樟疫霉拮抗鏈霉菌S-03菌株發酵條件優化及其穩定性探究

孫志敏,李昱龍,沈紫竹,陳 芃,樊 奔,趙銀娟*

(1.南方現代林業協同創新中心,中國江蘇 南京 210037;2.南京林業大學a.生物與環境學院;b.林學院,中國江蘇 南京 210037)

樟疫霉屬卵菌門(Oomycota)、疫霉屬(Phytophthora),是全球最具破壞力的植物病原體之一[1]。樟疫霉侵染植物導致根部萎縮,葉片縮小褪綠,冠變薄和樹頸壞死[2];伴隨著土壤周圍產生黑色滲出物[3],主根逐漸壞死并延伸到側根和莖,最終導致植物的死亡[4]。樟疫霉的寄主植物從20世紀80年代的900多種,已增長到5 000多種[5],造成農林業巨大損失。因此,防治樟疫霉成為亟待解決的問題。在農林業生產中,人們普遍使用甲霜靈、亞磷酸鹽等化學農藥抑制疫霉病害[6～8]。但是,長期使用化學農藥會使病原菌產生耐藥性,而且化學殺菌劑對土壤環境及人類健康具有潛在威脅[9],因此,使用天然活性化合物和生物防治疫霉病害[3],是發展綠色農業的有效途徑。

放線菌(actinomycete)在自然界中廣泛分布,種類繁多,代謝功能各異,是人類獲得天然化合產物的主要來源。絕大多數已知的放線菌具有抗菌活性。目前,已發現的次級代謝產物達22 500多種,具有抑菌活性的有16 500種,其中10 100種來自放線菌,7 630種來自鏈霉菌(streptomycete)[10]。鏈霉菌能產生多種次生代謝物,包括抗生素、鐵載體、固氮酶、植物激素、抗菌酶、抗氧化劑等,從而促進植物生長和發育,抵抗病原菌的侵染[11～12]。因此,該菌在農林業極具應用價值。當前,已有多種抗菌代謝物被廣泛應用于真菌病害防治[13]。比如:嗜酸鏈霉菌(Streptomycesphilanthi)RM-1-138能通過產生揮發性物質,防控立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、灰梨孢菌(Pyriculariagrisea)、鐮刀菌(Fusariumfujikuroi)等植物病原真菌引發的病害[14];埃尼索氏鏈霉菌(Streptomyceteenissocaesilis)的發酵濾液可以有效抑制向日葵土壤中的寄生雜草(Orobanchecumana),增加向日葵根際多酚氧化酶的活性,改善根際有益微生物的菌群[15];從美洲鱷梨(ButyrospermumparkiiKotschy)和樟屬(Cinnamomum)植物根部分離出的內生木霉(Trichoderma),可以有效防治樟疫霉侵染引發的鱷梨根腐病[16]。因此,環境中存在著大量的具有潛在價值的生防鏈霉菌菌株。本研究前期從錦繡杜鵑(Rhododendron pulchrumSweet)土壤根際篩選得到了對樟疫霉具有拮抗效應的生防菌株阿勞瓊鏈霉菌(Streptomycesaraujoniae)S-03。阿勞瓊鏈霉菌是2013年巴西科學家Da Silva等[17]從馬鈴薯根部分離出來的一種新的鏈霉菌種,其對樟疫霉的拮抗作用為本實驗室首次報道,但關于該菌株的高效發酵條件及抑菌物質的物理化學特性尚不明確。因此,本研究圍繞菌株發酵條件優化、抑菌活性物質穩定性和離體植物葉片防治開展研究,為后期菌株的抑菌活性物質分離和鑒定做鋪墊,同時也為后續大規模發酵和生防菌劑的開發奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

阿勞瓊鏈霉菌菌株S-03由本實驗室從南京林業大學錦繡杜鵑健康植株根際土壤中分離篩選獲得,樟疫霉PC-1由南京林業大學森林保護系戴婷婷老師友情提供。

1.1.2 培養基

樟疫霉菌株的培養及鏈霉菌抑菌活性的檢測采用10%V8番茄汁培養基:V8番茄汁100 mL、CaCO33.0 g、瓊脂15.0 g,用去離子水補足至1 000 mL,121℃滅菌20 min。

鏈霉菌活化采用高氏一號(Gause’s synthetic agar)培養基:可溶性淀粉 20.0 g、K2HPO40.5 g、NaCl 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KNO31.0 g、FeSO4·7H2O 0.01 g,pH 7,用去離子水補足至1 000 mL,121℃滅菌20 min。

發酵種子液培養基:可溶性淀粉20.0 g、牛肉膏 3.0 g、葡萄糖 1.0 g、酵母粉 5.0 g、CaCO34.0 g,pH 7,用去離子水補足至1 000 mL,121℃滅菌20 min。

基礎發酵培養基:蛋白胨10.0 g、葡萄糖15.0 g、NaCl 1.0 g、(NH4)2SO41.0 g,用去離子水補足至1 000 mL,121℃滅菌20 min。

1.1.3 主要試劑及儀器

可溶性淀粉、牛肉膏、葡萄糖、酵母粉、CaCO3等分析純試劑,購自國藥集團化學試劑有限公司。

恒溫培養箱(松下健康醫療器械株式會社,日本);高速冷凍離心機(艾本德公司,德國);旋轉蒸發儀(IKA集團,德國),環境掃描電子顯微鏡(FEI公司, 美國)。

1.2 方法

1.2.1 生防菌株S-03發酵液制備

發酵種子液的制備:將菌株S-03接種于高氏一號固體培養基,28℃培養5 d;隨后,接種到發酵種子液培養基中,28℃、160 r/min培養3 d。

發酵液制備:按1%接種量將種子液接種到發酵培養基中,28℃、160 r/min培養7 d。6 000 r/min離心20 min后,上清液經0.22 μm濾膜過濾,用于抑菌活性檢測。

1.2.2 發酵液抑菌活性檢測

將樟疫霉接種于V8番茄汁固體培養基,25℃培養3 d。用6 mm打孔器打取菌餅,接種到新鮮V8番茄汁固體培養基中央,在菌餅左右兩邊1.5 cm處各用打孔器取出瓊脂塊,并在孔中分別添加50 μL培養基對照和阿勞瓊鏈霉菌S-03發酵液,25℃培養3 d,通過比較兩邊菌絲生長半徑的差異計算抑制率。

1.2.3 發酵培養基的優化

通過單因素實驗對培養基碳源、有機氮源、無機氮源和無機鹽條件進行優化。在基礎發酵培養基中,分別選用葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、麥芽糖、可溶性淀粉作為主要碳源(15 g/L);黃豆餅粉、蛋白胨、酵母粉、牛肉粉、尿素作為唯一有機氮源(10 g/L);NH4Cl、(NH4)2SO4、NH4NO3、NaNO3、KNO3作為無機氮源(1 g/L);ZnCl2、KCl、NaCl、MgCl2、MnCl2、CaCl2作為無機鹽(1 g/L)。參照方法1.2.2檢測各樣品抑菌活性,以確定最佳培養基成分。

1.2.4 發酵培養基的正交試驗

在對碳源、有機氮源、無機氮源和無機鹽營養成分完成篩選的基礎上,設計4因素3水平的正交試驗(表1),進行抑菌分析。每個處理重復3次。

表1 正交試驗因素和水平設計Table 1 The orthogonal test on factors and levels

1.2.5 發酵條件的優化

選用最優發酵培養基配方,對發酵的裝液量、起始pH、時間、接種量、溫度、轉速進行優化。每個處理重復3次。

裝液量:在250 mL錐形瓶中,分別添加25 mL、50 mL、75 mL、100 mL、125 mL、150 mL 的最優發酵培養基,28℃、160 r/min培養7 d。

起始pH:將培養基的起始pH分別調至4、5、6、7、8、9、10、11,28 ℃、160 r/min 培養 7 d。

發酵時間:在28℃、160 r/min條件下培養1～10 d。

接種量:將種子液分別以1%、2%、4%、6%、8%接入到發酵培養基中,28℃、160 r/min培養7 d。

發酵溫度:將發酵培養基分別置于25℃、28℃、31℃、34℃、37℃,160 r/min培養7 d。

發酵轉速:將發酵轉速分別設置為120 r/min、140 r/min、160 r/min、180 r/min、220 r/min,28 ℃培養7 d。

1.2.6 發酵液中抑菌物質的穩定性檢測

熱穩定性:取1 mL發酵液置于2 mL離心管中,分別在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃處理1 h,參考1.2.2的方法檢測各組分抑菌活性。每個處理重復3次。

酸堿穩定性:取10 mL發酵液,將pH分別調節至 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12,室溫放置 2 h 后調pH至7,測定各組分抑菌活性。每個處理重復3次。

光照穩定性:取5 mL發酵液置于培養皿中,室溫下打開蓋子,置于紫外燈下分別照射0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h,測定各組分抑菌活性。每個處理重復3次。

親水性和疏水性:在發酵液離心后的上清液中分別加入等體積的三氯甲烷、正丁醇、乙酸乙酯和石油醚,振蕩萃取24 h,分別檢測有機相跟水相的抑菌活性。每個處理重復3次。

1.2.7 菌株S-03發酵液對樟疫霉菌絲生長的影響

在V8番茄汁固體培養基中央接種樟疫霉,并用打孔器在樟疫霉左右兩邊打孔,分別添加50 μL培養基和S-03發酵液,28℃培養3 d,觀察菌絲生長狀況。將左右兩孔周邊的菌絲置于環境掃描電子顯微鏡Quanta 200下,觀察菌絲形態。

1.2.8 菌株S-03發酵液在離體植物的生防檢測

用75%乙醇浸泡錦繡杜鵑葉片30 s,無菌水沖洗3次后,用10%次氯酸鈉浸泡30 s,再用無菌水沖洗3次。病原菌對照組在葉脈兩側使用滅菌針制造表面傷口,接種樟疫霉菌餅。生防組接種S-03發酵液后立即接種樟疫霉。處理后將葉片置于含潤濕的無菌濾紙平板中,28℃恒溫箱內培養5 d,評估防治效果。

1.2.9 數據處理

所有數據用平均值±標準差（)表示。原始數據記錄于Excel 2016。培養基營養條件、發酵參數和抑菌物質穩定性,以及正交試驗,均使用SPSS 19進行顯著性差異分析。使用Photoshop 2018計算病斑與葉片像素比,測定葉片相對病斑面積。使用GraphPad Prism 8.0繪制圖片。

2 結果

2.1 發酵培養基成分的優化

我們首先對培養基的碳源、有機氮源、無機鹽、無機氮源進行了優化。所選的6種碳源培養基的抑菌效果如圖1A所示,菌株S-03在6種不同的碳源中均能產生抑菌活性物質,但無顯著差異;以可溶性淀粉為碳源時,菌株S-03對樟疫霉的抑制率相對較高,達到58.44%。5種有機氮源發酵液的抑菌檢測效果如圖1B所示,以酵母粉和黃豆餅粉為有機氮源時抑菌效果最佳,分別是47.28%和50.27%,與蛋白胨、尿素、牛肉粉3種發酵液的抑菌效果有顯著差異。對于無機鹽成分而言,菌株S-03對KCl的利用效果較好,其次是NaCl、MgCl2(圖1C)。此外,菌株S-03以NH4Cl為無機氮源時,抑菌效果最差,僅為25.49%,以(NH4)2SO4為無機氮源時抑菌效果最佳,達到45.23%(圖1D)。上述結果說明培養基成分能顯著影響發酵液的抑菌效果。

圖1 菌株S-03發酵培養基的優化(A)碳源;(B)有機氮源;(C)無機鹽;(D)無機氮源。不同字母表示不同處理經Duncan’s新復極差法檢驗,在P＜0.05水平差異顯著。Fig.1 Optimization of fermentation medium for strain S-03(A)Carbon sources;(B)Organic nitrogen sources;(C)Inorganic salts;(D)Inorganic nitrogen sources.Different letters indicate significant difference(P＜0.05)when different treatments were tested by Duncan’s new multiple range method.

2.2 培養基成分質量濃度的優化

采用正交試驗對碳源、有機氮源、無機鹽、無機氮源的最佳培養基質量濃度進行優化,結果如表2所示。根據R值的大小可知,4種因素對菌株S-03發酵液抑菌效果的影響順序為:黃豆餅粉＞KCl＞(NH4)2SO4＞可溶性淀粉。根據K值的大小可得出,最佳發酵培養基水平為可溶性淀粉(3)、黃豆餅粉(1)、(NH4)2SO4(1)、KCl(1),即最佳發酵培養基配方為:可溶性淀粉45 g/L、黃豆餅粉20 g/L、(NH4)2SO41 g/L、KCl 1 g/L。

表2 正交試驗結果Table 2 Orthogonal experiment results

2.3 發酵條件的優化

選用最優發酵培養基對發酵條件進行優化,結果如圖2所示,在起始pH 8、裝液量75 mL/250 mL、發酵時間7 d、接種量2%、發酵溫度28℃、轉速160 r/min時,菌株S-03的抑菌活性最佳。菌株S-03原始配方發酵液的抑制率僅為30.92%(圖3A),而優化后發酵液的抑制率達到了58.66%(圖3B),相比原配方提高了89.72%。

圖2 不同發酵條件對菌株S-03發酵液抑菌效果的影響(A)發酵起始pH;(B)裝液量;(C)發酵天數;(D)接種量;(E)發酵溫度;(F)發酵轉速。不同字母表示不同處理經Duncan’s新復極差法檢驗,在P＜0.05水平差異顯著。Fig.2 The influence of different fermentation conditions on the antifungal effect of the fermentation broth of strain S-03(A)Initial pH value;(B)Amount of liquid;(C)Fermentation time(days);(D)Inoculum amount;(E)Fermentation temperature;(F)Rotation speed during fermentation.Different letters indicate significant difference(P＜0.05)when different treatments were tested by Duncan’s new multiple range method.

圖3 優化培養基配方和發酵條件后菌株S-03發酵液的抑菌效果比較(A)原配方發酵液抑菌效果;(B)優化配方后發酵液抑菌效果。Fig.3 Comparison of the antifungal effect of strain S-03 fermentation broth after medium formula and fermentation condition optimization(A)The antifungal effect before optimization;(B)The antifungal effect after optimization.

2.4 菌株S-03發酵液抑菌活性物質的穩定性與極性分析

為了探究S-03菌株發酵液在不同環境的應用效果,我們對菌株S-03發酵液的熱穩定性、酸堿穩定性、紫外穩定性以及抑菌物質的極性進行了分析。結果顯示:pH＞7時,發酵液的抑制率隨pH的升高而降低,在3～7范圍內,發酵液的抑制率波動較小,表明其能夠耐受酸性條件,但堿性條件對活性物質可能具有破壞作用(圖4A);隨著溫度的升高,發酵液的抑制率逐漸降低,說明它不能耐受高溫(圖4B);發酵液經紫外照射處理后,各組分的抑制率沒有顯著差異,說明發酵液的紫外穩定性較高(圖4C);發酵液經正丁醇、乙酸乙酯和三氯甲烷萃取后,均有很好的抑菌效果,但經石油醚萃取后抑菌活性顯著降低(圖4D),表明S-03產生的抑菌物質極性較低,與正丁醇、乙酸乙酯和三氯甲烷極性接近。

圖4 菌株S-03抑菌物質的穩定性(A)酸堿穩定性;(B)熱穩定性;(C)紫外照射穩定性;(D)抑菌物質極性。不同字母表示不同處理經Duncan’s新復極差法檢驗,在P＜0.05水平差異顯著。Fig.4 Stability of the antifungal substance from strain S-03(A)Acid-base stability;(B)Thermal stability;(C)UV-irradiation stability;(D)Polarity.Different letters indicate significant difference(P＜0.05)when different treatments were tested by Duncan’s new multiple range method.

2.5 菌株S-03發酵液對樟疫霉菌絲生長的影響

利用掃描電子顯微鏡觀察發酵液對樟疫霉菌絲形態的影響,結果顯示:菌絲表面發生不同程度的損傷,呈現不均一的塌陷和皺縮干癟(圖5C,紅色箭頭指示)。而對照菌絲生長旺盛(圖5A左側),形態飽滿,粗細均勻(圖5B)。上述結果表明,S-03發酵液能夠破壞樟疫霉菌絲的結構,從而抑制其生長。

圖5 菌株S-03發酵液對樟疫霉菌絲形態的影響(A)S-03發酵液與樟疫霉平板對峙;(B)樟疫霉正常菌絲;(C)發酵液處理的樟疫霉菌絲。Fig.5 The effect of strain S-03 fermentation broth on the morphology of P.cinnamomi(A)S-03 fermentation broth vs.P.cinnamomi in plate culture;(B)P.cinnamomi normal mycelia;(C)P.cinnamomi mycelia treated with fermentation broth.

2.6 菌株S-03在杜鵑葉片上的生防測試

為了檢測菌株S-03發酵液的生防效果,選擇離體杜鵑葉片(在平板中保濕培養5 d)進行生防效果檢測。結果顯示:接種樟疫霉菌餅的杜鵑葉片出現黑色病斑(圖6B),相對病斑面積為9.40%;未接種對照組無明顯病斑(圖6A);對于接種S-03發酵液再接種樟疫霉的葉片,傷口病斑明顯減弱(圖6C),相對病斑面積僅為1.88%,提示S-03發酵液有效減緩了樟疫霉對葉片的侵染。生防測試結果表明,菌株S-03發酵液在體外能夠有效保護植物,防治效率高達80.00%。

圖6 菌株S-03對杜鵑葉片的生防效果檢測(A)未接種樟疫霉;(B)僅接種樟疫霉;(C)發酵液處理后接種樟疫霉;(D)杜鵑葉片相對病斑面積(每個處理3個葉片)。不同字母表示不同處理經Duncan’s新復極差法檢驗,在P＜0.05水平差異顯著。Fig.6 Biocontrol effect of strain S-03 on R.pulchrum leaves(A)Uninoculated;(B)Inoculated with P.cinnamomi;(C)Treated with fermentation broth before inoculation with P.cinnamomi;(D)Relative lesion area on leaves(3 leaves per treatment).Different letters indicate significant difference(P＜0.05)when different treatments were tested by Duncan’s new multiple range method.

3 討論

本研究前期篩選得到一株能有效抑制樟疫霉的生防鏈霉菌菌株S-03,其被鑒定為阿勞瓊鏈霉菌。有研究發現,阿勞瓊鏈霉菌可以通過產生纈氨霉素(valinomycin)和大環內酯類(macrolides)抗生素來抑制灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)[18]。Liu等[19]從中國青藏高原分離出阿勞瓊鏈霉菌HSA312,其發酵液能有效抑制稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)菌絲的生長、分生孢子的萌發和附著物的形成。本研究也是首次報道阿勞瓊鏈霉菌S-03對樟疫霉有抑制作用,這拓寬了阿勞瓊鏈霉菌的抗菌譜。本文采用單因素和正交試驗相結合的方法,對菌株S-03的發酵培養基條件及參數進行了優化,同時對菌株S-03發酵液的理化性質進行了分析,為后續抑菌物質分離純化奠定了基礎。

發酵是微生物獲得大量活性物質的重要途徑,而發酵培養基的成分對活性物質的代謝合成具有十分重要的作用[20]。相關文獻表明,不同的發酵培養基配方及條件對菌株所產生的抑菌活性物質有很大的影響[21]。因此,發酵培養基的優化及穩定性分析對后續抑菌活性物質的分離、純化及大規模制備具有重要意義。本研究通過結合單因素試驗及正交試驗對S-03菌株的發酵條件進行了優化,獲得了菌株最適宜的發酵培養基配方及條件,但沒有考慮交互作用。正交試驗結果顯示,黃豆餅粉是影響菌株發酵液抑菌活性的主要因素(表2)。黃豆餅粉的蛋白質含量可達40%左右,并且含有豐富的氨基酸和維生素,能促進菌體生長和代謝產物的積累[22];此外黃豆餅粉成本低廉,原料豐富,且容易獲取,因此其是后期進行規模化發酵生產的重要有機氮源。菌株S-03的發酵培養基中除了有機氮源黃豆餅粉外,還額外增添了無機氮源(NH4)2SO4,可以提高抑菌活性產物產量,這與鏈霉菌TD-1[23](氮源為黃豆餅粉+硝酸鉀)相似。在發酵參數優化中,發酵起始pH和發酵天數對抑菌產物活性有較大影響,這與鏈霉菌GS-3-39[24](起始pH 5)、海洋放線菌H74-18[25](發酵時間72 h)差異較大。同種不同屬的菌株發酵參數大相徑庭,這可能與菌株自身的生理特征、遺傳分化特性及分離來源有關,也可能與其生成活性物質的代謝通路有關,值得深入探討。

發酵液中抑菌活性物質的穩定性是進行大規模菌劑生產的必要因素。周麗娜等[26]報道兩株鏈霉菌HD-109、HD-103的抗菌活性物質對紫外光照敏感,照射5 h后,抑菌活性完全喪失,這限制了菌株在大田的生防應用。在本研究中,阿勞瓊鏈霉菌S-03發酵液的穩定性實驗表明,其抑菌活性物質能耐受pH 3～9條件(圖4A)、60℃以下溫度(圖4B)以及紫外線照射(圖4C),這有利于菌株S-03的野外生防應用。

發酵液對樟疫霉菌絲形態造成較大影響(圖5C),推測發酵液中可能含有一些功能蛋白質,如纖維素酶、蛋白酶等,可破壞疫霉菌絲,也可能是菌株S-03產生的抗生素破壞了細胞膜的完整性。阿勞瓊鏈霉菌S-03發酵液經過有機溶劑萃取后仍然存在較好抑菌效果,說明活性物質很可能是次級代謝產物,具體有待進一步的分離鑒定。阿勞瓊鏈霉菌S-03在離體植物葉片中也表現出良好的生防效果,但本文缺少完整植株實驗,后續將在無菌苗以及大田試驗中繼續驗證阿勞瓊鏈霉菌S-03的生防效果。有文獻表明,鏈霉菌在防治植物真菌的同時還具有促進植物生長的作用,如:絳紅褐鏈霉菌(Streptomycetepurpeofuscus)SP3[27]菌株對紅豆杉土傳根病和紅豆杉植株具有防治與促生的雙重作用,這極大提高了菌株的應用性。本實驗尚未對阿勞瓊鏈霉菌S-03的促生作用進行研究,這也是后續研究的重要方向。

綜上所述,阿勞瓊鏈霉菌S-03有潛力作為林業上防治樟疫霉根腐病害的生防菌株,有望制成生物菌劑,投入生防應用。優化后的培養基及培養條件極大提高了發酵液中抑菌活性物質的抑菌效果,為規模化投入生產應用提供了理論基礎。