訶子乙醇提取物聯合卡培他濱對小鼠4T1乳腺癌轉移瘤的抑瘤效果評價＊

馬婭楠，馬生萍，陳建春，李 念，殷祎隆

（西北民族大學醫學院，甘肅 蘭州 730030）

乳腺癌是當今女性發病率最高的惡性病之一。有研究發現多藥聯合對于三陰性乳腺癌的治療有明顯的抑制作用[1]。訶子是一種中藥，在蒙藥和藏藥中應用甚廣，其活性成分通過抑制血管生成,增強組織免疫力來發揮抗腫瘤的作用[2]；卡培他濱[3]在臨床上用于控制晚期乳腺癌的發生發展，因其為氟尿嘧啶類衍生物，經羧基酯酶、胞苷脫氨酶及胸腺嘧啶磷酸化酶（TP）等一系列酶促反應可轉化為5-Fu，抑制DNA合成，還可減少患者胃腸道不適等不良反應。推測訶子聯合卡培他濱對乳腺癌的發生發展有更好的抑制作用。本研究的目的是觀察訶子乙醇提取物聯合卡培他濱對4T1乳腺癌的抑瘤效果，并通過檢測小鼠外周血清中的TNF-α、INF-γ、IL-4和VEGF的含量，來探討其是否對4T1乳腺癌有抑制作用，以便為臨床治療乳腺癌提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗藥物

訶子果實5 kg（購自甘肅中醫藥大學）。

1.1.2 實驗動物

75只健康雌性BALB/c小鼠，6～8周齡（購自甘肅省新熙盛生物科技公司）。

1.1.3 試劑與儀器

4T1乳腺癌細胞株（購自甘肅惠博斯實驗器材經營部）；胎牛血清、1 640培養基及小鼠腫瘤壞死因子（TNF-α）、小鼠白介素-4（IL-4）、大鼠血管內皮生長因子（VEGF）、小鼠γ干擾素（IFN-γ）ELISA試劑盒均購自萊德公司；酶標儀（美國Bio Rad公司，型號iMark）、恒溫培養箱（上海精宏設備公司，型號DNP-9022）；高速冷凍離心機（德國Eppendorf，型號5424R）、搖床（美國SCILOGEX儀器，型號SK-O180-E）、超低溫冰箱（中科美菱低溫科技公司，型號DW-HL528）。

1.2 方法

1.2.1 細胞傳代培養

將復蘇的4T1乳腺癌細胞（來源于BALB/c小鼠的癌變乳腺組織）在10%胎牛血清的1 640培養基中進行傳代培養，觀察其貼壁情況并進行傳代，到第4代后取對數生長期的腫瘤細胞用于實驗，待細胞數量增長并貼滿細胞培養瓶瓶壁時，用胰酶消化液將貼壁的腫瘤細胞消化下來并且反復吹洗使其成為細胞懸液，將細胞懸液進行顯微鏡下計數，細胞濃度調整為2×106個/mL。

1.2.2 藥物制備

訶子果實粉碎后用60%乙醇加熱回流提取3次,合并提取液,濃縮后加入等量的95%乙醇攪勻,靜置過夜后濾過，濾渣用60%乙醇洗滌,洗液與濾液合并,減壓回收乙醇,干燥得提取物2.5 kg備用。

1.2.3 建立小鼠4T1乳腺癌模型及模型評定

將75只實驗小鼠隨機分成5組，即空白組、模型組、卡培他濱組、訶子組和聯合組（卡培他濱+訶子），每組15只；每天給予等量的食物與水，相隔2 d更換墊料，同時對鼠籠以及盛水器具進行消毒。待小鼠完全適應環境后按照預實驗的步驟取配制好的乳腺癌4T1細胞懸液，以0.2 mL/只的量注射于各組小鼠左側腋部皮下。一般在5～7 d后，荷瘤大小為5 mm×5 mm×5 mm即代表建模成功，并開始測量及記錄其長短徑和體重。在建模成功后開始對小鼠進行灌胃，灌胃時間固定在每天早晨9：00—11:00，連續灌胃5 d后休息2 d。灌胃方法為空白組和模型組：生理鹽水；卡培他濱組：50 mg·（kg·d）-1的卡培他濱片+生理鹽水懸濁液；訶子組以每只小鼠50 mg·（kg·d）-1/只/的訶子乙醇提取物與生理鹽水懸濁液灌胃；聯合組：50 mg·（kg·d）-1的卡培他濱片+訶子乙醇提取物+生理鹽水懸濁液，各組給藥劑量均為1 mL/只。每日觀察小鼠生活飲食和精神狀況，密切關注接種部位的瘤結節生長情況，腋下觸及質軟小結節。于灌胃后第21 d先行眼球取血，之后脫頸處死小鼠，取脾、胸腺備用。

1.2.4 檢測指標和方法

①瘤體體積與抑瘤率 荷瘤生長情況分別用游標卡尺測量腫瘤的長徑（a）、短徑（b），根據公式（V=ab2/2）計算腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線[4-5]。將剝離瘤體去除脂肪及血污后稱重，計算抑瘤率（%）[（模型組瘤質量-治療組瘤質量）/模型組瘤質量×100%]。

②胸腺指數與脾臟指數 將分離出的胸腺、脾臟稱重，計算胸腺指數（mg/g）［胸腺質量（mg）×10/小鼠體質量（g）］和脾臟指數（mg/g）［脾臟質量（mg）×10/小鼠體質量（g）］［6］。

③腫瘤組織HE染色切片 將小鼠腫瘤組織和臟器標本裝入盛有4%多聚甲醛固定液標本瓶中保存，經固定后，常規石蠟包埋再切成4 μm的薄片，切片用二甲苯脫蠟，再用各級的乙醇水洗，把水吸干后，用蘇木精-伊紅（HE）染色[7]后在顯微鏡下觀察。

④腫瘤肺轉移鑒定 將所有小鼠的同一側肺葉，在顯微鏡下觀察肺表面轉移結節并計數；小鼠肺組織放入提前配制好的固定液中固定，再經脫水、透明、浸蠟等過程后待其形成蠟塊進行切片、制片，HE染色鏡檢評價模型[8]。

1.3 統計學方法

數據用SPSS 19.0統計軟件進行分析。計數資料采用χ2檢驗的方法進行分析；計量資料以均數±標準差（）表示,四組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD法，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

由于在實驗后期各組均有1～2只小鼠的死亡，為各組數據的均衡，實驗小鼠的樣本統一為每組13只。

2.1 藥物干預對各組小鼠腫瘤體積、瘤重和抑瘤率的影響

由表1可見，4組小鼠瘤體體積（P<0.01）以及各組瘤重（P<0.05）間的差異均有統計學意義；各藥物干預組小鼠的瘤體體積均小于模型組（P均<0.01），訶子組與聯合組瘤重小于模型組（P<0.05），卡培他濱組小鼠瘤重小于模型組差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1 各藥物干預組瘤體體積、瘤重的比較（）

表1 各藥物干預組瘤體體積、瘤重的比較（）

與模型組相比**P＜0.01

各組在荷瘤早期腫瘤生長速度都很快，在荷瘤中期訶子組和聯合組的生長速度逐漸減慢且相近，在荷瘤末期卡培他濱組和訶子組生長速度相當，相比較而言聯合組速度最慢。

基于模型組的數據，各藥物干預組的抑瘤率分別是卡培他濱組（3.42%）＜訶子組（18.58%）＜聯合組（28.05%）。

2.2 藥物干預對各組小鼠胸腺和脾臟指數及肺結節的影響

由表2可得，各組小鼠胸腺指數差異無統計學意義（P>0.05）;各組小鼠脾臟指數和肺結節差異有統計學意義（P<0.05）;脾臟指數：與模型組相比，空白組脾臟指數最低（P<0.01），藥物干預后脾臟指數相比陰性組均有降低，組間兩兩比較訶子組的脾臟指數小于卡培他濱組具有統計學意義（P<0.01）；肺結節：與模型組相比，聯合組肺結節個數減少，差異顯著（P<0.01）。

表2 各藥物干預組胸腺、脾臟指數及肺結節變化情況(）

表2 各藥物干預組胸腺、脾臟指數及肺結節變化情況(）

注：與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與卡培他濱組相比，△△P＜0.01

2.3 各組小鼠TNF-a、IL-4、VEGF、INF-γ的變化情況

由表3可得，各組TNF-a、IL-4、VEGF、INF-γ的表達差異具有統計學差異（P均<0.01）；與空白組相比，模型組TNF-a、IL-4、VEGF均升高而INF-γ的表達降低具有統計學意義（P<0.05）；各藥物干預組與陰性組相比：聯合組、訶子組TNF-a降低具有明顯的統計學意義（P<0.01）；聯合組、卡培他濱組IL-4降低，差異顯著（P<0.01）；各藥物干預組VEGF均降低（P<0.05），其中聯合組與訶子組降低明顯（P<0.01）；卡培他濱組INF-γ升高，差異具有統計學意義（P<0.01）。

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表3 各組INF-γ、IL-4、TNF-α、VEGF在4T1乳腺癌荷瘤小鼠中的表達(）

表3 各組INF-γ、IL-4、TNF-α、VEGF在4T1乳腺癌荷瘤小鼠中的表達(）

注：與空白組相比，△P＜0.05，△△P＜0.01；與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.4 各藥物干預組的組織病理學結果

2.4.1 三陰性乳腺癌肺轉移標本的HE切片

模型組：肺轉移灶的數目較多、直徑較大，且易見侵犯細支氣管及侵犯血管壁的現象，腫瘤細胞異型性明顯、有核分裂相。

訶子組：與陰性組比肺轉移灶的數目及轉移灶的直徑未見明顯差別，腫瘤細胞異型性明顯、核分裂相常見，可見到侵犯血管壁的現象。和陰性組比轉移瘤的癌巢內浸潤的炎細胞明顯增多。

卡培他濱組：與陰性組比癌細胞出現變性，可見到較大面積的壞死，局部侵犯血管及細支氣管的癌細胞變性較為明顯，且有大量的炎細胞浸潤。

聯合組：與各單獨用藥組相比癌巢的體積變小，且局部癌細胞變性的面積與卡培他濱組相比增大。

2.4.2 三陰性乳腺癌種植瘤標本的HE切片

模型組：瘤細胞異型性明顯，核仁清晰、核分裂相常見。

訶子組：大部分區域瘤細胞異型性明顯，核仁清晰、核分裂相常見，少部分區域可見點狀壞死，及炎細胞浸潤。

卡培他濱組：瘤細胞異型性明顯，核仁清晰、核分裂相較少，局部組織出現片狀壞死。

聯合組：瘤細胞異型性明顯，核仁清晰、核分裂相常見，未見明顯壞死，與陰性組比較無明顯差別。

3 討論

乳腺癌作為女性群體高發病，近年來的發病率呈逐漸上升的趨勢。乳腺癌的發生與多種因素相關[11]。在各種因素的作用下，乳腺癌被分為四型，其中，以Ⅳ型惡性程度最高，因雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、原癌基因（Her-2）均為陰性，因此也叫三陰性乳腺癌。三陰性乳腺癌因其高轉移率、高致死率及預后差[12]等特征，受到國內外學者廣泛關注。4T1乳腺癌細胞作為一種普遍被應用于三陰性乳腺癌模型建立的細胞，常規應用于BALB/C小鼠[13-17]。

本實驗研究結果表明：訶子、卡培他濱兩藥聯合均對荷瘤小鼠瘤體體積及瘤重的增長具有抑制作用，聯合組的瘤體體積和瘤重差異最明顯，在生長曲線上的表現也印證了這一點；脾臟指數：荷瘤后各組脾臟指數均升高，各藥物干預組脾臟指數的升高低于模型組，說明荷瘤后小鼠免疫亢進，藥物干預對機體的過度免疫反應具有緩解作用；肺結節轉移：聯合組肺結節轉移數的降低具有明顯差異，兩藥聯合應用有降低肺部轉移率的功效。在病理切片上聯合組轉移癌巢平均體積也最小，證明訶子聯合卡培他濱降低肺部轉移率同時對已轉移組織的癌細胞生長也具有一定的抑制功效。

據相關文獻記載，抗原已致敏的CD4+Th細胞，在局部微環境如細胞因子的作用下可選擇性分化為Th1細胞或Th2細胞，Th1細胞通過其主要執行細胞因子INF-γ介導細胞免疫的發生；Th2細胞主要執行細胞因子IL-4介導體液免疫的發生[18]；TNF-α作為一種重要的促炎介質，可以增加中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞等炎性細胞的浸潤；VEGF會增加血管的生成，可以通過血管生成促進腫瘤的發生發展[19]。

以上結果說明4T1乳腺癌可以促進小鼠體內TNF-a、IL-4、VEGF大量表達引起荷瘤小鼠炎癥反應與體液免疫的亢進，同時，通過降低INF-γ抑制機體的細胞免疫。藥物干預后，單獨用藥或聯合用藥均可使荷瘤小鼠TNF-a、IL-4、VEGF的過度表達在一定程度上受到抑制，聯合組抑制效果最為顯著，此外卡培他濱INF-γ表現為荷瘤后的去抑制效果；表明訶子組可以通過抑制TNF-a與VEGF的表達削弱過度炎癥反應對機體的不利影響達到抗腫瘤效應，這與訶子的活性成分可以通過抑制VEGFR-2受體活化來抑制血管生成[20]，使腫瘤的生長受限的研究結果基本一致；卡培他濱組抑制機體IL-4、VEGF同時促進INF-γ的表達，通過緩解體液免疫的亢進、降低血管生成以及抵抗腫瘤對機體細胞免疫抑制而發揮效應；聯合組則通過同時抑制TNF-a、IL-4、VEGF表達來發揮抗腫瘤生長及抑制肺部轉移的作用。有研究發現[21]炎癥反應通過增強巨噬細胞的能力來增強小鼠的免疫力以抗腫瘤，本實驗的病理結果提示兩單獨用藥組較模型組相比炎性細胞的浸潤也確實增加，但在聯合組卻并未發現炎癥細胞相對模型組較為明顯的浸潤現象，與免疫學結果之間的差異尚需增加樣本進一步驗證與探究。

綜上所述，訶子聯合卡培他濱可以通過降低機體TNF-a、IL-4、VEGF的表達來抑制乳腺癌生長與轉移，也在一定程度上提示了兩藥聯合對4T1乳腺癌的抑制效果與TNF-a、IL-4、VEGF降低程度的正相關關系。本實驗再次驗證了中藥聯合化療抗腫瘤在腫瘤治療方面的相對優越性[22]，若應用于臨床能減輕患者病痛，增加治愈率，也可再一次提升中西醫結合抗腫瘤在臨床上的重視度與認可。