冬瓜抗氧化基因的克隆及其在非生物脅迫下的表達分析

錢玉磊，閆晉強，楊松光，劉文睿，謝大森，吳智明，江 彪

（1.仲愷農業工程學院園藝園林學院，廣東 廣州 510225；2.廣東省農業科學院蔬菜研究所/廣東省蔬菜新技術研究重點實驗室，廣東 廣州 510640）

【研究意義】冬瓜（Benincasa hispida Cogn.）是葫蘆科冬瓜屬一年生蔓生草本植物，富含多種維生素和膳食纖維，是典型的高鉀低鈉蔬菜，兼具藥用和保健功效［1-2］。冬瓜耐儲運、貨架期長，在調節蔬菜淡季、保證周年供應中發揮著重要作用［3-4］。抗氧化（Oxidation Resistance，OXR）基因廣泛存在于真核細胞中，是一類能有效降低細胞中多余活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）的基因［5］。研究表明，OXR基因在植物抵抗逆境脅迫過程中發揮著重要作用［6-7］，因此開展冬瓜BhiOXR基因的克隆及其在非生物脅迫下的表達特征分析，對該基因的功能研究具有重要意義。【前人研究進展】OXR基因最早在動物中發現，其C 端含有TLDc〔TBC（Tre2/Bub2/Cdc16）、LysM（Lysine motif）、Domain catalytic〕保守結構域，具有重要的抗氧化作用［5］。自2019 年在模式植物擬南芥中鑒定出6 個OXR基因家族成員以來［6］，相繼在向日葵［7］、十字花科植物［8］和小麥［9］等多種植物的全基因組范圍內鑒定出OXR家族成員。擬南芥AtOXR2是一種線粒體蛋白，能夠減輕酵母oxr1突變體氧化應激的敏感性，也可通過影響體內的活性氧水平提高過表達AtOXR2擬南芥的光合作用效率和對環境脅迫的耐受性，促進植株生長，從而提高植株整體的生物量和種子產量［6］。此外，研究發現，過表達AtOXR2也可通過影響轉基因擬南芥體內水楊酸代謝來增強植株的抗病性［10］；擬南芥和玉米中異源過表達向日葵HaOXR2，可增強植株非生物氧化應激脅迫的耐受性［7］。李寒等［9］研究發現，小麥TaOXR1.6A和TaOXR2.5D在一定程度上響應氧化脅迫，可通過調控水楊酸途徑來增強植株的免疫力。【本研究切入點】2019 年11 月，本課題組發表了第一張冬瓜高質量基因組圖譜［11］，這為基于全基因組鑒定、克隆和分析冬瓜BhiOXR基因奠定了基礎，已有研究表明OXR基因在響應逆境脅迫過程中發揮重要作用，然而截至目前仍未有冬瓜BhiOXR基因在非生物脅迫響應方面的相關研究報道。【擬解決的關鍵問題】本研究以冬瓜高代自交系B227（參考基因組測序所用材料）的幼苗為試驗材料，克隆冬瓜6 個BhiOXR基因，并分析其響應4 種非生物脅迫處理（低溫、高溫、鹽和干旱）的表達特征，以期為深入研究冬瓜BhiOXR基因的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理

本研究所用材料為冬瓜高代自交系B227，由廣東省農業科學院蔬菜研究所提供，于2020年7 月播種在培養缽中，置于廣東省農業科學院蔬菜研究所溫室進行培養。待幼苗長至兩葉一心期，分別將長勢一致的冬瓜幼苗置于4℃和40℃培養箱（16 h 光照、8 h 黑暗）進行低溫和高溫處理，利用150 mmol/L NaCl 溶液模擬鹽脅迫、10%PEG6000 溶液模擬干旱脅迫，每個處理5 次重復。分別取未處理植株、不同脅迫處理后4、8、12 和24 h 植株的適量葉片，放置于液氮中速凍，帶回實驗室后置于-80℃超低溫冰箱中保存備用。

1.2 冬瓜BhiOXR 基因家族成員鑒定及克隆

以擬南芥6 個AtOXR基因家族成員的蛋白質序列為種子文件，通過hmmsearch 和BLASTP搜索獲得冬瓜BhiOXR基因，并利用MEGA11 對冬瓜BhiOXR基因進行系統進化分析。分別利用EasyPure?RNA Kit 試劑盒（TransGen 公 司）和FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix 試劑盒（TIANGEN 公司）提取冬瓜葉片總RNA 和反轉錄成cDNA。

根據冬瓜基因組數據庫中BhiOXR基因的CDS 序列，在ORF 兩端設計全長引物（表1），利用RT-PCR 技術擴增BhiOXR基因的CDS 全長。反應體系為：25 μL Primer STAR Max DNA Polymerase，上、下引物（10 μmol/L）各1 μL，1 μ L cDNA（10 ng/μL），22 μL ddH2O。反應程序為：98℃預變性3 min；98℃變性10 s、56℃退火30 s、72℃延伸30 s；72℃終延伸5 min，35 個循環。PCR 產物采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并將目的片段回收測序。

表1 BhiOXR 基因克隆引物信息Table 1 Information of primers used for BhiOXR gene cloning

1.3 冬瓜BhiOXR 基因的生物信息學分析

根據基因的位置信息，利用MG2C（http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.1/）將其定位到相應的染色體上。提取每個BhiOXR基因起始密碼子前2 500 bp 序列，在PlantCare 網站（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）獲得順式作用元件信息；提取冬瓜BhiOXR基因蛋白質序列，提交植物蛋白亞細胞定位預測網站（Plant-mPLoc，http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）預測其編碼的蛋白質在細胞中的具體位置［12］；利用在 線SOPMA 工具（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）預測BhiOXR 蛋白含有的二級結構［13］；利用SWISSMODEL 在線軟件預測冬瓜BhiOXR基因的蛋白三級結構［14］。

1.4 冬瓜BhiOXR 基因在非生物脅迫下的表達分析

在NCBI Primer-Blast 上設計6 個BhiOXR基因和內參基因BhiUBQ的特異性qRT-PCR 引物（表2），引物由廣州生工生物工程有限公司合成。提取不同非生物脅迫處理樣品的總RNA、反轉錄成cDNA（方法參考材料與方法1.2），qRTPCR 使用TransStart?Green qPCR SuperMix 試劑盒（TransGen 公司）在CFX ConnectTM實時熒光定量儀器〔BIO-RAD（美國）公司〕上進行反應。反應體系為：5 μL 2 × TransStart?Green qPCR SuperMix，上、下向引物（10 μmol/L）各0.5 μL，2 μL cDNA（10 ng/μL），2 μL ddH2O。反應程序為：94℃預變性30 s；94℃變性5 s、55℃退火15 s、72℃延伸10 s，40 個循環，每個反應3 個技術重復。

表2 qRT-PCR 引物信息Table 2 Information of primers used for qRT-PCR

以冬瓜BhiUBQ作為內參對照，每個BhiOXR基因處理0 h 的Ct 值為基準，采用2-??Ct方法計算冬瓜BhiOXR基因在4種非生物脅迫處理后4、8、12、24 h 后的相對表達量，并采用LSD檢驗方法分析差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 冬瓜BhiOXR 基因的鑒定及克隆

以擬南芥AtOXR基因為種子序列，在冬瓜基因組數據庫中共鑒定得到6 個冬瓜BhiOXR基因。系統進化分析可將6 個基因分為5 個亞族（OXR1～OXR5），其中OXR2亞族有2 個成員、其余亞族僅有1 個成員。因此，將冬瓜6 個BhiOXR基因分別命名為BhiOXR1、BhiOXR2a、BhiOXR2b、BhiOXR3、BhiOXR4、BhiOXR5。根據BhiOXR基因的CDS 序列設計全長引物，以冬瓜自交系B227 的葉片cDNA 為模板，利用RT-PCR 進行擴增，成功克隆獲得BhiOXR2a、BhiOXR3、BhiOXR4和BhiOXR5等4 個基因的全長CDS（圖1），且克隆產物經測序與冬瓜基因組數據庫CDS 序列一致。經嘗試采用不同DNA 聚合酶和擴增條件仍無法克隆BhiOXR1和BhiOXR2b的全長CDS 后，利用新的反向引物克隆獲得截短CDS 片段（圖1）。

圖1 6 個冬瓜BhiOXR 基因的擴增結果Fig.1 Amplification results of six BhiOXR genes in wax gourd

2.2 冬瓜BhiOXR 基因的生物信息學分析

對克隆獲得的BhiOXR基因進行同源性分析發現，各個亞族內BhiOXR基因和AtOXR基因同源性較高（圖2）。6 個冬瓜BhiOXR基因的CDS序列長度變化范圍為777～1 620 bp，編碼的氨基酸數量最多有539 個（BhiOXR5），最少僅258個（BhiOXR4）。染色體定位結果（表3）顯示，冬瓜BhiOXR基因不均勻分布于4 條染色體，其中1、9、12 號染色體各有1 個成員，11 號染色體有3 個成員。亞細胞定位預測表明BhiOXR1、BhiOXR2a和BhiOXR2b的編碼產物位于細胞核，BhiOXR3和BhiOXR5的編碼產物位于葉綠體，而BhiOXR4的編碼產物存在于多個細胞器中。

圖2 冬瓜BhiOXR 基因與擬南芥AtOXR 基因的同源性分析Fig.2 Homology analysis of BhiOXR genes from wax gourd and AtOXR gene from Arabidopsis

表3 冬瓜BhiOXR 基因家族理化性質分析及亞細胞定位預測Table 3 Physicochemical properties and subcellular localization prediction of BhiOXR gene family in wax gourd

蛋白質二級結構預測結果（表4）表明，BhiOXR所編碼蛋白質的二級結構主要由4 種結構組成：無規則卷曲（構成無規則卷曲的氨基酸個數占總氨基酸個數的57.69%～43.04%）、α-螺旋（34.32%～21.00%）、延伸鏈（13.37%～25.19%）和

表4 冬瓜BhiOXR 蛋白二級結構預測Table 4 Prediction of secondary structure of BhiOXR proteins in wax gourd

β-轉角（2.19%～9.30%）。蛋白質三級結構預測結果（圖3）顯示，6 個BhiOXR基因之間的三級結構具有高度相似性，暗示其可能具有相似的生物學功能。

圖3 冬瓜BhiOXR 蛋白三級結構預測Fig.3 Prediction of tertiary structure of BhiOXR proteins in wax gourd

順式作用元件分析結果表明，冬瓜BhiOXR基因的啟動子區域含有多種抗逆元件，如參與低溫響應的LTR、參與防御和應激反應的TC-rich repeats、參與厭氧誘導的ARE 等順式作用元件，暗示它們可能參與非生物脅迫響應。

2.3 冬瓜BhiOXR 基因在非生物脅迫下的表達分析

為明確6 個冬瓜BhiOXR基因在非生物脅迫下的表達特征，利用qRT-PCR 研究其在低溫（4 ℃）、高溫（40 ℃）、鹽脅迫（150 mmol/L NaCl）和干旱（10%PEG6000）等非生物脅迫下的表達特征。

2.3.1 低溫脅迫BhiOXR2a在低溫處理后表達量明顯降低，而BhiOXR1、BhiOXR2b、BhiOXR4和BhiOXR5均呈現先顯著升高、隨后下降的趨勢。BhiOXR3在處理后4 h 表達量輕微升高，12 h 和24 h 表達量顯著降低（圖4）。

圖4 冬瓜BhiOXR 家族成員在低溫脅迫下的表達分析Fig.4 Expression analysis of wax gourd BhiOXR family members under low temperature stress

2.3.2 高溫脅迫 圖5 顯示，高溫處理后，BhiOXR2a、BhiOXR2b和BhiOXR4的表達量有波動，但均未顯著升高或降低；BhiOXR1、BhiOXR3和BhiOXR5的表達量均顯著升高，并分別在24、12 和12 h 達到峰值。

圖5 冬瓜BhiOXR 家族成員在高溫脅迫下的表達分析Fig.5 Expression analysis of wax gourd BhiOXR family members under high temperature stress

2.3.3 鹽脅迫 鹽處理后，BhiOXR2a和BhiOXR4的表達量顯著降低；BhiOXR2b的表達量在鹽處理后4 h 升高并達到峰值，隨后恢復正常水平；BhiOXR3和BhiOXR5在鹽處理后表達量有所下降，但降幅不大；BhiOXR1的表達量在鹽處理前后沒有發生顯著變化（圖6）。

圖6 冬瓜BhiOXR 家族成員在鹽脅迫下的表達分析Fig.6 Expression analysis of wax gourd BhiOXR family members under salt stress

2.3.4 干旱脅迫BhiOXR3的表達量在干旱處理后8 h 輕微降低，BhiOXR5的表達量在處理后4 h和8 h 也降低，但均未發生顯著降低；BhiOXR1在干旱處理前期表達無明顯變化，24 h 時表達量顯著升高；BhiOXR2a在干旱處理下表達量先下降（12 h 時達到最低），然后又急劇升高，24 h 時達到峰值；BhiOXR2b的表達量在受到干旱脅迫后有所升高；BhiOXR4的表達量有所下降，處理后12 h 達到谷值（圖7）。

圖7 冬瓜BhiOXR 家族成員在干旱脅迫下的表達分析Fig.7 Expression analysis of wax gourd BhiOXR family members under drought stress

3 討論

非生物脅迫會影響植物的生長和發育，最終會導致產量減少和品質下降［13］。處于非生物脅迫下的植物，細胞內會產生過量的活性氧（ROS）［14］，這些ROS 將破壞蛋白質、脂質和DNA 等生物大分子物質，從而導致細胞損傷甚至死亡［15-17］。前人研究表明，OXR基因可以影響氧自由基清除基因的表達，降低細胞中的ROS水平，從而減少ROS 對細胞的損傷［5］。通過對冬瓜OXR基因的全基因組鑒定，我們獲得6 個OXR成員，根據與擬南芥OXR基因的系統發育樹，可將其分為OXR1～OXR5等5 個亞族，其中OXR2亞族有2 個成員、其余亞族均有1 個成員；擬南芥OXR有6 個成員，OXR3亞族有2 個成員，其余亞族都僅有1 個成員［6］；菊科植物向日葵也有6 個OXR成員，其中OXR1亞族有2 個成員，其余亞族都有1 個成員［7］。張夢云等［8］通過對7 種十字花科植物的OXR基因進行全基因組鑒定，發現十字花科7 種物種中的OXR基因家族成員的數量為5～11 個，且位于OXR1～OXR5亞族的成員數量不一致；單子葉植物小麥有15 個OXR成員，可分為Ⅰ～Ⅳ組，Ⅰ組有6 個成員，Ⅱ組、Ⅲ組和Ⅳ組分別有3 個成員［9］。說明OXR家族成員的個數以及不同OXR亞族成員的個數也會因物種特異性而產生差異。

基因表達趨勢通常可以反映其相應功能［18-19］。Zhang 等［20］通過對西瓜和甜瓜超氧化物歧化酶（SOD）基因家族的全基因組鑒定及其在脅迫下的表達模式分析，發現大多數CmSOD和ClSOD基因在低溫、NaCl 和PEG6000 下表達明顯上調，表明它們可能在應答脅迫時發揮重要作用。C2H2 鋅指蛋白家族（C2H2-ZFP）在植物的生長發育和非生物脅迫響應中起著重要作用，Chen 等［21］從黃瓜基因組中共鑒定出101 個C2H2鋅指蛋白家族成員，通過qRT-PCR 分析了16 個C2H2-ZFP基因在低溫、干旱、鹽和脫落酸（ABA）脅迫下的表達特征，表明C2H2-ZFP基因可能參與不同的信號通路。為揭示小麥TaOXR基因在非生物脅迫〔NaCl、甘露醇（Mannitol）、SA、H2O2〕中的潛在功能，李寒等［9］使用qRT-PCR分析TaOXR1.6A和TaOXR2.5D的表達水平，結果顯示兩者均能響應氧化脅迫。

因此，為了解冬瓜BhiOXR基因在非生物脅迫應答過程中的重要作用，本研究利用qRTPCR 技術分析BhiOXR基因在4 種非生物脅迫（低溫、高溫、鹽和干旱）下的表達特征，結果表明6 個BhiOXR基因均能響應特定的非生物脅迫，推測BhiOXR基因可能在抵抗非生物脅迫過程中發揮重要作用。然而，不同的BhiOXR基因響應的非生物脅迫有異同，如BhiOXR1響應低溫、高溫和干旱脅迫，不響應鹽脅迫；BhiOXR2a、BhiOXR2b和BhiOXR4響應低溫、鹽和干旱脅迫，不響應高溫脅迫；BhiOXR3和BhiOXR5響應低溫、高溫和鹽脅迫，不響應干旱脅迫，這可能與基因的功能特性有關。

4 結論

通過全基因組鑒定、克隆獲得6 個冬瓜OXR基因家族成員，并對這些成員的物理化學性質、系統發育、染色體定位、啟動子、亞細胞定位以及蛋白質二級結構和三級結構等進行生物信息學分析。通過qRT-PCR 分析其響應低溫、高溫、鹽脅迫和干旱等非生物脅迫的表達特征，發現冬瓜BhiOXR基因受低溫、高溫、鹽和干旱等非生物脅迫誘導表達，并且不同的BhiOXR基因響應的非生物脅迫有異同，由此推測6 個BhiOXR成員可能在抵御不同非生物脅迫過程中所表現的抗氧化作用不盡相同。本研究結果為進一步探究冬瓜BhiOXR基因的生物學功能奠定了基礎，對開展冬瓜分子育種有一定的參考作用。