探討MiR-181a、TGFβR2對食管癌細胞ECA109的影響*

李雨蔚，徐潤，侯維，蹇順海，陳筱莉，何欣蓉

1.川北醫學院附屬醫院病理科，四川南充 637000；2.川北醫學院病理教研室，四川南充 637000；3.成都市第二人民醫院，四川成都 610011

食管癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，我國90%的病例為食管鱗狀細胞癌，由于食管癌起病隱匿，80%以上患者確診時已進入中晚期，因此食管癌患者總體生存時間較短，5年生存率低，嚴重影響人類的健康。TGF-β/Smad信號通路參與許多病理過程，在腫瘤中發揮著特別廣泛的作用［1-2］。因此調節TGF-β途徑對食管癌患者具有重要意義，TGF-β有三種亞型（TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3）和三種相應的TGF-β受體（TGF-βR1、TGF-βR2和TGF-βR3）。前兩種受體具有激酶活性，磷酸化并激活TGF-β/Smads途徑下游，而TGF-βR3沒有激酶活性。在TGF-β信號轉導中，TGF-β依次與TGF-βR2和TGF-βR1結合，形成異基因復合物。因此，TGFβR2與TGF-β結合，發揮關鍵作用，啟動信號轉導，在多種腫瘤中發現TGFβR2信號異常，影響腫瘤的生物學特性和患者的生存。微小RNA(miRNA)是TGFβR2功能最重要的調節因子之一［3］。miR-181家族，包括miR-181a、miR-181b、miR-181c和miR-181d，是最早在造血細胞中特異表達的miRNA之一。人類miR-181a和miR-181b基因聚集在一起，位于1號染色體(miR-181a-1和miR-181b-1)和9號染色體(miR-181a-2和miR-181b-2)上，研究發現miR-181a在口腔鱗狀細胞癌、高級別軟骨肉瘤、乳腺癌、胃癌、食管癌等癌中表達均異常［3-8］。利用生物信息學數據庫miRBase預測miR-181a的靶基因，其中包括TGFβR2，并且已有學者在胃癌中采用雙熒光素酶報告實驗檢測發現，TGFβR2為miR-181a的靶基因，但在食管癌中miR-181a與TGFβR2的機制目前尚不清楚，本研究將檢測與分析miR-181a、TGFβR2在食管鱗狀細胞癌ECA109中的表達及其對細胞增殖的影響，并初步探討可能的機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

DMEM/HIGH GLUCOSE培養基購自美國HyClone公司。新生牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司。青霉素—鏈霉素溶液購自武漢博士德生物工程有限公司。0.25%胰酶購自美國Gibco。增強型CCK-8試劑盒購自江蘇碧云天生物技有限公司、組織/細胞RNA快速提取試劑盒購自艾德萊生物。All-in-OneTM miRNA qRT-PCR DetectionKit購自GeneCopoeia。mRNA逆轉錄試劑盒購自Thermo Scientific。Bestar SybrGreen qPCR mastermix購自DBI Bioscieno； RT-PCR引物、 miR-181a mimics、 mimics NC、miR-181a inhibitor、inhibitor NC由生工生物工程（上海）股份有限公司設計。二氧化碳培養箱（美國Thermo Forma Scientific公司）、全波長酶標儀（Thermo）、熒光定量PCR儀（德國Bio.Rad公司）、倒置顯微鏡（德國Leica）。

1.2 細胞來源和培養

人正常食管上皮細胞株HEEC和人食管鱗癌細胞株ECA-109來源于川北醫學院分子生物學研究所。HEEC、ECA109均為貼壁細胞，培養于含體積分數10%新生牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的DMEM/HIGH GLUCOSE完全培養基中，在37℃、5%CO2培養箱中培養。

1.3 細胞轉染和分組

按5×105個/孔的細胞密度將ECA109接種于六孔板中培養過夜，待細胞密度達40%～50%，按照Lipo6000TM試劑說明書進行轉染。分為五組：blank control組、miR-181a mimics轉染組、 mimic NC陰性對照組、miR-181a inhibitor轉染組、inhibitor NC陰性對照組。轉染6 h后用新鮮的完全培養基替換原培養基繼續培養48 h。

1.4 CCK8法檢測

按每孔8×103個細胞接種于96孔板，每個樣本重復5個復孔，于0、12 h、24 h、48 h各時間點每孔加入10μL的增強型CCK-8試劑，用加了完全培養基和10μL的增強型CCK-8試劑但沒有加入細胞的孔作為空白對照，繼續培養2 h后，在450 nm波長處用酶標儀測定吸光度值。

1.5 qRT-PCR

總RNA的提取使用組織/細胞RNA快速提取試劑盒提取空白對照組及轉染后ECA109中的總RNA，檢測RNA的純度及濃度后于-80℃保存（OD260/OD280比值在2.0～2.2之間）。逆轉錄及qRT-PCR檢測miR-181a、TGFβR2mRNA、Smad2mRNA的表達量使用All-in-OneTM miRNA qRT-PCR Detection Kit試劑盒、Thermo Scientific的mRNA逆轉錄試劑盒將細胞中提取的RNA逆轉錄成cDNA，反應條件分別為為37℃60 min、85℃5 min，65℃5 min、25℃5 min、42℃60 min、70℃5 min。將得到的cDNA稀釋后，按照All-in-OneTM miRNA qRT-PCR Detection Kit試劑盒、Bestar SybrGreen qPCR mastermix說明書分別進行熒光定量PCR，反應條件分別為95℃10 min，1個循環；95℃10sec、60℃20sec、72℃10sec，40個循環和95℃2 min，1個循環；95℃10sec、55℃30sec、72℃30sec，40個循環，以U6和GAPDH作為內參，miR-181a、TGFβR2mRNA表達量用表示。miR-181a正向引物序列5'-GCGGTAACATTCAACGCTGTCG-3'，反向引物序列5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'；TGFβR2正向引物序列 5'-GTGGCTGTATGGAGAAAGAATG-3'，反向引物序列5'-CAAGTCAGGATTGCTGGTGTT-3'；U6正向引物序列5'-CGCTTCGGCAGCACATATA-3'，反向引物序列5'-TTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'；GAPDH 正向引物序列 5'-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3'，反向引物序列5'-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3'。

1.6 Western Blot

分別收集轉染4 d后的各組細胞于離心管中，PMSF裂解提取蛋白，采用Bradford蛋白定量試劑盒測蛋白的濃度，每孔取12μL蛋白質行SDS-PAGE電泳（80 min 100 V），轉膜（80 min 0.2 A），5%脫脂牛奶封閉3 h，加入RabbitAnti-TGFβR2（1：300稀釋），4℃過夜后加入二抗羊抗兔IgG（1：5 000稀釋），室溫孵育1 h，采用特超敏ECL化學發光試劑盒顯影，以GAPDH作為內參，采用Image J軟件分析目的蛋白和內參的光密度值，以目的蛋白和內參的光密度值的比值表示目的蛋白的相對表達水平。

1.7 統計學方法

采用SPSS 23.0軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗。計數資料以例數和百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CCK8法檢測

采用CCK8法檢測ECA109細胞中各組在0 h、12 h、24 h、48 h的增殖情況。如表1展示了各組在0 h、12 h、24 h、48 h時的吸光度值，以s表示。圖1顯示，miR-181a mimics組與空白對照組、mimic NC組相比，在12 h、24 h、48 h吸光度值升高，差異有統計學意義（P＜0.05），空白對照組與mimic NC組之間無明顯差異。miR-181a inhibitor組與空白對照組、inhibitor NC組相比，在12 h、24 h、48 h吸光度值降低，差異有統計學意義（P＜0.05），空白對照組與inhibitor NC組之間無明顯差異。

圖1 CCK8法檢測ECA109五組細胞的增殖水平

表1 轉染后ECA109五組細胞增殖能力的比較(±s)

表1 轉染后ECA109五組細胞增殖能力的比較(±s)

組別0 h0.488 4±0.047 30.488 7±0.031 80.496 6±0.009 40.488 9±0.025 20.488 9±0.022 00.0560.994 12 h0.942 1±0.016 51.072 2±0.026 20.892 1±0.017 10.742 7±0.026 30.953 9±0.026 2108.5200 24 h1.198 5±0.068 91.483 2±0.051 21.121 9±0.055 10.962 5±0.026 51.214 4±0.023 061.3360 48 h1.635 3±0.058 12.124 3±0.050 51.604 6±0.021 51.384 5±0.048 41.621 9±0.088 689.2130 Blank control MiR-181a mimics Mimic NC MiR-181a Inhibitor Inhibitor NC F值P值

2.2 miR-181a在HEEC、ECA109細胞中的表達情況

如圖2所示，qRT-PCR檢測結果顯示，人正常食管上皮細胞株HEEC，人食管鱗癌細胞株ECA109中miR-181a的表達水平分別為（1.005±0.124）、（3.454±0.197），食管鱗癌細胞株中miR-181a的表達量明顯高于人正常食管上皮細胞株的表達量，差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖2 miR-181a在HEEC、ECA109細胞株中的表達情況

2.3 miR-181a在各轉染組中的表達情況

如圖3a所示，qRT-PCR檢測結果顯示，ECA109細胞miR-181a mimics轉染組miR-181a的表達水平（33.525 3±1.089 7）明顯高于空白對照組（1.020 4±0.251 5）、mimic NC組（0.855 9±0.093 0），差異有統計學意義（P＜0.001）；圖3b所示，qRT-PCR檢測結果顯示，ECA109細胞miR-181a inhibitor轉染組miR-181a的表達水平（0.022 1±0.007 6）明顯低于空白對照組（1.020 4±0.251 5）、inhibitor NC組（0.955 9±0.309 9），差異有統計學意義（P＜0.001）。

圖3b qRT-PCR檢測miR-181a inhibitor轉染后miR-181a表達

圖3a qRT-PCR檢測miR-181a mimics轉染后miR-181a表達

2.4 TGFβR2在各轉染組中的表達情況

如圖4a所示，qRT-PCR檢測結果顯示，ECA109細胞miR-181a mimics轉染組TGFβR2mRNA的表達水平（0.466 5±0.037 7）明顯低于空白對照組（1.000 8±0.049 2）、mimic NC組（1.052 9±0.098 2），差異有統計學意義（P＜0.001）。圖4b所示，qRT-PCR檢測結果顯示，ECA109細胞miR-181a inhibitor轉染組TGFβR2mRNA的表達水平（1.606 7±0.062 8）明顯高于空白對照組（1.0080±0.049 2）、inhibitor NC組（1.120 7±0.104 8），差異有統計學意義（P＜0.001）。如圖5、6所示，Western Blot結果顯示miR-181a mimics轉染組TGFβR2蛋白表達水平較陰性對照組明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.01）。miR-181a inhibitor轉染組TGFβR2蛋白表達水平較陰性對照組升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖4b WB檢測miR-181amimics轉染后TGFβR2蛋白表達

圖4a qRT-PCR檢測miR-181ainhibitor轉染后GFβR2mRNA表達

3 討論

圖5a WB檢測miR-181amimics轉染后TGFβR2蛋白表達

圖5b WB檢測miR-181a inhibitor轉染后TGFβR2蛋白表達

圖6a mimics轉染組與NC組TGFβR2蛋白相對表達量

圖6b inhibitor轉染組與NC組TGFβR2蛋白相對表達量

食管癌是常見的消化道腫瘤之一，在我國癌癥死亡原因中排名第四［9］。盡管有包括手術干預、化療和同時放化療在內的多模式治療［10］，但治療效果仍不佳。因此，為了提高晚期食管癌患者的生存率，迫切需要在早期診斷和治療方面取得進展。在TGF-β信號轉導途徑中，最重要的受體是TGFβR2，它與TGF-β結合并激活TGF-β信號級聯，miRNA是TGFβR2最重要的翻譯后調節因子之一。在本研究中采用qRT-PCR檢測miR-181a在食管癌細胞ECA109中的表達情況，結果發現miR-181a在食管癌細胞中的表達水平明顯高于正常食管上皮細胞。為了進一步研究miR-181a與TGFβR2的關系，本研究將miR-181a mimics、miR-181a inhibitor轉染入食管癌細胞ECA109，發現miR-181a mimics組食管癌細胞的增殖能力增強，miR-181a inhibitor增殖能力降低。并通過qRT-PCR、Western Blot檢測發現 miR-181a mimics轉染組TGFβR2mRNA及其蛋白的表達水平較對照組均明顯降低。miR-181a inhibitor轉染組TGFβR2mRNA及其蛋白的表達水平較對照組均明顯升高。以上結果表明miR-181a在食管癌的發生發展過程中扮演癌基因的作用，并通過影響TGFβR2來促進食管癌細胞的增殖能力。但本研究也存在以下不足之處：首先，本研究未研究TGFβR2表達量的改變是否會影響miR-181a的表達水平。其次，本研究僅在體外實驗證實這一現象，今后需要收集更多臨床樣本，進行體內實驗以完善實驗數據，并深入探討食管癌中miR-181a、TGFβR2之間的調控機制。