稀釋質譜法可以抵消基質效應帶來的影響，保證了方法的量值溯源性。

多家實驗室隨機抽取高、中、低3個濃度水平血清中乳酸標準物質各3個單元，每個單元重復檢測3次，確定各實驗室數據符合正態分布后，對每個實驗室定值原始數據進行異常值檢驗、等精度檢驗、正態分布檢驗，符合要求后以多家實驗室定值結果的算術平均值作為血清中乳酸標準物質標準值。

2 結果與討論

2.1 均勻性評估

均勻性評估結果見表4，根據統計分析可知，當顯著性水平α=0.05時，3個濃度水平的血清中乳酸標準物質的F值均小于F0.05(14，30)=2.04，證明標準物質均勻性良好。

表4 血清中乳酸標準物質均勻性評估結果

瓶內均勻性采用同樣方法，取瓶中不同3個位置檢測，通過統計檢驗證明標準物質瓶內均勻性良好。采用差減法平行測定多次進樣消耗質量，根據密度和質量計算得到最小取樣量約為25 μL。

2.2 穩定性評估

1）長期穩定性。9個月濃度監測圖見圖1。通過對穩定性監測數據的統計，用t檢驗法進行評價，β1絕對值小于t（0.95,5）與 β1的標準偏差s（β1）的乘積，判定該系列標準物質特性量值在監測時間段9個月內-80 ℃能夠穩定保存，結果見表5。

圖1 血清乳酸標準物質穩定性監測圖

表5 血清中乳酸標準物質長期穩定性（9個月）評估結果

2）短期穩定性。28天濃度監測圖見圖1。通過對穩定性監測數據的統計，可判定該系列標準物質特性量值在監測時間段28天內-20 ℃能夠穩定保存，可在該溫度條件下進行運輸貯存，結果見表6。

表6 血清中乳酸標準物質短期穩定性（28天）評估結果

2.3 定值結果

按照1.2.4方法定值，乳酸標樣、乳酸內標和血清標物中的乳酸色譜圖見圖2。繪制定值標準曲線，結果顯示該方法在乳酸及乳酸鈉同位素內標比值0.2～2.0、1.0～3.0 和 2.0～4.0范圍內均有良好的線性關系，相關系數R均大于0.999。檢驗數據符合正態分布后，以狄克遜（Dixon） 和格拉布斯（Grubbs）法分別對8家實驗室定值原始數據（n=9）進行 異常 值 檢 驗，均 未 發 現 異 常 值，采用科克倫（Cochran）法對8家實驗室檢測結果進行等精度檢驗符合要求，再采用格拉布斯（Grubbs）法檢驗各實驗室定值結果算術平均值是否有顯著性差異，以上檢驗均通過，采用偏態系數和峰態系數法進行所有數據的正態分布檢驗，所有數據符合正態分布，采用8家實驗室檢測結果的算術平均值作為血清中乳酸標準物質定值結果（見表7）。

圖2 乳酸、內標及血清中乳酸的多反應監測（MRM）色譜圖

表7 血清中乳酸標準物質定值結果 mmol/L

2.4 不確定度評定

血清中乳酸標準物質的不確定度來源由三部分組成。第一部分為定值引入的不確定度，包括測量方法引入的不確定度及多家實驗室定值分散性的不確定度；第二部分為標準物質的均勻性引入的不確定度；第三部分為標準物質在有效期內的變動性引入的不確定度，包括短期穩定性引入的不確定度和長期穩定性引入的不確定度。各不確定度分量關系見圖3。

圖3 血清中乳酸標準物質不確定度分量合成圖

2.4.1 定值引入的不確定度度評定

1）測量方法引入的不確定度

根據血清中乳酸標準物質定值方法，先通過擬合標準曲線計算得到血清標準物質中乳酸與乳酸鈉同位素內標質量比值Rs，將其帶入下式測量模型計算得到血清中乳酸的含量。

式中：c(serum)——血清中乳酸的濃度， mmol/L；

m(NaLA)——血清樣品中加入的乳酸鈉同位素質量，μg；

V(serum)——血清的體積，mL；

90.08 ——乳酸的分子量，g/mol。

根據式（2），血清中乳酸標準物質定值的不確定度來源主要包括三部分，第一部分為標準曲線法測量得到的質量比值Rs的不確定度，包括回歸計算引入的不確定度，標準曲線標準值引入的不確定度；第二部分為血清體積計算值的不確定度，包括血清的密度ρ(serum)、血清的稱樣質量m(serum)引入的不確定度；第三部分為乳酸分子量引入的不確定度。由于Rs為乳酸質量和乳酸鈉內標質量比值，乳酸鈉內標質量在所有標準曲線標準點及血清樣品中加入量一致，且測量過程使用同一移液器及天平稱量，其由天平稱量不準引入的不確定度與式（2）中的m(NaLA)為負相關，且天平稱量重復性引入的不確定度較小可忽略，模型Rs×m(NaLA)中僅需考慮乳酸質量引入的不確定度。以下逐個分析各輸入量的標準不確定度。

①標準曲線法測量得到的質量比值Rs的標準不確定度

標準曲線法測量得到的質量比值Rs的標準不確定度包括兩部分，第一部分回歸計算引入的不確定度，第二部分為標準曲線標準值引入的不確定度，即為乳酸標準溶液配制質量標準值引入的不確定度。

a. 回歸計算引入的相對標準不確定度urel(R）

標準曲線包含5個測量點，由直線擬合引入的不確定度可由下式計算：

sR——擬合直線產生的標準偏差，計算見式（4）；

B1——擬合直線的斜率；

P——每個樣品的測量次數，P=9；

n——標準溶液的測量次數，每個濃度測量3次，共15次；

Rj——標準曲線各測量點的比值；

式中：Aj——各測量點的乳酸與同位素內標峰面積比值；

B0——擬合直線的截距。

根據式（3）～（4）計算得到回歸計算引入的相對標準不確定度urel(R)見表8。

表8 血清中乳酸定值結果不確定度匯總

b. 標準曲線標準值的相對標準不確定度urel(Rstd)

標準曲線中乳酸的質量標準值使用乳酸純物質配制的標準溶液稱量計算得到，其不確定度由乳酸標準溶液濃度值的標準不確定度、乳酸標準溶液的密度和乳酸標準溶液的稱量質量的不確定度組成。其中乳酸標準溶液配制采用的高純乳酸純度的不確定度由滴定用量值溯源標準物質及滴定過程不確定度組成，文獻[15]中詳細評定。三者互不相關，采用各分量相對標準不確定度方和根合成得到標準曲線標準值的相對標準不確定度urel(Rstd)，結果見表8。

②血清體積計算值的不確定度

血清體積計算值的不確定度包括血清的密度ρ(serum)、血清的稱樣質量m(serum)引入的不確定度。

a. 血清密度測量引入的相對標準不確定度urel(ρs)

血清的密度采用稱量法測量，用20 mL單標線移液管移取血清，再用電子天平稱取血清的質量，以10次重復測量的質量和體積相除，得到血清密度測量結果。其不確定度由重復測量分散性引入的不確定度、移液誤差和稱量誤差引入的不確定度組成。

采用標準不確定度的A類評定方法計算測量重復性引入的標準不確定度，采用標準不確定度的B類評定方法評定20 mL移液管的最大允許誤差、溫度變化和電子天平最大允許誤差引入的不確定度，按照均勻分布估計各輸入量分布。假設各分量互不相關，采用方和根合成除以血清密度測得值得到血清密度的相對標準不確定度 urel(ρs)，結果見表8。

b. 血清的稱樣質量引入的相對標準不確定度urel[m(serum)]

樣品處理過程中血清取樣量為100 μL，以稱量法計算其準確加入質量。該部分主要由天平稱量準確度引入。I級電子天平稱量100 mg質量的最大允許誤差為±0.05 mg，則天平稱量過程引入的相對標準不確定度為：

血清體積計算值的相對不確定度 urel(V)不確定度以血清的密度、血清的稱樣質量的相對不確定度方和根合成得到，結果見表8。

乳酸分子式為C3H6O3，根據IUPAC發表的各元素的相對原子質量及引用不確定度計算得到乳酸分子量標準不確定度則乳酸分子量的相對標準不確定度為：

以上三項標準不確定度互不相關，以方和根合成得到測量方法引入的不確定度 urel（M），結果見表8。

2）定值分散性引入的不確定度

根據8家實驗室定值結果，使用貝塞爾公式計算各實驗室定值結果的相對標準偏差RSD，評定定值結果分散性引入的不確定度見下式：

2.4.2 均勻性引入的不確定度度評定

式中：Q1和Q2——組間方差和與組內方差和；

計算如下：

2.4.3 穩定性引入的不確定度度評定

綜合評價以上三部分不確定度，得到標準物質各分量不確定度，采用方和根合成得到標準值的合成不確定度和擴展不確定度見表8，即3個濃度水平標準物質定值結果分別為(5.53±0.14) mmol/L、(10.22±0.09) mmol/L、(15.76±0.27) mmol/L，包含因子 k =2。研制的血清中乳酸標準物質的不確定度遠小于現有乳酸測定儀的最大允許誤差，可以有效運用于儀器性能評定和方法學評價。

3 血清中乳酸標準物質的應用

本文研究的血清中乳酸標準物質主要應用于以下三方面：

應用于臨床檢驗實驗室乳酸測量溯源性的建立：血清中乳酸標準物質能有效地將量值傳遞至臨床檢驗實驗室，建立臨床乳酸測定結果的溯源性，使臨床實驗室檢驗結果更加準確一致。

應用于乳酸測定儀器的校準：應用本文研制的具有高中低3種濃度水平的標準物質，能夠有效滿足乳酸測定儀器測量范圍的性能評價以及血清乳酸檢驗中系統誤差的修正需要，客觀準確評價儀器性能和檢驗結果，及時識別測量系統的偏移和異常。

應用于評價血清中乳酸分析方法：作為臨床檢驗的一個重要指標，乳酸的檢測方法多樣化，有酶法、電化學法、比色法、干式化學法等，使用血清中乳酸標準物質可以有效評價新方法的準確度、分析范圍、回收率、分析靈敏度、檢出限等性能。

4 結束語

本文研制的血清中乳酸標準物質選取人血清作為基質，具有高、中、低3個濃度水平，以多家實驗室同位素稀釋高效液相色譜-串聯質譜法定值，經統計學評價，定值結果準確可靠；經評定標準物質足夠均勻，且在指定保存條件下量值穩定，通過標準物質成果的應用可為臨床實驗室血清乳酸檢驗質量控制提供有力保障，保障各實驗室測量結果的一致性，科學評價乳酸測定儀的性能，進一步提高醫學檢驗實驗室乳酸檢測水平，為乳酸相關科學研究提供準確數據。