細胞衰老檢測指標及衰老模型研究進展

張凌云,劉 纓

(北京中醫藥大學生命科學學院,中國北京 102488)

細胞衰老(cellular senescence,CS)是細胞增殖、分化能力和生理功能逐漸發生衰退的變化過程[1～2]。細胞衰老研究是衰老機制、抗衰老、抗癌[3]研究的重要內容之一,而構建細胞的衰老模型是研究細胞衰老必不可少的步驟。根據誘發因素的不同,細胞衰老可以劃分成應激誘導早衰(stress-induced premature senescence,SIPS)、復制性衰老(replicative senescence,RS)[4～5]、癌基因誘導衰老(oncogene-induced senescence,OIS)。

衰老指標對于驗證所制備模型成功與否十分重要,指標的選擇也同樣重要。目前,不同文獻中使用的衰老細胞模型和檢測指標都不盡相同。不同情況下如何選用合適的模型和檢測指標尚無統一標準。本文討論和分析了現有的一些細胞衰老模型的建立方法,列舉了常用的細胞衰老檢測指標并總結了其選擇方法,以便為相關的研究提供參考。

1 檢測指標

細胞衰老的特征包括細胞形態變化、細胞周期阻滯、氧化應激水平和染色質的改變。由于沒有單一的性狀可以獨自定義細胞衰老,所以體外衰老表型的確定往往需要多個特征同時驗證,有文獻建議至少驗證3個不同的特征[6]。具體的檢測指標有基于這些特征的通用指標,如:衰老相關的β-半乳糖苷酶(senescence-associated beta-galactosidase,SA-β-Gal)活性升高、細胞形態改變、衰老相關蛋白質累積、細胞周期分布改變、DNA損傷灶產生[7]、衰老相關的分泌表型(senescence-associated secretory phenotype,SASP)[1,8]等;也有基于不同誘導劑以及細胞類型的特異指標,如:造血祖細胞混合細胞集落形成單位(colony forming unitmix,CFU-mix)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、ATP的合成及線粒體的膜電位。

1.1 形態變化相關指標

1.1.1 衰老相關的β-半乳糖苷酶活性

SA-β-Gal活性升高被一致認為是評價細胞衰老的生物學標志。目前,絕大部分關于細胞衰老模型的文獻都有使用SA-β-Gal染色法對其活性進行檢測,只有少數例外[9]。這也是唯一可以將不同文獻中所建立的模型進行對比的指標。Dimri等[4]首次證明,該生物標志物在生物體內隨著細胞的衰老而逐漸積累增多。β-Gal是一種水解酶,其在衰老前細胞、靜止細胞和終末分化細胞中是缺乏的,只有在衰老細胞中才可以催化β-半乳糖苷水解為單糖[4,6,10]。在pH為6.0的條件下進行β-Gal測定時,只有處于衰老狀態的細胞才會出現由人工顯色底物X-Gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)分解產生的藍色染色沉淀物。該現象是由于內源性溶酶體β-Gal特異性地在衰老細胞中的過度表達和積累,可以很容易并且可靠地在原位和體外被檢測到[4,11]。用光學顯微鏡進行觀察并且計數時,表達藍色的細胞即為β-Gal陽性,細胞陽性染色百分率可以表示群體衰老程度。

1.1.2 細胞形態變化

衰老細胞的形態特征是體積增大,生長在固體表面時明顯扁平,細胞核增大且形狀不規則。這些特征觀察起來很方便,部分文獻選擇細胞形態作為細胞衰老的檢查指標[12],但是沒有一個量化標準。McKenna等[13]根據細胞形態的特征變化,利用細胞核染料4＇,6-二脒基-2-苯基吲哚(4＇,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)標記核DNA,以生長細胞扁平化時DNA相關的部分區域熒光強度與細胞核面積比值的下降,作為衰老的一個形態計量指標。核纖層蛋白B1(lamin B1)是維持細胞核結構完整性的關鍵,其減少導致核完整性和穩定性下降,繼而導致其他核變化[6,14],這種減少可以通過成像或免疫印跡檢測,從而指示體外衰老表型[6,15]。

1.1.3 衰老相關的分泌表型

衰老的發生經常與持續性的DNA損傷反應(DNA damage response,DDR)有關[15],同時伴隨著細胞分泌功能增加,即衰老相關分泌表型(SASP)。SASP因子的種類復雜多樣,主要有促炎因子、生長因子、趨化因子等[16]。復制性衰老與誘導型衰老有相類似的表型,它們都會引起相關炎癥因子的釋放,出現SASP。促炎因子是SASP的重要組成部分之一,是衰老細胞的關鍵特征[17]。另外,白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)和IL-8在衰老細胞中表達上調,也是細胞衰老的重要指標。IL-8是C-X-C趨化因子家族的一員,在細胞凋亡中發揮著重要作用[17]。

1.2 細胞周期相關指標

1.2.1 衰老相關細胞周期蛋白

周期蛋白依賴性激酶抑制物(cyclin-dependent kinase inhibitor,CKI)是一種調節細胞增殖的重要信號分子,其中最具代表性的是P16、P21和P53[17]。P21、P53、P16的表達上調可促進細胞衰老發生[18～19]。細胞衰老的一個主要特征是不可逆轉的細胞生長周期停滯,這主要是由于P16/RB和P53/P21通路的調節,這兩條通路的調節和變化也是導致細胞衰老的兩種理論信號轉導機制[20]。P16INK4a、P21-Cip1是認可度較高的衰老相關標志物。P21能夠普遍結合進而阻礙各類周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)復合物的生成,降低RB的磷酸化水平,抑制E2F的釋放,阻礙DNA的生成,進而致使細胞無法進入S期,只能停滯在G1期,最終誘發細胞衰老[21]。p53基因是一種與細胞生長、凋亡、衰老和DNA修復相關的重要基因。有研究指出,降低p53基因的表達水平可以減少皮膚細胞凋亡,并且能夠一定程度緩解皮膚衰老[22～23]。p53同時也是一種抑癌基因,其編碼的蛋白質P53參與細胞對DNA損傷的應答,具有促進或抑制衰老的雙重作用[4,24]。

1.2.2 細胞周期分布

細胞周期是指連續分裂的細胞從一次分裂完成時開始到下一次分裂完成時為止的過程。細胞周期調控細胞衰老,G1/G0期的永久性細胞周期停滯是細胞衰老的特征之一,此種停滯由每個細胞的DNA數量決定。相較于年輕細胞,衰老細胞中處于S期的細胞進一步減少,G1/G0比值下降,G2/M比值增加[25]。因此,細胞周期各期的分布情況也可用于監測衰老,其常采用流式細胞術或碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色法進行分析。

1.3 細胞抗氧化能力檢測指標

自由基所導致的氧化損傷是細胞衰老的幾大學說之一。機體的抗氧化能力與衰老密切相關,當機體受到壓力刺激或抗氧化能力減弱時,過量的活性氧(reactive oxygen species,ROS)在體內堆積,導致氧化損傷,從而引發衰老及相關疾病[26]。衰老往往伴隨著抗氧化能力的下降,因此抗氧化因子的表達和活力也是常用的衰老指標。如:超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)是清除ROS的關鍵酶,可以將毒性超氧化物轉化為過氧化氫和水[20]。SOD是機體抗氧化系統的重要組成部分,也是機體抗氧化能力的重要評價指標。

長壽基因Sirt1(sirtuin1)表達的去乙酰化酶可抑制p53基因表達,延緩細胞的凋亡和衰老[27～28]。該因子在線粒體調控及清除ROS的過程中也起到關鍵作用,可通過抑制核轉錄因子κB(nuclear transcription factor-κB,NF-κB)通路降低細胞內ROS的水平,進而延緩細胞的衰老進程[19]。NF-κB是一種和衰老有密切關聯的調控因子,其過表達可以引起所培養的細胞出現衰老表型[19]。丙二醛(malondialdehyde,MDA)是膜脂過氧化的重要產物之一,其水平能夠反映出機體內脂質過氧化的程度,從而間接說明細胞受到傷害的程度。由于ROS的產生和線粒體有關,所以線粒體膜電位水平也能夠在一定程度上說明機體的氧化損傷程度[29]。因此,NF-κB、MDA和線粒體膜電位均可作為機體抗氧化能力降低的間接檢測指標。

1.4 染色質改變相關指標

1.4.1 DNA損傷灶

除了顯著的形態學改變、SA-β-Gal活性升高,與衰老相關的異染色質灶(senescence-associated heterochromatin foci,SAHF)是衰老細胞的另一個典型特征[15],組蛋白H3第9位賴氨酸三甲基化(H3 lysine 9 trimethylation,H3K9me3)、異染色質蛋白 1γ(heterochromatin associated protein 1γ,HP1γ)是其標志蛋白質[30～31]。DNA是組成染色質的主要成分。DNA損傷中最嚴重的形式為DNA雙鏈斷裂,其應用最廣泛的標記物是γ-H2AX(phosphorylated histone H2AX)。

1.4.2 DNA甲基化

部分DNA甲基化數據已被開發為衰老的生物標志物,即“表觀遺傳時鐘”,其已被廣泛用于識別健康和疾病(包括認知功能衰退和其他神經退行性變性疾病)的實際年齡與生物年齡之間的差異,是目前最具前景的衰老生物標志物之一[32]。DNA甲基化時鐘包括特定的一組由嘧啶-磷酸-鳥嘌呤二核苷酸組成的DNA甲基化位點,其甲基化狀態可用于測量主觀年齡,即生物衰老程度。這些時鐘被認為是人類和其他脊椎動物按時間順序年齡的準確生物標記,可以量化生物衰老的速度[33]。

近期,Liu等[34]首次從多角度對11個當前的DNA甲基化時鐘進行了比對分析,并建立了新的組合式DNA甲基化時鐘“meta-clock”,其在反映衰老特征方面更為高效,而且可以區別腫瘤與正常組織,可以更好地進行全因死亡預測。這類組合式時鐘的探索,或許將有利于開發出更有效可靠的衰老生物標志物用于臨床及轉化研究。

1.5 特異指標的選擇

1.5.1 和細胞的類型有關

衰老指標的選擇和細胞類型相關,因為不同細胞有其特異的衰老表現。例如,干細胞的自我更新能力會隨著機體年齡的增加而不斷下降,部分研究者會利用細胞增殖能力檢測方法,如CCK8、Ki67免疫熒光染色[35～36],輔助干細胞衰老鑒定。當然,增殖能力不僅僅是干細胞才有,一些增殖能力較強的細胞模型在衰老鑒定的時候也會用到增殖檢測,如大鼠髓核細胞(nucleus pulposus,NP)[35]、乳腺癌細胞[36]。對于造血干細胞(hematopoietic stem cell,HSC)和祖細胞(hematopoietic progenitor cell,HPC),集落形成單位(colony-forming unit,CFU)是評價其自我更新能力以及多向分化潛能的重要指標[37～38],有研究選用CFU-mix作為多向HSC的衰老評價指標[38]。堿性磷酸酶(ALP)高表達是牙囊細胞(dental follicle cell,DFC)早期分化的重要指標[39],也可作為其衰老檢測指標。纖溶酶原激活物抑制劑-1(plasminogen activator inhibitor 1,PAI-1)是一類有效的纖溶抑制劑和血栓形成的介質,其表達可以作為人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)衰老的標志物[40]。另外,相關研究在對人真皮成纖維細胞(human dermal fibroblast,HDF)進行研究時,將Ⅰ型膠原蛋白(collagen typeⅠ,Col-Ⅰ)和基質金屬蛋白酶-1(matrix metalloproteinase 1,MMP-1)納入檢測指標[9]。表1給出了部分衰老指標在不同細胞相關研究中的選用情況[9,30,35,37,39～41]。

表1 衰老指標在不同細胞中的應用Table 1 Hallmarks of senescence applied for different cells

1.5.2 和誘導劑的種類有關

衰老指標的選擇還和誘導劑的種類有關。例如:使用H2O2作為誘導劑的時候,由于H2O2通過氧化應激的方式,最終引起DNA的損傷,激活P53/P21信號通路,所以研究人員往往會將DNA損傷標志物γ-H2AX或者P21等衰老相關蛋白質加入檢測指標[42～43];選用血管緊張素Ⅱ(angio-tensinⅡ,AngⅡ)作為誘導劑對人血管平滑肌細胞(human vascular smooth muscle cell,hVSMC)進行研究時,因AngⅡ可以通過端粒依賴性和非依賴性途徑介導DNA氧化損傷,從而加速血管平滑肌細胞的衰老,所以研究人員將DNA損傷、端粒DNA長度納入其檢測指標[44]。AngⅡ還可以刺激NADPH氧化酶1(NADPH oxidase 1,Nox1)激活,并通過降低過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor-γcoactivator-1α,PGC-1α)活性、增加線粒體氧化應激等途徑,介導線粒體功能障礙,導致血管平滑肌細胞的衰老,因此,Tsai等[29]將ATP的合成及線粒體的膜電位也用于衰老判定。

1.5.3 和研究目的有關

衰老指標的選擇也和研究目的有關。自噬途徑具有消除受損蛋白質和細胞器進而延長壽命的功能,衰老的細胞往往伴隨自噬活性的下降。有研究發現,自噬通過消除損傷細胞器、減輕氧化應激、促進胞內物質循環等途徑,保護血管內皮細胞,避免其死亡[45]。Wang等[46]在研究蟲草素對衰老的抑制作用與自噬途徑的相關性中,就將細胞自噬水平相關蛋白質P62、微管相關蛋白輕鏈3B(microtubule associated protein 1 light chain 3B,LC3B)納入檢測指標。

2 細胞衰老模型

無論是通用或者非通用檢測指標的選擇,其目的都是對細胞衰老進行更深入的研究。人為構建的細胞衰老模型根據誘發因素的不同,可以劃分成應激誘導早衰、復制性衰老以及癌基因誘導衰老。

2.1 復制型

復制性衰老是端粒在每次分裂結束時逐漸侵蝕的結果,直至細胞達到端粒功能障礙的狀態(稱為Hayflick的極限)[47]。復制性衰老模型是基于器官老化內在機制的常用實驗性衰老模型[48]。復制性衰老模型的構建一般不使用藥物,這避免了與后期實驗組進行藥物處理時發生沖突,因此模型適用范圍更廣。但是,其造模往往需要多次反復傳代,耗費的時間和人力較大[49]。

當前,多種細胞被用于復制性衰老研究。例如:王曉睿[49]對鼠腎小管原代上皮細胞進行傳代培養,13 d后衰老比率超過95%;Han等[50]研究了自噬在復制衰老過程中的可能作用,發現基礎自噬水平降低可能是人類包皮成纖維細胞Hs68復制性衰老的機制;Delfarah等[51]基于液相色譜-質譜聯用(liquid chromatography-mass spectroscopy,LC-MS)的代謝組學,研究了衰老的原代人乳腺上皮細胞(human mammary epithelial cell,HMEC),發現抑制核苷酸合成促進HMEC的復制衰老;Gao等[52]利用人胚肺二倍體成纖維細胞(human embryonic lung diploid fibroblasts)2BS和人胚肺成纖維細胞(human fetal lung fibroblasts)WI-38證明,E2F1介導復制衰老過程中POLD1[polymerase(DNA)delta 1]的下調。

2.2 誘導型

誘導型衰老模型(SIPS)與復制型不同,其構建有H2O2、輻射、高糖、藥物等多種誘導方式,其中H2O2是最常用的誘導劑,通常可以在幾天之內完成衰老模型的構建,并且對多種細胞都有效[49]。

2.2.1 H2O2誘導

氧化損傷是現今較為常見的細胞衰老模型構建原理。H2O2通過氧化應激的方式,最終引起DNA的損傷,激活P53/P21信號通路[53]。H2O2誘導條件基于實驗目的和細胞類型的不同而調整。Marazita等[43]建立了H2O2誘導的ARPE-19細胞衰老模型,其將細胞暴露于150 mmol/L H2O290 min,維持培養基培養10 d后,陽染率有80%。Lim等[54]用1 mmol/L H2O2處理人骨骼肌成肌細胞(CHQ5B)30 min,探討富托三烯酚組分(tocotrienol-rich fraction,TRF)對其衰老的調控作用。蘇慧麗等[55]選擇人胚肺二倍體成纖維細胞系2BS制備衰老模型,200 μmol/L H2O2處理2 h后,培養5 d,陽染率接近95%。

三丁基過氧化氫(tert-butyl hydroperoxide,t-BHP)也被用作制備細胞氧化損傷模型的誘導劑。Zhou等[38]報道,t-BHP可致小鼠造血干細胞(HSC)衰老,其誘導培養6 h后細胞的衰老陽染率達到57.92%±4.24%。

2.2.2 輻射誘導

輻射誘導對環境的要求較高,并且需要更加精密的分析儀器[49]。衰老的主流觀點認為,DNA損傷積累最終導致機體衰老,而電離輻射可以使DNA的雙鏈斷裂繼而致使DNA損傷。

Dalle Pezze等[56]設計了一個數學模型來模擬20 Gy X射線照射5 min誘導細胞衰老的動態過程。模型整合了細胞老化的5個關鍵調控因素:胰島素受體、FoxO3a(forkhead box protein O 3a)、DDR、ROS和線粒體功能。其優點是可以隨時對模型進行調整,且快速;缺點是對于未弄清楚機制的衰老調節通路,無法復制進模型中。Schick等[57]聯合應用放射療法(radiotherapy,RT)與曲美替尼,探索曲美替尼使RAS/RAF突變黑色素瘤細胞放射增敏的機制。McRobb等[41]用20 Gy劑量的輻射誘導小鼠腦微血管內皮細胞(brain-derived endothelial cells.3,bEnd.3)衰老,發現第6天時陽染率達到65%±8%。此外,也有文獻使用311 nm紫外線(UVB)誘導HDF細胞衰老,結果顯示細胞陽染率可達到90%左右[58]。

2.2.3 高糖誘導

在誘導細胞衰老中,D-半乳糖是被使用得較多的糖類誘導劑[9]。D-半乳糖在正常情況下可經肝臟代謝成葡萄糖,但在較高濃度時,D-半乳糖在醛糖還原酶的催化下還原成半乳糖醇[42],后者的積累導致細胞滲透壓變化、細胞腫脹、膜脂損傷等衰老表現。D-半乳糖誘導的細胞損傷可以觸發ROS的生成[59],導致腦神經退化。此外,D-半乳糖可以誘發蛋白質糖基化反應,最終形成晚期糖基化終末產物(advanced glycation end product,AGE)[60],AGE聚集是許多年齡相關退行性疾病的常見特征[59]。目前,高糖與衰老之間的關系仍未完全闡明。

除了D-半乳糖,脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、葡萄糖等也可用于誘導細胞衰老。Hou等[35]用濃度為0.2 mol/L的葡萄糖誘導大鼠髓核(NP)細胞衰老。劉印康等[9]用脂多糖誘導HDF細胞衰老。最近,缺乏核型營養不良聚糖(β-DG)使小鼠成肌細胞(C2C12)獲得衰老特征被證實[61]。除此之外,人們在糖尿病機制研究中也發現,通過上調血小板反應蛋白CD47依賴性信號通路可以妨礙血管生成并誘導內皮細胞衰老[62]。有報道顯示,核糖也可用來誘導構建衰老相關疾病模型[63～64]。

2.2.4 其他藥物誘導

Herbert等[44]用AngⅡ誘導hVSMC的衰老,驗證了AngⅡ通過ROS介導的DNA損傷致使hVSMC衰老的假說。Tsai等[29]則在該模型的基礎上對衰老的機制開展了進一步研究。

由于研究細胞衰老對抗腫瘤具有積極的作用,所以部分研究人員致力于抗腫瘤藥物在細胞衰老中的作用機制研究。Ota等[40]用抗腫瘤藥物誘導HUVEC細胞衰老,并發現西羅莫司和依維莫司誘發的內皮細胞衰老是Sirt1依賴性的,而紫杉醇通過Sirt1非依賴性途徑發揮作用。Demaria等[65]發現,阿霉素(doxorubicin,Doxo)等4種常用的化療藥物可以誘導正常非癌組織中衰老細胞的持續存在。Liu等[66]發現,異染色質組織在Doxo或H2O2誘導人臍帶間充質干細胞衰老的早期階段被激發。另有研究表明,免疫抑制劑及抗癌藥物雷帕霉素可以預防細胞和組織的衰老[37],由此其被視為潛在的抗衰老藥物受到進一步關注。

2.3 癌基因誘導衰老

除了復制性衰老、應激性早衰,癌基因誘導衰老也是細胞衰老的一大類型。癌基因通過調節某些基因誘導細胞衰老[67]。Paget等[36]通過敲除PKCi基因研究了其對乳腺癌細胞衰老的抑制作用。Nojima等[68]通過敲除SPT6基因誘導細胞衰老。Crochemore等[69]通過敲除Cockayne綜合征(Cockayne syndrome,CS)相關基因CSB誘導p21依賴性早衰,揭示了CSB的缺失是基于p21的復制性衰老的已知最早的觸發因素。

3 總結

復制性衰老模型不使用藥物,避免了藥物之間的相互作用,更符合真實衰老狀態。但是其缺點也很明顯,即模型制作耗時長,在實驗中會消耗更多的人力以及物力。誘導型衰老模型則相反,造模時間稍短,一般在5～8 d即可造模成功。但是其缺點也不容忽視,如誘導劑的使用對于后續的實驗可能會有未知的影響。另外,就不同誘導劑造模成功率來看,H2O2能達到一個較高的衰老率(平均80%以上),糖類較低,其他誘導劑則參差不齊。就輻射誘導而言,其對所需儀器的要求較高,且誘導方向的不確定性較大。而無論是藥物誘導還是輻射誘導或者是基因調控誘導,都會對細胞產生一種損傷性的影響。因為這種損傷造成的快速衰老現象在細胞的自然衰老過程中一般不會出現或者出現較少,所以誘導型的衰老模型和自然衰老模型可能仍然存在一定的差異。如果能夠在制作模型的時候和自然衰老模型進行實時比較,或許能校準這種可能存在的差異。

細胞衰老模型是否成功建立最終還要依靠檢測指標證實。檢測指標的選擇不僅限于衰老標志物,還和所選用的細胞類型、誘導劑的種類以及實驗最終的研究目的有關。選擇適當的模型和檢測指標,是正確分析和評價實驗結果的前提。對衰老檢測指標和細胞模型的研究將進一步為相關的科學研究提供材料和基礎數據。

致謝:十分感謝實驗室的係夢琪師姐給予文字部分的指導并且協助完成論文修改工作。