中藥提取物對金黃色葡萄球菌生物膜作用的研究

元 煉，張 姣，劉蘭妹，陳 丹，姜紅宇，尹業師，李百元*

1湖南科技學院化學與生物工程學院；2湖南科技學院湘南優勢植物資源綜合利用湖南省重點實驗室，永州 425199

細菌生物膜(bacterial biofilm，BF)是指細菌為適應自然環境，在生長過程中逐漸形成附著于生物體或者非生物體表面的特殊功能性結構，是由細菌細胞及包裹著細菌的自身所分泌的含水聚合性基質所組成的細菌群落[1]。BF的形成相當于對于外界的侵擾形成了一層有效的屏蔽，可使細菌抵御宿主免疫系統和抗菌藥物殺傷作用，從而產生對抗菌藥物的耐藥性(是浮游狀態的10～1 000倍)，導致感染難以清除[2]，從而成為當今一大難治的潛在感染源。因此，僅使用傳統的抗生素治療細菌生物膜感染，效果將會大打折扣[3]。

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是一種常見的食源性致病菌，它廣泛存在于自然環境當中。金黃色葡萄球菌的一個重要的特點是可以在其感染部位形成生物膜，使這些菌株的感染更加難以治療[4]。治療生物膜的狀態下金黃色葡萄球菌，必須使用更高濃度的抗生素，但是抗生素的大量使用會導致耐藥性的發展，并且可能會引起協同細菌感染疾病的發生。近年來也報道了一些新的策略被嘗試去應對生物被膜的感染，包括密度感應系統猝滅劑以及抗生素聯用密度感應系統猝滅劑等，但是這些方法沒有被批準使用[5]。因此，從自然界中尋找能抑制生物膜形成的天然抗菌劑成為重要的選擇。

2018年9月18日下午，2018年中國技能大賽——第六屆全國職工職業技能大賽中建七局杯砌筑工決賽在河南鄭州舉行。

《行動計劃》提出，到2020年，實現“一保兩治三減四提升”：“一保”，即保護農村飲用水水源，農村飲水安全更有保障；“兩治”，即治理農村生活垃圾和污水，實現村莊環境干凈整潔有序；“三減”，即減少化肥、農藥使用量和農業用水總量；“四提升”，即提升主要由農業面源污染造成的超標水體水質、農業廢棄物綜合利用率、環境監管能力和農村居民參與度。

世界衛生組織預測全球25%的現代用藥直接或者間接地與藥用植物相關，其中1981年到2019年批準使用的162種抗菌類藥物中有94種來源于天然產物[6]。藥用植物是生物活性分子的主要來源之一，但是從藥用植物中篩選抗生物膜抑菌劑還處于初步階段。目前國際上已經報道了一些藥用植物如破子草、黃花菜和姜黃的提取物等表現出抑制金黃色葡萄球菌生物膜的活性[7-9]。中藥具有多組分、多靶點和多作用且不易產生耐藥性的特點，因而在抗菌治療具有良好的應用前景。目前關于中草藥抑制金黃色葡萄球菌生物膜的研究也有一些報道：Wang等[10]發現銀杏外種皮提取物以濃度依賴的方式抑制金黃色葡萄球菌生物膜的形成；Li等[11]研究發現中藥訶子能明顯地抑制金黃色葡萄球菌生物膜形成，同時還具有較好的抑菌效果；Liao等[12]發現魚腥草水提物可以有效抑制金黃色葡萄球菌生物膜的形成等。因此，藥用植物是挖掘病原菌生物膜抑制劑的重要來源。但是這些藥用植物的研究大都是基于其抑菌活性的前提下分析其生物膜功能，這可能會因為提取物的抑菌作用干擾試驗結果的判斷，也可能會漏篩沒有抑菌但有生物膜抑制活性的植物提取物。因此，本研究選擇大黃等16味地方特色的中藥材為研究對象，分析不同溶劑提取物對金黃色葡萄球菌生長的影響，在此基礎上選擇亞抑菌濃度提取物分析其對生物膜的影響，旨在為中藥抗生物膜形成的研究及其藥物研發提供指導。

以90例急性闌尾炎合并糖尿病患者作為該次研究對象，選擇電腦分配方式作為分組原則，分為兩組（觀察組45例與對照組45例）。

1.2.1 中藥的預處理

1 材料與方法

1.1 主要藥品與試劑

兩種手術方法治療股骨轉子間骨質疏松性骨折的療效 …………………………… 蔡韻律(6):734膝關節炎家兔外周血BTLA、IL-1、TNF-α、IL-10及部分血小板參數的變化 … … 張可訓，等(7):794

勘探布置1孔，孔深15m。閘基高程5.8～6.8m主要為第②1層粉土，構成地基主要持力層，具中等壓縮性，中等透水性，滲透穩定性較差。高程1.7～5.8m為第②層壤土、第③壤土，具中等壓縮性，微弱透水性，強度較高。高程1.7m以下主要為第③1黏土層、第③壤土層，具中高壓縮性，微弱透水性，工程地質相對較差。

1.2 實驗方法

依據中央資源變資產、資金變股金、農民變股民的政策要求，農民以家庭為單位，開展信用合作，提供資金互助服務，構建農業產業發展的資金池。規范民間借貸關系，解決農民貸款難、抵押難、貸款貴的問題，增加農民財產性與資產性收入，為農村新型經營主體提供創業有本、發展有保的產業金融體系，支持和鼓勵農民創業就業，促進農村一二三產業融合發展。

2.2.1 水提取物對金黃色葡萄球菌生物膜形成的影響

1.2.2 中藥水提物及醇提物的制備

采用改進的回流提取法提取藥材的活性物質：分別稱取大黃、虎杖、羌活、女貞子、夏枯草、千里光、辛夷、豨簽草、鳳尾草、鐵靈仙、黃連、砂仁、荊芥、茵陳、薄荷、龍骨風粉末200 g，用2 000 mL蒸餾水80 ℃下回流提取3 h，過濾，藥渣再用1 200 mL蒸餾水回流提取2 h，過濾，合并兩次濾液，旋轉濃縮至浸膏狀，得到藥材水提物。分別稱取大黃、虎杖、羌活、女貞子、夏枯草、千里光、辛夷、豨簽草、鳳尾草、鐵靈仙、黃連、砂仁、荊芥、茵陳、薄荷、龍骨風粉末200 g，用2 000 mL 95%乙醇80 ℃下回流提取3 h，過濾，藥渣再用1 200 mL 95%乙醇回流提取2 h，過濾，合并兩次濾液，旋轉濃縮至浸膏狀，得到藥材醇提物。將中藥水提物和醇提物浸膏真空冷凍干燥至粉末狀用于后續實驗。稱量中草藥凍干粉末，水提取物用蒸餾水充分溶解，醇提取物用95%乙醇充分溶解，溶解后離心取上清液，過0.22 μm濾膜，4 ℃保存備用。

1.2.3 中藥提物對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度(MIC)的測定

將-80 ℃保存的金黃色葡萄球菌用TSA平板進行活化，24 h后挑取單菌落于含有3 mL TSB的試管中37 ℃ 200 r/min培養過夜，分光光度計測定菌液OD600 nm數值，并將其稀釋至OD600 nm值為 0.01用于后續的抑菌實驗。本實驗采用二倍稀釋法對藥物提取物進行稀釋的基礎上運用96孔板細菌培養法測定細菌的MIC[13]：實驗組為100 μL藥物稀釋液和100 μL菌液混勻加入96孔板中；陽性對照組為100 μL菌液加100 μL TSB培養基混勻后加入96孔板中；空白對照組為96孔板中只加入200 μL TSB，各3個平行，加樣完成后將96孔板置于37 ℃恒溫培養箱中培養24 h，酶標儀測其OD600 nm值，以陽性對照和空白對照為參考依據判斷實驗組結果。

MIC測定結果顯示16味中有15味的水提取物對金黃色葡萄球菌有不同的抑制效果，其中黃連、千里光、鳳尾草、荊芥、茵陳、砂仁水提取物抑制效果最為明顯，MIC為0.5～10 mg/mL；其次為鐵靈仙、大黃、夏枯草、薄荷水提取物，MIC為10～30 mg/mL；虎杖、羌活、女貞子、辛夷、豨簽草水提取物對金黃色葡萄球菌也有一定的抑菌活性，MIC為80～260 mg/mL；龍骨風水提取物對金黃色葡萄球菌沒有抑菌活性(見表1)。

將-80 ℃保存的金黃色葡萄球菌用TSA平板進行活化，24 h后挑取單菌落于含有3 mL TSB的試管中37 ℃ 200 r/min培養過夜，分光光度計測定菌液OD600 nm數值，并將其稀釋至OD600 nm值為0.05進行生物膜實驗：實驗組按100 μL各藥液與100 μL菌液稀釋液加入96孔板，陽性對照組按100 μL提取物對應溶劑(水提取物陽性對照添加無菌水，醇提取物陽性對照添加95%乙醇)與100 μL菌液稀釋液加入96孔板，空白對照組按200 μL TSB加入96孔板，各3個平行；置于37 ℃恒溫培養箱中，分別培養6 h和12 h，測定OD620 nm數值后棄游離菌液，用蒸餾水清洗96孔板3次去殘留菌液；利用結晶紫染色法[14]進行染色，即加入200 μL 0.1%結晶紫溶液染色20 min，倒去染液并用蒸餾水反復清洗2次，再加入200 μL 95%乙醇溶解5 min，測OD540 nm，實驗重復三次；最后運用軟件SigmaPlot，以OD540 nm/OD620 nm為縱坐標，時間為橫坐標構建柱形圖，進而分析提取物對金黃色葡萄球菌生物膜的影響。

英語教學過程，并不是一個簡單的教師“教”和學生“學”的過程，教師要充分發揮自己的智慧，從學生的實際出發，改變傳統的教材觀，以“巧妙結合”、“相機補充”、“適時調整”等方式對教材進行教學要求下的“活化”處理。從而用足教材，讓教學更有實效性；用厚教材，讓教學更有豐富性；用對教材，讓教學更有針對性。

1.2 試劑、探針、試劑盒 HER-2/neu(17q12)/CSP17探針、組織預處理試劑盒、原位雜交用蛋白酶(胃蛋白酶工作液)均購于廣州安必平醫藥科技股份有限公司。

2 實驗結果及分析

2.1 不同溶劑提取物對金黃色葡萄球菌的MIC的測定

2.1.1 水提取物對金黃色葡萄球菌生長的影響

1.2.4 金黃色葡萄球菌生物膜的測定

表1 中藥水提物和醇提物對金黃色葡萄球菌的MIC測定結果

2.1.2 醇提取物對金黃色葡萄球菌生長的影響

中藥醇提取物MIC測定結果顯示，16味中有15味醇提取物對金黃色葡萄球菌有不同的抑制效果，其中黃連、砂仁、茵陳、荊芥醇提取物抑制效果最為明顯，MIC為0.1～4.0 mg/mL；其次為大黃、羌活、辛夷、鐵靈仙、鳳尾草、千里光醇提取物，MIC為9.0～20 mg/mL；虎杖、女貞子、夏枯草、豨簽草、薄荷醇提取物對金黃色葡萄球菌也有一定的抑菌活性，MIC為20～62 mg/mL；此外，龍骨風醇提取物對金黃色葡萄球菌沒有抑菌活性(見表1)。

2.2 中藥提取物對金黃色葡萄球菌生物膜的影響

16味中藥水提取物對金黃色葡萄球菌的生物膜測定結果顯示(見表2)，大黃、虎杖、羌活、女貞子、夏枯草、辛夷、龍骨風、千里光、黃連、砂仁、茵陳水提取物能明顯抑制金黃色葡萄球菌生物膜的形成；但是豨簽草、鐵靈仙、鳳尾草、荊芥水提取物對金黃色葡萄球菌生物膜有促進作用；其中薄荷水提取物在6 h時抑制金黃色葡萄球菌生物膜的形成，但是在12 h時卻對又促進金黃色葡萄球菌生物膜的形成。從抑制活性上分析，大黃、虎杖、夏枯草、羌活、龍骨風水提取物對金黃色葡萄球菌生物膜抑制效果最為明顯。具體工作濃度詳見表2。

將購買的大黃、虎杖、羌活、女貞子、夏枯草、千里光、辛夷、豨簽草、鳳尾草、鐵靈仙、黃連、砂仁、荊芥、茵陳、薄荷、龍骨風用粉碎機粉碎，過篩(100目)，烘干備用。

在不影響金黃色葡萄球菌生長的前提下，測試提取物對生物膜的影響，即根據中藥提取物MIC數值，選取1/2～1/8 MIC的濃度(無抑菌作用)作為后續的生物膜實驗；而沒有抑菌效果的提取物選取1/8母液的濃度作為后續的生物膜實驗。

表2 中藥水提物對金黃色葡萄球菌生物膜作用的影響

結晶紫實驗結果發現大黃、虎杖、夏枯草、千里光、砂仁、羌活、女貞子、辛夷、龍骨風和黃連水提取物對6 h和12 h的金黃色葡萄球菌生物膜的形成都有抑制效果，而且大黃、虎杖、夏枯草、龍骨風、黃連水、千里光、砂仁、羌活和辛夷水提取物展現很強的抑制效果(圖1A、1B和圖1D)。然后豨簽草、鐵靈仙、鳳尾草水提取物對金黃色葡萄球菌生物膜(6 h和12 h時間點)都有促進作用，其中豨簽草和鳳尾草促進效果明顯(見圖1A、圖1D)。荊芥水提取物對6 h的金黃色葡萄球菌生物膜形成有促進效果，對12 h的金黃色葡萄球菌生物膜形成作用不明顯；茵陳水提取物對6 h的金黃色葡萄球菌生物膜無明顯影響，對12 h的金黃色葡萄球菌生物膜形成有抑制作用且效果十分明顯(圖1C)。

菌株金黃色葡萄球菌NCTC 8325由中國科學技術大學孫寶林教授課題組惠贈。大黃、虎杖、羌活、女貞子、夏枯草、千里光、辛夷、豨簽草、鳳尾草、鐵靈仙、黃連、砂仁、荊芥、茵陳、薄荷、龍骨風購自永州市永靛中藥飲片有限公司，經湖南科技學院化學與生物工程學院陳小明副教授鑒定。胰酪大豆胨液體培養基(trypticase soy broth，TSB)、胰酪大豆胨瓊脂培養基(tryptose soya agar，TSA)購自廣東環凱生物科技有限公司。95%乙醇(分析純)購自成都金山化學試劑有限公司。結晶紫染料購自天津市光復精細化工研究所。針筒式濾膜過濾器(Φ13 mm，0.22 μm)購自天津市領航實驗設備股份有限公司。

圖1 16味中草藥水提物對金黃色葡萄球菌生物膜的影響

2.2.2 醇提取物對金黃色葡萄球菌生物膜形成的影響

16味中藥醇提取物對金黃色葡萄球菌生物膜測定結果顯示(見表3)，16味中藥醇提取物均對金黃色葡萄球菌生物膜形成有抑制作用，其中抑制效果明顯的為大黃、夏枯草、女貞子、鐵靈仙、黃連和龍骨風醇提取物。具體工作濃度詳見表3。

表3 中藥醇提物對金黃色葡萄球菌生物膜形成的結果

結晶紫實驗結果發現大黃、夏枯草、豨簽草、千里光、砂仁、羌活、女貞子、鐵靈仙、茵陳、薄荷、辛夷、鳳尾草、龍骨風、黃連醇提取物對6 h和12 h的金黃色葡萄球菌生物膜形成有抑制效果，其中大黃、夏枯草、砂仁、女貞子、鐵靈仙、茵陳、龍骨風、黃連醇提取物對其生物膜形成抑制效果極強，豨簽草、千里光、羌活醇、薄荷、辛夷醇提取物對金黃色葡萄球菌生物膜形成抑制效果較明顯(見圖2A～2D)?；⒄却继崛∥飳? h的金黃色葡萄球菌生物膜形成作用不明顯，對12 h金黃色葡萄球菌生物膜形成呈抑制效果且效果明顯(見圖2A)。茵陳醇提取物對6 h的金黃色葡萄球菌生物膜形成作用不明顯，對12 h的金黃色葡萄球菌生物膜的形成呈抑制效果且效果明顯(見圖2C)。

圖2 16味中草藥醇提物對金黃色葡萄球菌生物膜的影響

3 討論與結論

抗生素是目前金黃色葡萄球菌感染相關病例治療的主要策略，但金黃色葡萄球菌生物膜的形成提高了其對抗生素的抵御能力，進而降低了抗生素的效果，因此，在使用抗生素之前能抑制或者消除生物膜的形成將會大大提高抗生素的效果，這也是目前解決因生物膜形成而產生的細菌耐藥性和臨床上慢性感染的一個有效途徑。本實驗選取了16味中藥材，研究其抑菌活性，結果發現大部分提取物對金黃色葡萄球菌有抑菌活性，而龍骨風對金黃色葡萄球菌無抑菌活性，這與其他研究者的實驗結果一致。龍骨風為桫欏科植物桫欏的莖干，主要含有萜類、黃酮、酚酸、甾體等化學成分；目前發現其具有祛風除濕、活血散瘀和清熱解毒等功效，以及抗腫瘤等多種藥理活性[15]。雖然龍骨風對金黃色葡萄球菌的抑菌效果不明顯，但是在其他的生物活性功能上仍有挖掘的潛力。許多植物源提取物對金黃色葡萄球菌具有抗菌活性，但是提取物的成分復雜和作用靶點不清楚等，因此使用中草藥完全代替抗生素路還很長。

金黃色葡萄球菌的耐藥機制有多種，其中生物膜形成從而導致的耐藥性問題，已經受到越來越受關注[16]。目前，已有研究通過化學或者生物學方法去除或者抑制生物膜的形成來控制因生物膜導致致病菌耐藥的現象，特別是抗金黃色葡萄球菌生物膜的中草藥的開發用于有效減弱其耐藥性，特別是不同種類的黃酮類化合物有抑制金黃色葡萄球菌生長和生物膜形成的活性[17]。本實驗發現大黃、虎杖、羌活、女貞子、夏枯草、千里光、辛夷、黃連、砂仁、龍骨風、茵陳和薄荷的水提取物和醇提取物都有明顯的抑制金黃色葡萄球菌生物膜的效果，對上述藥材的化合物組分進行了查閱文獻發現大黃、虎杖、女貞子、夏枯草、千里光、黃連、砂仁、龍骨風、茵陳和薄荷均含有黃酮類物質，但是其所含黃酮類物質與其抑制金黃色葡萄球菌生物膜的形成是否相關，還需要后續實驗的進一步驗證。此外，研究報道大黃和虎杖含大量蒽醌類物質大黃素[18]，而且Xiang等[19]也證實了蘆薈含蒽醌類物質大黃素，并且具有抑制金黃色葡萄球菌生物膜形成的活性，因此推測本試驗中大黃和虎杖提取物抑制金黃色葡萄球菌生物膜可能與其含蒽醌類物質大黃素有關。

目前，植物活性成分在干預細菌生物膜的應用中具有巨大的潛力，因為傳統抗生素較難滲透進入細菌生物膜，而且容易產生殘留和耐藥性等問題，所以單獨使用在控制細菌生物膜感染方面難以發揮作用，但將低殘留低毒性的植物活性成分與抗生素一同使用，可以有效減少藥物的用量，降低其毒副作用，并且能夠提供藥物滲入細菌生物膜的能力。Dey等[20]發現將柚皮苷分別同四環素，環丙沙星聯用，能夠加強這兩種抗生素抑制銅綠假單胞菌生物膜形成的能力。Yan等[21]發現百里香酚聯合苯唑西林使用可以明顯增強對金黃色葡萄球菌生物膜的抑制和清除效果。此外，中藥提取物還能制成納米制劑，因為傳統抗生素難以滲透進入高度結構化的成熟生物膜內部，但是可以將植物活性成分制成納米抑制劑，從而有利于藥物進入細菌生物膜內部發揮藥效，如納米大黃素能抑制鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌生物膜的形成并清除其成熟生物膜，降低其生物膜相關毒力因子基因的表達[22]。所以將植物活性成分聯合其他藥物一起應用于生物膜感染治療上，或許能夠得到不錯的效果，具有重要的應用前景。

此外，中藥的提取方法也會影響藥物活性實驗結果，Chu等[23]采用了5種不同提取方法對中藥羅仙子活性物質進行提取，發現水提法得到的產物抑菌活性最強。Zhang等[24]采用水提法、醇提法和超臨界CO2對北五味子有效成分進行提取，發現運用醇提取法所得藥物活性物質抑菌活性明顯高于其他兩種溶劑提取物。Iqbal等[25]發現天南星的甲醇、正己烷、乙酸乙酯、正丁醇和水提取物對測試的病原菌有不同的抑菌效果，化合物成分分析發現這些不同溶劑提取物的組分種類和豐度都有著明顯的差異。Zhang等[26]采用了7種不同溶劑對當歸根進行了提取，并且發現不同溶劑提取物的生物活性和化合物組分有著明顯的不同。這些結果說明不同的溶劑提取的植物提取物中的組分種類和豐度可能是有差異的。本實驗采用水和乙醇為溶劑提取中藥活性物質，結果發現鐵靈仙、豨簽草、鳳尾草和荊芥4味藥物的水提物對金黃色葡萄球菌生物膜形成有促進作用，而其醇提物對金黃色葡萄球菌生物膜形成有抑制作用，推測其原因可能是兩種不同的提取方法所提取的物質組分和豐度的不同，導致了其對金黃色葡萄球菌生物膜形成作用不同。該發現給予我們一些的提示，抑制生物膜的物質和促進生物膜的物質可以用不同的溶劑進行提取，如果后續開發鐵靈仙、豨簽草、鳳尾草和荊芥源抑制劑可以考慮用先用水對其進行提取，達到去除雜質的目的，然后再用乙醇對其浸膏進行再次的提取。因此，本試驗結果或許可為開發出對金黃色葡萄球菌生物膜具有抑制效果的天然藥物從而減少對抗生素的使用提供參考。

本研究結果顯示這16味中藥材的提取物大部分對金黃色葡萄球菌生物膜有抑制作用，但是部分提取物作用濃度偏高，例如羌活和女貞子水提物的濃度超過60 mg/mL，這種高作用濃度的提取物實際使用價值不高，因此后續對這些藥材的開發需要綜合考慮其提取物中有效活性成分的含量或者效價等因素。目前，我國對抗生物膜中藥研究仍處在探索階段，其作用成分和作用靶點的研究還不夠深入，后續我們在篩選抗生物膜活性藥用植物的基礎上，還需要鑒定其活性化合物的成分，并且從分子生物學水平上研究其作用靶點和作用機制。