右美托咪定減輕妊娠合并膿毒癥大鼠炎癥反應(yīng)的作用及對TLR-3/sFlt-1的調(diào)控機制探討*

金華峰 曾維福 江麗 趙燕峰 李志強

膿毒癥是由細菌等病原微生物感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，病情兇險，病死率高[1]，多發(fā)生于嚴重燒傷、創(chuàng)傷、外科手術(shù)等嚴重疾病后[2]。妊娠合并膿毒癥是產(chǎn)科最嚴重也是導致孕產(chǎn)婦死亡的主要病癥。據(jù)估計，全球因膿毒癥死亡的孕產(chǎn)婦占孕產(chǎn)婦總死亡數(shù)的11%[3]。該病由多種因素導致，失控的炎癥反應(yīng)是病情進展的關(guān)鍵[4]。目前臨床妊娠合并膿毒癥患者的治療方案主要是早期抗菌抗感染藥物的應(yīng)用、液體治療及后期重要器官的保護，對于膿毒癥發(fā)展中期機體炎癥反應(yīng)失控、免疫功能低下，目前還缺乏系統(tǒng)有效的治療手段[5]。右美托咪定（Dexmedetomidine，Dex）是一種具有高選擇性的腎上腺素能α2受體激動劑，具有抗炎、鎮(zhèn)靜、穩(wěn)定血流動力學的功效[6]。研究表明，Dex 能通過調(diào)控Toll 樣受體素4（Toll-like receptor 4，TLR-4）的表達抑制炎癥反應(yīng)，起到保護心肌組織、減輕肺泡內(nèi)水腫及減少炎性細胞浸潤的作用[7]。Toll 樣受體素3（Toll-like receptor 3，TLR-3）激活后會增強與炎癥強度呈正相關(guān)的可溶性血管內(nèi)皮生長因子受體-1（soluble fms-like tyrosine kinase 1，sFlt-1）的表達并可調(diào)控炎癥反應(yīng)[8]。有研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性大麻素通過與G 蛋白耦聯(lián)的大麻素受體結(jié)合并發(fā)揮抗炎作用，而腎上腺素能α2受體也是G 蛋白耦聯(lián)受體，且內(nèi)源性大麻素的抗炎機制與TLR-3 的抗炎機制類似[9]，因此推測Dex 通過結(jié)合G 蛋白耦聯(lián)α2腎上腺素受體，促進TLR-3 與配體結(jié)合產(chǎn)生抗炎因子。本研究通過構(gòu)建妊娠合并膿毒癥大鼠模型，利用體外實驗探究Dex 調(diào)控TLR-3/sFlt-1 信號通路對妊娠合并膿毒癥大鼠心肺組織損傷和炎癥反應(yīng)的作用及機制，為深入研究Dex 對器官損傷和炎癥反應(yīng)的作用及其機制奠定基礎(chǔ)。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 80 只2～3 月齡無特定病原體（specific pathogen free，SPF）清潔級Sprague-Dawley（SD）孕鼠，體重（212.00±33.27）g[購于南昌大學實驗動物科學部，許可證號：SCXK（贛）2019-0001]。

1.1.2 藥物與試劑 Dex 和聚肌胞苷酸（polycytidylinic acid，Poly I︰C）（均購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司）；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）（購自上海吉至生化科技有限公司）；蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色試劑盒（購自上海滬震實業(yè)有限公司）；脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）斷裂的原位末端標記法（TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）細胞凋亡檢測試劑盒（購自上海弗元生物科技有限公司）；C 反應(yīng)蛋白（C reaction protein，CRP）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和白細胞介素-10（interleukin-10，IL-10）化學發(fā)光免疫定量試劑盒（均購自美國GENMED SCIENTIFICS INC公司）；兔抗鼠TLR-3、sFlt-1、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α）單克隆抗體（均購自美國Santa 公司）；羊抗兔TLR-3、sFlt-1、TNF-α 多克隆抗體（均購自美國Santa 公司）；化學發(fā)光試劑（efficient chemiluminescence，ECL，購自美國Thermo Fisher 公司）。

1.1.3 實驗儀器 CryoCube F440 型超低溫冰箱（購自德國Eppendorf 公司）；ICW190 型CO2恒溫培養(yǎng)箱（購自德國IRM Tek 公司）；BC-11H 型超凈工作臺（購自韓國Lab Companion 公司）；H2050R 型高速冷凍離心機（購自湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；IX51-A21PH 型光學顯微鏡（購自日本Olympus 公司）；Revolve FL 型熒光顯微鏡（購自美國ECHO 公司）；MSMINIONE 型電泳儀（購自英國Cleaver 公司）；Azure c600 型凝膠成像系統(tǒng)（購自美國Azure Biosystems 公司）。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建SD 大鼠妊娠合并膿毒癥模型并分組

1.2.1.1 SD 大鼠妊娠合并膿毒癥模型構(gòu)建 取70 只SD 孕鼠作為建模組，另取10 只SD 孕鼠作為對照組。建模組將尾部遠端硬毛除去，固定好大鼠并選擇合適的靜脈，用75%酒精棉球擦拭使血管充盈，使用1 mL 注射器沿靜脈血管進針，回抽針栓有回血說明進針成功，按5 mg/kg 緩慢注入濃度為0.1%LPS，注射完畢后用棉簽局部按壓止血，完成SD 孕鼠膿毒癥模型得構(gòu)建。建模24 h 后大鼠出現(xiàn)呼吸急促、反應(yīng)遲鈍、抱團取暖、尿液渾濁等狀態(tài)，表示建模成功[10]。

1.2.1.2 實驗分組 將妊娠合并膿毒癥模型構(gòu)建成功的大鼠隨機分為模型組、Dex 低、中、高劑量組和Poly I︰C 低、中、高劑量組。其中Dex 低、中、高劑量組分別按5、10、20 μg/kg 注射Dex；Poly I︰C低、中、高劑量組分別按2.5、5、10 μg/kg 注射Poly I︰C，給藥體積按1 mL/kg，對照組和模型組均按1 mL/kg 行靜脈注射生理鹽水。

1.2.1.3 材料采集 給藥后12 h，分別將各組大鼠斷頸處死，沿胸骨正中線剪開并取出心臟和右側(cè)肺組織，保存于-80 ℃超低溫冰箱備用。

1.2.2 各組孕鼠的心肌、肺組織形態(tài)學觀察 取各組大鼠的心肌組織和肺組織固定于4%多聚甲醛24 h，常規(guī)行石蠟包埋、病理學切片（5 μm），依照HE 染色試劑盒的操作步驟進行染色。在倒置光學顯微鏡下觀察各組大鼠心肌組織和肺組織的形態(tài)學變化。

1.2.3 TUNEL 法檢測孕鼠心肌細胞和肺組織細胞凋亡率 將大鼠心肌組織和肺組織切片后分別用二甲苯和梯度乙醇各清洗1 次，滴加20 μg/mL 不含脫氧核糖核酸酶的蛋白酶K，于37 ℃條件下孵育20 min 后PBS 沖洗3 次將蛋白酶K 沖洗干凈，加入50 μL TUNEL 檢測液于標本上，在37 ℃條件下避光孵育60 min，PBS 沖洗3 次，二甲苯中浸泡5 min 使標本透明，用中性樹膠封片，于光學顯微鏡下觀察，細胞核可見棕黃色顆粒為陽性細胞。凋亡率=陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.2.4 化學發(fā)光免疫法檢測心肌、肺組織CRP、IL-6 和IL-10 的含量 采用雙抗體夾心化學發(fā)光免疫法測定各組心肌、肺組織CRP、IL-6 和IL-10 含量。操作步驟均嚴格按照化學發(fā)光免疫定量試劑盒產(chǎn)品說明書進行：將各組大鼠心肌組織和肺組織分別制成組織勻漿，保存于-80 ℃超低溫冰箱。分別取50 μL 大鼠心肌組織和肺組織組織勻漿和50 μL 堿性磷酸酶標記的單克隆抗體加入發(fā)光板，37 ℃條件下孵育60 min。洗液清洗5 遍后將洗液全部吸出，加入100 μL 化學發(fā)光底物液，37 ℃避光溫育10 min，生成發(fā)光信號，測定其發(fā)光強度。

1.2.5 蛋白質(zhì)免疫印跡法（western blot，WB）檢測心肌、肺組織TLR-3、sFlt-1、TNF-α 表達 將凍存的大鼠心肌組織和肺組織分別用1 mL 裂解液于冰上裂解30 min，室溫下靜置30 min，收集上清液。等體積加入2×的蛋白上樣緩沖液Loading buffer 混合均勻，100 ℃加熱5 min 使蛋白質(zhì)充分變性得各組樣品液。每個點樣孔加20 μL 樣品液，在10%十二烷基硫酸（sodium dodecyl sulfate，SDS）聚丙烯酰胺凝膠中以30 V 電壓電泳20 min 將樣液壓入加樣孔底部，以80 V 電壓電泳約1 h 使目的蛋白清晰分離。通過分離蛋白轉(zhuǎn)移法將凝膠轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯[Poly（vinylidene fluoride），PVDF]膜上，室溫條件下用5%脫脂牛奶在PBS 中封閉1 h。加入稀釋比為1︰2 000 的一抗，4 ℃搖床上孵育過夜。次日取出PVDF 膜，用含有0.1% Tween-20 的PBS 沖洗3 次，5 min/次，加入稀釋比為1︰500 的二抗，室溫孵育2 h 后加入ECL 顯影液顯影。以GAPDH為內(nèi)參，使用Image Pro Plus 6.0 圖像分析系統(tǒng)分析檢測計算各目標蛋白的灰度值。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 26.0 軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q 檢驗，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組孕鼠心肌、肺組織形態(tài)學 70 只大鼠建模成功66 只，分組情況如下，模型組和Dex 低劑量組各8 只，其余各組均10 只。其中模型組在治療過程中因膿毒性休克死亡1 只，Dex 低劑量組因急性肺損傷死亡1 只，模型組和Dex 低劑量組各剩7 只。

2.1.1 各組孕鼠心肌組織形態(tài)學觀察 對照組大鼠心肌組織細胞形態(tài)正常，心肌纖維排列整齊，間隙正常，無炎細胞浸潤、細胞間質(zhì)無充血水腫；模型組大鼠心肌組織細胞嚴重變形、心肌纖維排列紊亂，間隙明顯增寬，細胞間質(zhì)出現(xiàn)明顯充血水腫，水腫部分有炎細胞聚集、浸潤，明顯可見有心肌細胞壞死；Dex 低、中、高劑量組給藥后對心肌細胞變形、炎細胞聚集浸潤、細胞間質(zhì)水腫等現(xiàn)象均有明顯改善，且以上現(xiàn)象均隨Dex 濃度的升高而減輕；Poly I︰C 低、中、高劑量組給藥后對均有一定的改善，且以上現(xiàn)象均隨Poly I︰C 濃度的升高而減輕；Dex低、中、高劑量組心肌細胞變形、炎細胞聚集浸潤、細胞間質(zhì)水腫等現(xiàn)象分別較Poly I︰C 低、中、高劑量組有明顯減輕。見圖1。

圖1 HE染色觀察各組孕鼠心肌組織形態(tài)學（×400）

2.1.2 各組孕鼠肺組織形態(tài)學觀察 對照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔輪廓光滑清晰，肺泡間隔無典型性水腫，無炎癥細胞聚集浸潤；模型組大鼠肺組織有明顯的病理性損傷出現(xiàn)，肺泡結(jié)構(gòu)嚴重破壞，肺泡壁有明顯水腫，肺間質(zhì)增厚明顯并伴隨大量炎癥細胞聚集浸潤；與模型組相比，Dex 低、中、高劑量組給藥后肺組織損傷、肺泡結(jié)構(gòu)破壞和間質(zhì)內(nèi)炎癥細胞聚集浸潤現(xiàn)象均有明顯改善，且以上現(xiàn)象均隨Dex 濃度的升高而減輕，Poly I︰C 低、中、高劑量組給藥后肺組織損傷、肺泡結(jié)構(gòu)破壞和間質(zhì)內(nèi)炎癥細胞聚集浸潤現(xiàn)象均有一定的改善，且以上現(xiàn)象均隨Poly I︰C 濃度的升高而減輕；Dex 低、中、高劑量組肺組織損傷、肺泡結(jié)構(gòu)破壞和間質(zhì)內(nèi)炎癥細胞聚集浸潤現(xiàn)象分別較Poly I︰C 低、中、高劑量組有明顯減輕。見圖2。

圖2 HE染色觀察各組孕鼠肺組織形態(tài)學（×200）

2.2 TUNEL 法檢測心肌細胞和肺組織細胞凋亡 模型組心肌細胞和肺組織細胞凋亡率均明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與模型組相比，Dex 低、中、高劑量組和Poly I︰C 低、中、高劑量組的心肌細胞和肺組織細胞凋亡率均降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），且分別隨Dex、Poly I︰C 濃度的增加而降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；Poly I︰C 低、中、高劑量組心肌細胞和肺組織細胞凋亡率分別高于Dex 低、中、高劑量組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表1。TUNEL法檢測各組心肌細胞凋亡，見圖3；TUNEL 法檢測各組肺組織細胞凋亡，見圖4。

圖3 TUNEL法檢測各組心肌細胞凋亡（×400）

圖4 TUNEL法檢測各組肺組織細胞凋亡（×400）

表1 各組大鼠心肌細胞、肺組織細胞凋亡率比較[%，（）]

表1 各組大鼠心肌細胞、肺組織細胞凋亡率比較[%，（）]

*與對照組比較，P<0.05；#與模型組比較，P<0.05；&與Dex低劑量組比較，P<0.05；△與Dex 中劑量組比較，P<0.05；▲與Dex 高劑量組比較，P<0.05；▽與Poly I∶C 低劑量組比較，P<0.05；▼與Poly I∶C 中劑量組比較，P<0.05。

2.3 化學發(fā)光免疫法檢測心肌、肺組織CRP、IL-6和IL-10 的含量 模型組心肌和肺組織CRP、IL-6、IL-10 的含量明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與模型組相比，Dex 低、中、高劑量組和Poly I︰C 低、中、高劑量組的心肌和肺組織CRP、IL-6 和IL-10 的含量均降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），且分別隨Dex、Poly I︰C 濃度的增加而降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；Poly I︰C 低、中、高劑量組心肌和肺組織CRP、IL-6 和IL-10 的含量分別高于Dex 低、中、高劑量組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表2、3。

表2 各組大鼠心肌組織CRP、IL-6、IL-10的含量（）

表2 各組大鼠心肌組織CRP、IL-6、IL-10的含量（）

*與對照組比較，P<0.05；#與模型組比較，P<0.05；&與Dex 低劑量組比較，P<0.05；△與Dex 中劑量組比較，P<0.05；▲與Dex 高劑量組比較，P<0.05；▽與Poly I∶C 低劑量組比較，P<0.05；▼與Poly I∶C 中劑量組比較，P<0.05。

表3 各組大鼠肺組織CRP、IL-6、IL-10的含量（）

表3 各組大鼠肺組織CRP、IL-6、IL-10的含量（）

*與對照組比較，P<0.05；#與模型組比較，P<0.05；&與Dex 低劑量組比較，P<0.05；△與Dex 中劑量組比較，P<0.05；▲與Dex 高劑量組比較，P<0.05；▽與Poly I∶C 低劑量組比較，P<0.05；▼與Poly I∶C 中劑量組比較，P<0.05。

2.4 WB檢測心肌、肺組織TLR-3、sFlt-1、TNF-α 的表達 模型組心肌和肺組織TLR-3、sFlt-1、TNF-α 的相對表達量均明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與模型組相比，Dex 低、中、高劑量組和Poly I︰C 低、中、高劑量組的心肌和肺組織TLR-3、sFlt-1、TNF-α 的相對表達量均降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），且分別隨Dex、Poly I︰C 濃度的增加而降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；Poly I︰C 低、中、高劑量組心肌和肺組織TLR-3、sFlt-1、TNF-α 的相對表達量分別高于Dex 低、中、高劑量組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表4、5。

表4 各組大鼠心肌組織TLR-3、sFlt-1、TNF-α的相對表達（）

表4 各組大鼠心肌組織TLR-3、sFlt-1、TNF-α的相對表達（）

*與對照組比較，P<0.05；#與模型組比較，P<0.05；&與Dex 低劑量組比較，P<0.05；△與Dex 中劑量組比較，P<0.05；▲與Dex 高劑量組比較，P<0.05；▽與Poly I∶C 低劑量組比較，P<0.05；▼與Poly I∶C 中劑量組比較，P<0.05。

表5 各組大鼠肺組織TLR-3、sFlt-1、TNF-α的相對表達（）

表5 各組大鼠肺組織TLR-3、sFlt-1、TNF-α的相對表達（）

*與對照組比較，P<0.05；#與模型組比較，P<0.05；&與Dex 低劑量組比較，P<0.05；△與Dex 中劑量組比較，P<0.05；▲與Dex 高劑量組比較，P<0.05；▽與Poly I∶C 低劑量組比較，P<0.05；▼與Poly I∶C 中劑量組比較，P<0.05。

3 討論

膿毒癥的發(fā)病機制是機體受到各感染因素的刺激激活體內(nèi)炎癥細胞，這些炎癥細胞釋放多種炎性介質(zhì)，這些炎性介質(zhì)之間產(chǎn)生級聯(lián)放大反應(yīng)使炎癥反應(yīng)失控，最終導致膿毒癥的發(fā)生[11]。妊娠合并膿毒癥的危險因素主要包括孕產(chǎn)婦肥胖、免疫力低下、侵入性操作和無菌條件差等[12]。妊娠合并膿毒癥有可能發(fā)生于妊娠期的任一階段，會致使孕婦流產(chǎn)、早產(chǎn)甚至死胎，大大增加了孕產(chǎn)婦的死亡率，是全球孕產(chǎn)婦死亡的主要原因之一[13]。臨床治療妊娠合并膿毒癥的方法主要是液體復蘇、支持治療和抗感染治療[14]。Dex 作為近期研究較多的新型治療膿毒癥的藥物，其作用機制依然不甚清晰。本研究通過構(gòu)建妊娠合并膿毒癥大鼠模型，探究Dex 對妊娠合并膿毒癥大鼠心肺組織損傷和炎癥反應(yīng)的作用及機制。

本研究中各組大鼠心肺組織形態(tài)學和細胞凋亡率比對結(jié)果均顯示，Dex 和Poly I︰C 均對減少妊娠合并膿毒癥大鼠心肺組織損傷和細胞凋亡有明顯效果，其作用效果對Dex、Poly I︰C 呈劑量依賴性，隨Dex、Poly I︰C 濃度的增加各組大鼠心肺組織損傷和細胞凋亡率呈減少趨勢。有研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠缺血再灌注損傷模型中，Dex 通過降低TLR-4 和核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）的表達調(diào)控TLR/NF-κB 信號通路，減輕肺泡間隔水腫及炎細胞聚集浸潤，保護心肌和肺器官[15]。Poly I︰C 是一種合成型的雙鏈核糖核酸類似物，有抗病毒和免疫調(diào)節(jié)功能，是TLR-3 的激動劑，可被TLR-3 識別，誘導IL-10、IL-6、TNF-α 等細胞因子的產(chǎn)生和NF-κB的活化，實現(xiàn)協(xié)同激活機體免疫的功能[16]。

本研究中，模型組心肌和肺組織的CRP、IL-6、IL-10含量及TLR-3、sFlt-1、TNF-α 的蛋白相對表達量均高于對照組；與模型組比，Dex和Poly I︰C 各濃度組心肌和肺組織的CRP、IL-6、IL-10 含量及TLR-3、sFlt-1、TNF-α 的蛋白相對表達量均降低，其中Dex 和Poly I︰C 的作用均呈劑量依賴性，且Poly I︰C 低、中、高劑量組的作用效果分別低于Dex 低、中、高劑量組。說明Dex 和Poly I︰C 均有下調(diào)妊娠合并膿毒癥大鼠模型心肌和肺組織的CRP、IL-6、IL-10 含量和TLR-3、sFlt-1、TNF-α 的蛋白相對表達的效果，且Dex 的作用效果優(yōu)于Poly I︰C，推測Dex 可通過同時調(diào)控TLR-4、TLR-3 的表達實現(xiàn)抗炎效果。CRP 是炎癥反應(yīng)的標志物，在機體發(fā)生炎癥反應(yīng)時，在IL-6、干擾素、腫瘤壞死因子等細胞因子的調(diào)控下，由肝細胞生成CRP 并迅速升高[17]。IL-10 作為抗炎因子能抑制促炎性細胞因子包括TNF-α、IL-1 和IL-6 等的產(chǎn)生[18]。TLR-3 作為病毒雙鏈核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）識別受體，不僅在機體免疫調(diào)控中扮演著重要的角色，而且在機體重要臟器的缺血再灌注損傷中起關(guān)鍵作用。TLR-3 通過介導含Toll-IL-1 受體（Toll-interleukin-1 receptor，TIR）結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)接蛋白（TIR-domain-containing adaptor inducing interferon，TRIF）途徑發(fā)出信號，TRIF 途徑被激活后活化干擾素調(diào)節(jié)因子3（interferon regulatory factor 3，IRF-3），誘導產(chǎn)生Ⅰ型干擾素，使NF-κB 表達增多和T 細胞趨化，其中γT 細胞釋放的血管內(nèi)皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）和轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF）等炎性因子，促使機體產(chǎn)生抗炎抗感染等天然免疫反應(yīng)[19]。sFlt-1 是血管內(nèi)皮生長因子受體家族成員，sFlt-1 與VEGF 結(jié)合并作為其競爭性抑制劑抑制VEGF 的促炎癥作用，sFlt-1 水平的升高是抗炎反應(yīng)啟動的重要標志，可作為膿毒癥的重要預后指標[20]。有研究發(fā)現(xiàn)，TLR-3 可上調(diào)sFlt-1 的表達，而TLR-3 在與配體結(jié)合后可誘導IL-10 的產(chǎn)生和發(fā)揮抗炎作用[21]，進一步證實了本研究的猜想。

綜上所述，右美托咪定很可能是通過降低TLR-3、TNF-α的表達水平，抑制CRP、IL-6和IL-10 的產(chǎn)生，下調(diào)代表機體炎癥反應(yīng)強度的sFlt-1 的水平，實現(xiàn)減輕妊娠合并膿毒癥大鼠心肺組織損傷的作用。但是本實驗僅作為初步的體外研究，其結(jié)果有待進一步的體內(nèi)實驗驗證。