黃芩苷元鼻噴霧劑對豚鼠變應性鼻炎的療效觀察*

彭寶紅

三亞市康復療養中心耳鼻咽喉科，海南三亞 572000

變應性鼻炎（AR）是一種機體接觸變應原后由免疫球蛋白E（IgE）介導的鼻黏膜非感染性慢性炎癥性疾病，典型臨床表現為陣發性噴嚏、清水樣涕、鼻塞、鼻癢等，伴有眼癢、結膜充血等不適［1］。據統計，全球約有40%的人口深受AR影響，AR極易演變為過敏性哮喘，后者是嚴重影響生命健康的慢性呼吸道疾病之一。

臨床治療AR的藥物有糖皮質激素類、抗組胺類、抗白三烯類等［2］，其中抗組胺類藥物如氯雷他定等具有良好的安全性，目前運用廣泛。但是也存在易嗜睡、咽部刺激征和鼻干等諸多不良反應，以及耐藥和藥物依賴等問題。我國傳統中藥藥方如補中益氣湯、玉屏風散和蒼耳子散等，在治療AR以及過敏性哮喘方面具有良好的臨床療效。通過前期分析研究發現，上述中藥方劑的共同特點是具有黃芩這一成分，提示黃芩可能在抑制上呼吸道過敏反應過程中發揮了重要作用。黃芩苷元（Baicalein）是從黃芩根中提取的黃酮類化合物，是中藥黃芩的主要活性成分［3］。黃芩苷元能夠穩定肥大細胞、抑制組胺和花生四烯酸，白三烯和前列腺素E生成及釋放、減輕血管擴張以及降低血管通透性等，具有良好的抗過敏作用［4］。桉葉油是樟科植物等葉子脛骨水蒸氣蒸餾得到的揮發油，其主要成分桉葉素具有殺菌、抑菌消炎等作用，同時也可以作為一種脂溶性溶液，用于鼻咽喉疾病的霧化治療［5］。本科室在前期研究的基礎上，利用桉葉油和黃芩苷元，加入適量的保濕劑和防腐劑制成鼻噴霧劑。本實驗通過建立AR豚鼠模型，觀察黃芩苷元鼻噴霧劑對AR豚鼠鼻部行為學癥狀、血清炎癥細胞因子以及免疫球蛋白的影響，為黃芩苷元治療AR提供動物實驗依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

試劑：卵清蛋白（OVA，美國Sigma公司，V級）。0.9%生理鹽水（四川科倫藥業股份有限公司）。儀器：超聲霧化器（江蘇魚躍醫療設備股份有限公司，型號：402AI），恒溫循環水浴槽(上海庚庚儀器設備有限公司，型號：DC0506)，監控攝像頭（360科技有限公司，1080P智能攝像機）。黃芩苷元（江蘇艾康生物醫藥研發有限公司，貨號152089），一次性使用靜脈血樣采集器(綠色-肝素管，康德萊)，一次性使用采血針（康德萊），眼科手術剪（六六眼科醫療器械有限公司），2.5 mL注射器（康德萊），消毒用碘伏（海氏海諾），外科用無菌敷料（海氏海諾）。IL-4酶聯免疫分析(ELISA)試劑盒(上海碧云天生物制劑有限公司），離心機（LD5-2A，上海離心機廠）。

1.2 動物和分組

SPF級成年Hartley豚鼠40只，雌雄各半，體質量（350±50）g，購于海南醫學院實驗動物中心（生產許可證號：SCXK瓊2013-0009）。動物飼養于空調房（室溫20℃～26℃），可自由攝食及攝水，定時定量供應新鮮潔凈綠葉蔬菜，早晚12 h間斷照明。所有豚鼠均利用改良的AR模型方法復制成功，隨后將實驗豚鼠分為模型組（0 mL），低劑量組（0.2 mL/min），中劑量組（0.5 mL/min）和高劑量組（1 mL/min），每組各10只。

1.3 建模方法和流程

OVA約30 mg加入0.9%生理鹽水100 mL制成溶液，1 mL/只腹腔注射，隔日一次，持續一周作基礎致敏。間隔5 d后，將豚鼠移至半封閉透明塑料盒（10 cm×5 cm×5 cm大小）中，覆以開洞（洞口面積剛好能夠放下霧化器吸管）的潔凈塑料透明蓋板，1%OVA生理鹽水溶液10 mL從開洞處霧化吸入5 min，每日1次，連續7 d，末次霧化完成1 h后，將豚鼠雙足置于0℃～4℃恒溫循環水浴槽中激發1 min，至此AR模型完成。隨后豚鼠正常條件飼養，除模型組不予霧化處理，其余各組豚鼠按照不同劑量的黃芩苷元桉葉油鼻噴霧劑，超聲霧化吸入10 min，每日2次，連續2周。

2 檢測指標

2.1 酶聯免疫吸附試驗

末次給藥1 h后，將豚鼠及采血管做好標記后，用10%水合氯醛麻醉，抓緊豚鼠頸部皮膚，固定好豚鼠頭部，消毒其眼眶后邊緣1～1.5 cm區域，并輕輕向下壓迫頸部兩側，使眼球充血、外突，用一次性使用的采血針針頭頂端，垂直插入內眥靜脈叢，另一端接采血管承接靜脈血，見血液連續滴入采血管中，當達到所需血量時退出采集針，立即用無菌敷料壓迫數秒止血。采集的血液推入離心管靜置3 h后，4℃3 000 r/min離心10 min，分裝后均于-20℃冰箱中冷凍保存，嚴格按照ELISA試劑盒說明書檢測豚鼠血清中IL-4含量，該步驟重復3次取平均值。

2.2 行為學觀察和評分

各組豚鼠在分籠飼養期間，每籠各安裝1臺監控攝像頭，每日24 h持續錄制，以每次給藥后2 h為主要觀察時段，對豚鼠的攝食、攝水、排便和精神活動狀態以及過敏反應進行評分。方法如下。鼻癢：輕度為1分，輕擦鼻幾次；重度為2分，抓搔鼻、面不止，到處擦磨。噴嚏：1～3個記1分，4～10個記2分，l0個以上記3分。清涕：流至前鼻孔記1分，過前鼻孔記2分，流涕滿面記3分。哮喘：呼吸急促計1分，明顯喘息計2分，喘息致死計3分。于最后一次霧化吸入黃芩苷元制劑鼻噴霧劑后30 min內，觀察各組豚鼠的過敏性癥狀，將各癥狀分累積，如總分≥5分則表示造模成功。

2.3 蛋白免疫印跡

豚鼠斷頸處死后，暴露雙側鼻腔，取靠近上鼻甲的部分鼻部黏膜組織，用于蛋白免疫印跡檢查，采集IgE和內參β-actin條帶圖像，Image J軟件確定圖像中各個條帶的凈光密度，用目標條帶凈光密度與內參凈光密度比值比較各組之間蛋白表達的差異，該步驟重復3次。

2.4 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗。計數資料以例數和百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 癥狀評分

建立AR模型后無實驗動物死亡，所有豚鼠均出現鼻過敏癥狀，經鼻癥狀評分均達到AR模型標準后，各組豚鼠經黃芩苷元鼻噴霧劑干預后，低、中、高劑量組有4、2、1只動物出現過敏性鼻炎表現，末次霧化后各組豚鼠過敏癥狀評分結果如表1，各組癥狀評分之間比較，差異有統計學意義（F=4.237，P＜0.05）。黃芩苷元干預組豚鼠癥狀評分較模型組均有所下降，其中高劑量組與模型組相比，差異有統計學意義（t=8.473，P＜0.01），見表1。

表1 不同組豚鼠癥狀評分以及IL-4表達情況（±s）

表1 不同組豚鼠癥狀評分以及IL-4表達情況（±s）

檢測指標癥狀評分IL-4(pg/mL)模型組（n=10）6.50±1.31 31.26±3.69低劑量組（n=10）5.10±0.92 29.69±5.78中劑量組（n=10）4.73±0.89 24.84±4.53高劑量組（n=10）3.04±0.62 19.13±3.96

3.2 ELISA檢測血清IL-4含量

模型組和低劑量組相比，差異無統計學意義（t=1.142，P＞0.05），中劑量組與模型組比較，差異有統計學意義（t=4.258，P＜0.05），高劑量組與模型組相比，差異有統計學意義（t=8.364，P＜0.01）。

3.3 蛋白免疫印跡

本實驗考慮豚鼠比較膽小敏感，麻醉以及取樣過程中可能會引起應激反應，影響血清中IL-4表達。因此，本研究檢測了AR豚鼠鼻黏膜組織中IgE表達情況。結果發現，中、高劑量組IgE表達與模型組相比差異有統計學意義（t=7.374，8.364，P＜0.01），低劑量黃芩苷元組與模型組相比，差異有統計學意義（t=2.374，P＜0.05），見圖1。

圖1 不同組IgE表達示意圖

4 討論

AR的發病機制復雜，目前認為其主要受到遺傳、環境以及內分泌等因素影響，Th1/Th2比例失衡，大量IL-4以及過量IgE釋放，共同參與誘發AR。目前臨床治療AR的一線藥物為皮質類固醇和抗組胺藥，二線藥物包括抗白三烯藥物、抗變態反應藥物、細胞因子調節劑及炎性介質拮抗劑等［6］。黃芩苷元作為一種天然黃酮類化合物，在抑制IL-4、IL-1等炎性因子表達方面作用顯著，和γ—干擾素合用還能誘導巨噬細胞產生NO，減輕過敏反應［7］。黃芩苷元在部分抗過敏性哮喘的中藥方劑中發揮的作用，被認為可能是調節免疫功能和抗過敏的活性成分之一。豚鼠是高致敏性動物，其血清中含有大量補體，常作為AR的模型動物，本實驗使用OVA作為致敏劑，通過腹腔注射和霧化吸入方式激發AR模型［8］。

通過對豚鼠過敏性癥狀進行評分可以初步判斷建模是否成功，但既往對AR動物模型評分存在較大的主觀性，容易受到觀察時機或者觀察者水平、責任心等影響，出現遺漏和誤判。本研究選擇高清攝像系統對豚鼠鼻部癥狀進行觀察，既避免了長期觀察帶來的注意力下降，又能夠明確藥物干預對豚鼠鼻部癥狀的影響。本研究采用顧曉娜等［9］改良的AR豚鼠模型，通過霧化吸入方式給藥，有利于藥物快速吸收，便于獲取更客觀、可靠的評分和數據。

AR在病程不同階段受到輔助T細胞的影響，如Th1細胞主要介導細胞免疫應答，通過釋放IL-2來抑制Th2細胞活化，而Th2主要介導體液免疫，可產生IL-4、IL-5等炎性細胞因子來抑制Th1細胞，當Th1分化不足時，Th2細胞出現亢進現象，產生大量的IL-4并誘發IgE大量釋放。臨床上可以通過檢測IL-4水平判斷AR模型是否建立成功，通過IgE可以檢測過敏反應強度［10］。本研究中，中、高劑量組豚鼠血清中IL-4，鼻腔黏膜組織中IgE表達水平較模型組均顯著下降，表明黃芩苷元具有減輕豚鼠鼻過敏癥狀的作用，且呈現劑量—依賴效應。黃芩苷元抑制IL-4表達的作用，可能與其具備的抗炎、緩解組織炎性損傷等作用有關［11］。模型組豚鼠出現鼻腔黏膜微血管擴張，表面出現典型慢性炎癥，分泌物增加［12］，是導致鼻癢、眼癢、水樣涕、連續噴嚏和鼻塞等癥狀的組織基礎［13］，而使用黃芩苷元鼻噴霧劑干預后上述表現顯著改善。

本研究發現，黃芩苷元具有改善AR豚鼠過敏癥狀的作用，該效應可能與黃芩苷元降低血清中IL-4以及IgE表達水平有關。但AR是一種主觀性很強的慢性疾病，患者主觀體驗、心理狀態對疾病療效影響甚大。本研究對AR長期變化的研究尚少，后期有待進一步研究。