用于生物體內(nèi)甲醛可視化檢測的小分子熒光探針的研究進展

趙 予，張 濤*

（1. 華南師范大學生物光子學研究院，激光生命科學教育部重點實驗室，廣州 510631； 2. 華南師范大學生物光子學研究院，廣東省激光生命科學重點實驗室，廣州 510631）

作為活性最高的活性羰基物種（reactive carbonyl species，RCS），甲醛（formaldehyde，F(xiàn)A）具有較高的反應活性，可以與體內(nèi)的氨基、羥基、巰基等各種生物親核試劑反應，造成生物大分子（如蛋白質(zhì)和核酸）的變性或變異［1-4］。由于甲醛的致癌性和致突變性，長時間、高濃度的甲醛暴露會引發(fā)各種疾病，如阿爾茨海默病、DNA修復抑制、白血病、新生兒染色體疾病、過敏性肺炎、記憶力受損和核基因突變［2，5-9］。因此，長期以來甲醛都被認為是一種人體毒素和致癌物。世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）和美國國家環(huán)境保護局（United States Environmental Protection Agency，US EPA）［10］建議每天可耐受的甲醛攝入量分別為0.15和0.20 mg/kg。

環(huán)境中的甲醛分為自然（微生物排放、植被和腐殖質(zhì)降解、生物質(zhì)燃燒等）排放和人為（汽車尾氣、建筑材料、熏蒸、工業(yè)生產(chǎn)甲醛等）制造。而內(nèi)源性的甲醛在重要的生物代謝途徑中都有持續(xù)的產(chǎn)生，如表觀遺傳學（組蛋白/DNA去甲基化）、一碳代謝、單碳載體四氫葉酸（tetrahydrofolic acid，THF）及其一些衍生物的氧化降解［11-13］。同時體內(nèi)存在重要的乙醇脫氫酶系統(tǒng)（alcohol dehydrogenase，ADH），用于降解過量的甲醛［14-15］。細胞內(nèi)甲醛代謝始于細胞抗氧化劑谷胱甘肽（glutathione，GSH）。它與甲醛自發(fā)反應產(chǎn)生S-羥甲基-GSH，該化合物進一步被ADH氧化，從而抑制內(nèi)源性甲醛的異常積累，維持體內(nèi)甲醛濃度的穩(wěn)定。血液中甲醛的正常水平約為0.08 mmol/L，大腦中的濃度為0.20～0.40 mmol/L［16］。內(nèi)源性甲醛在許多生理過程中發(fā)揮著重要作用，如與空間記憶密切相關(guān)［17］，甚至作為一碳單位的供體可以維持一碳代謝功能缺失的細菌的存活。體內(nèi)甲醛含量的穩(wěn)定對于人體的健康具有非常重要的意義，其潛在的生理效應已越來越受到重視。破譯甲醛的生理或病理功能的一個主要挑戰(zhàn)是難以實時測量其在細胞和組織中的濃度、持續(xù)時間和位置。

檢測甲醛的方法已有比色法、氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法、紫外光譜法等。然而，這些方法通常具有靈敏度低、操作復雜、需要侵入性破壞生物組織等局限性［18］。與它們相比，有機小分子熒光探針具有靈敏度高、膜通透性好、實時原位分析、生物損傷小、操作方便等顯著優(yōu)勢，是能夠在時間和空間上實時監(jiān)測細胞內(nèi)甲醛濃度與分布的一種強大的非侵入性工具。因此，甲醛熒光探針越來越多地受到研究人員的關(guān)注，開發(fā)具有高靈敏度和高選擇性的甲醛熒光探針逐漸成為研究熱點。本文將基于反應型甲醛熒光探針的響應機理和應用方向，總結(jié)甲醛探針的發(fā)展歷程，并對甲醛探針的后續(xù)研發(fā)方向作出展望。

1 基于氨基或肼生成席夫堿（Schiff base）的甲醛探針

在早先設計和開發(fā)檢測甲醛的探針時，肼或氨基通常用作選擇性反應單元。甲醛與氨基和肼反應形成相應的亞胺（席夫堿），顯示出顯著不同的發(fā)射和吸收特性，用于甲醛的檢測。

甲醛和氨基官能團的縮合反應生成了最簡單的席夫堿（亞胺）（圖1），該縮合反應是檢測甲醛的有效方式。基于這一反應，許多用于甲醛檢測的熒光探針被設計并開發(fā)了出來。2012年，Song等［19］首次報道了一種基于席夫堿反應的甲醛選擇性檢測策略，在探針AnB中（圖2），由于苯氨基團對BODIPY骨架部分有光致電子轉(zhuǎn)移（photoinduced electron transfer，PET）熒光猝滅效應，探針AnB在535 nm處顯示出微弱的熒光。然而，隨著甲醛的逐漸添加，苯氨部分發(fā)生席夫堿反應形成亞胺化合物AnB-a，PET效應得以消除，分子AnB-a在535 nm處的發(fā)射強度逐漸增加。基于其熒光響應的甲醛檢測限為165 nmol/L，具有較高的靈敏度。

圖1 基于席夫堿反應的甲醛檢測方案Fig. 1 Formaldehyde detection scheme based on Schiff base reaction

圖2 基于氨基的甲醛探針AnBFig. 2 Amino-based formaldehyde probe AnB

為了開發(fā)具有近紅外波長（near infrared reflectance，NIR）吸收發(fā)射的甲醛探針，Ding等［20］合成了氨基半菁染料檢測食品和小鼠體內(nèi)的甲醛。探針NIR-NH2的氨基在與甲醛反應形成席夫堿后，PET效應得以開啟，探針NIR-NH2在670 nm的吸收增加，708 nm處的熒光發(fā)射減弱，對于甲醛的檢測限為1.87 μmol/L。雖然探針NIR-NH2的熒光發(fā)射為近紅外區(qū)域，但是其為響應關(guān)閉型（on-off）探針，即甲醛濃度越高熒光強度越弱，并不利于探針的實際應用。

除了利用席夫堿的PET效應外，Chen等［21］利用氨基變成亞胺后水溶性變差的特性，設計出了第一個基于聚集誘導發(fā)射（aggregation-induced emission，AIE）的甲醛探針AIE-FA（圖3），該探針對于甲醛的檢測限為40 nmol/L，響應時間約為90 s。此外，其特異性檢測內(nèi)源性和外源性甲醛的能力在活細胞中得到了證實。

圖3 甲醛探針AIE-FA成像機理［21］Fig. 3 Formaldehyde probe AIE-FA imaging mechanism［21］

Ding等［22］將PET的失活和熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）的激活過程相結(jié)合，設計出探針CmNp-CHO，用于真實食品樣品、活細胞、組織和斑馬魚中甲醛的比率檢測。最初，探針CmNp-CHO由于萘二甲酰亞胺部分PET效應開啟和萘酚FRET效應的關(guān)閉，其熒光發(fā)射主要是萘酚位于426 nm的發(fā)射峰（圖4a）。隨著該探針與甲醛的反應，萘二甲酰亞胺部分的PET效應關(guān)閉，萘酚的熒光發(fā)射FRET到萘二甲酰亞胺部分。探針在426 nm處的發(fā)射強度顯著降低，550 nm處的發(fā)射強度增加，顏色由藍色變?yōu)辄S色。因此，該探針可用于HeLa細胞中甲醛的比率成像（圖4b）。熒光強度比（I 550/I 426）與甲醛濃度在0～12.0 mmol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，甲醛檢出限為（8.3±0.3） nmol/L。

圖4 基于FRET效應的甲醛探針CmNp-CHO［22］Fig. 4 Formaldehyde probe CmNp-CHO based on FRET effect［22］

肼與氨基一樣具有強親核性，可以和甲醛反應生成腙，同樣可以用于甲醛的檢測。Chen等［23］將扭曲分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（twisted intramolecular charge transfer，TICT）機理用于甲醛的檢測，合成了探針BHA。探針BHA在與甲醛反應生成腙后，從TICT切換到分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（intramolecular charge transfer，ICT）（圖5a）狀態(tài)，探針的熒光開啟（＞900倍）。該探針對甲醛的響應速度快（＜30 min），檢測下限低（0.18 μmol/L），選擇性高，細胞毒性小。此外，探針BHA還成功實現(xiàn)了活細胞內(nèi)源性和外源性甲醛的檢測。

通過理論計算，BHA的激發(fā)態(tài)結(jié)構(gòu)為非共平面結(jié)構(gòu)，肼基團與BODIPY分子骨架之間的角度為50.97°，此時主要是無熒光的扭曲的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移過程。而與甲醛反應后，分子BHA-a的激發(fā)態(tài)結(jié)構(gòu)中該角度變?yōu)?.87°，幾乎為共平面，此時TICT過程消失，主要為ICT熒光發(fā)射過程（圖5b）。理論計算很好地解釋了即使肼比腙具有更強的供電子能力，但是BHA分子與甲醛反應后吸收波長的紅移和熒光發(fā)射強度增強這一試驗現(xiàn)象。

圖5 基于TICT效應的甲醛探針BHA［23］Fig. 5 Formaldehyde probe BHA based on the TICT effect［23］

以上基于氨基或肼的甲醛檢測探針雖然能夠?qū)崿F(xiàn)對甲醛的快速檢測，但是生物體內(nèi)含有大量的其他RCS，如乙醛、甲基乙二醛和吡哆醛等。這些活性物質(zhì)的羰基或醛基同樣能跟氨基或肼發(fā)生反應，干擾該類探針對于甲醛的特異性檢測。

為了實現(xiàn)對甲醛的特異性檢測，Liu等［24］合成了探針L，它是一種鄰苯二氨和羅丹明衍生物，用于區(qū)分和檢測甲醛、甲基乙二醛（methylglyoxal，MGO）和其他醛類物質(zhì)。探針L的檢測原理是基于探針和分析物之間的反應動力學差異，以及反應產(chǎn)物的熒光特性的差異。該探針在單波長激發(fā)下對甲醛（熒光增強）和MGO（熒光紅移和減弱）顯示出不同的響應模式，可用于活細胞中甲醛和MGO的檢測成像。

為了進一步提高苯二氨基團對于甲醛的選擇性，Cai等［25］選擇正丙基和異丙基來修飾鄰苯二氨中的氨基，以提供不同的空間位阻，用于區(qū)分甲醛和其他醛類。在試驗中，具有較大空間位阻的探針NP在成像細胞內(nèi)源性甲醛方面表現(xiàn)出了更好的特異性，驗證了通過提高空間位阻來區(qū)分甲醛和其他復雜的醛類的可能性，為后續(xù)的甲醛探針的設計提供了思路。

雖然該方式有效地提高了基于氨基檢測方式對于甲醛的選擇性，但是一氧化氮（nitric oxide，NO）仍然可以對該類探針造成非常大的干擾［26-28］，因此，提高甲醛探針的特異性仍是一個巨大的考驗。

2 基于Aza-Cope重排反應的甲醛探針

如圖6所示，烯丙基氨基團可以與甲醛發(fā)生Aza-Cope重排反應，隨后亞氨化合物水解生成醛［29］。該反應對于甲醛具有較高的選擇性，因此可用于對甲醛的特異性檢測。

圖6 基于Aza-Cope重排反應的甲醛檢測方案Fig. 6 Formaldehyde detection scheme based on Aza-Cope rearrangement reaction

基于Aza-Cope重排反應，Roth等［30］首先設計了探針FP1。該探針被4-硝基苯取代，在沒有甲醛的情況下該分子發(fā)生d-PET熒光淬滅過程，與甲醛發(fā)生反應后硝基苯部分離去，PET效應被抑制，熒光強度恢復（圖7a），在PBS緩沖溶液中甲醛的檢測限為0.01 mmol/L。另一方面，其他競爭性分析物不能導致探針的熒光強度變化，表明該探針對于甲醛具有良好的特異性。FP1探針被用于體外神經(jīng)元模型細胞Neuroscreen-1（NS1）細胞中外源性甲醛的檢測，隨著外加甲醛濃度的提高，細胞的熒光強度也顯著增加（圖7b～7e）。

圖7 基于Aza-Cope重排反應的甲醛探針FP1［30］Fig. 7 Formaldehyde probe FP1 based on Aza-Cope rearrangement reaction［30］

以上探針建立了基于化學反應的熒光方法用于監(jiān)測生物體內(nèi)甲醛的前景，但仍有重大改進的空間。一個需要解決的關(guān)鍵問題是，只有相對較少的染料骨架被報道用于甲醛檢測。因為絕大多數(shù)甲醛探針通過直接修飾染料骨架來引發(fā)熒光反應，因此，通過修改響應基團以提高染料對于甲醛的反應性和選擇性往往會同時擾亂染料的光物理性質(zhì)。這種合成上的限制限制了甲醛探針的激發(fā)/發(fā)射峰調(diào)節(jié)，不利于近紅外甲醛熒光探針的開發(fā)。

為了解決這個問題，Bruemmer等［31］基于Aza-Cope反應，開發(fā)了一種通用的響應后離去型甲醛檢測基團（圖8a），含有一個甲醛反應基團和一個通過β消除自離去的連接物，可以連接到任何含有苯酚基團的熒光團上用于甲醛的檢測。

作者將該響應基團連接在多種羥基染料上，合成了具有不同吸收和發(fā)射波長的甲醛響應探針（FAP385、FAP498、FAP555、FAP573）（圖8b），在498～585 nm范圍內(nèi)對于細胞內(nèi)甲醛實現(xiàn)了線性檢測。其對于甲醛具有較好選擇性的同時，也具有較低的檢出限，更為重要的是，該響應方式為近紅外一窗和二窗（NIR I、NIR II）的甲醛檢測探針的開發(fā)提供了可能性。該響應方式對甲醛具有高度的特異性，然而它們的反應動力學是緩慢的，檢測時間長達60～180 min，這對于檢測甲醛這種具有高反應活性和瞬時性（在生物體中的檢測半衰期約為90 s）［32］的物質(zhì)是極為不利的。因此，縮短該檢測基團的響應時間對于實時監(jiān)測生物體內(nèi)甲醛濃度具有重要意義。

圖8 基于Aza-Cope離去基團的甲醛探針［31］Fig. 8 Formaldehyde probe based on Aza-Cope leaving group［31］

為了達到這一目的，Quan等［32］合成了一種基于激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移（excited state intramolecular proton transfer，ESIPT）的比率熒光探針FormAFP。在甲醛存在時，經(jīng)過Aza-Cope重排和β消除生成烯醇式HBT-enol，通過質(zhì)子轉(zhuǎn)移生成酮式不溶性染料HBT-keto，通過烯醇-酮互變異構(gòu)實現(xiàn)對甲醛的比率傳感（圖9）。雖然甲醛檢測基團和反應途徑相同，但是相對于探針FAP系列需要180 min的響應時間，探針FormAFP在10 min內(nèi)就能響應完全，作者將這種不同的反應性歸因于響應前后探針水溶性的差異。

圖9 探針FormAFP與甲醛的反應機理［32］Fig. 9 Reaction mechanism of probe FormAFP with formaldehyde［32］

烯丙基氨在作為探針FormAFP的甲醛反應基團的同時，也作為親水性基團增加了探針FormAFP的水溶性。在甲醛的存在下，探針FormAFP的烯丙基氨離去，生成在水溶液中不溶解的產(chǎn)物HBTketo。HBT-keto是一種典型的沉淀型染料，由于分子內(nèi)的氫鍵分子，HBT-keto在水相和有機相中都具有較低的溶解度［33］。雖然該探針的有效縮短是基于Aza-Cope重排甲醛檢測方式的響應時間，但是其應用對象為基于ESIPT的沉淀染料，對于普通熒光染料并不通用。因此，該快速響應方式的通用性仍是一個巨大的挑戰(zhàn)。

3 總結(jié)與展望

熒光探針是原位和實時檢測甲醛的重要工具。越來越多的甲醛熒光探針被開發(fā)出來，用于細胞中內(nèi)源性和外源性甲醛的檢測。本文綜述了近年來甲醛熒光探針的研究進展，重點介紹了幾種主要檢測方式的發(fā)展歷程和檢測機理。

已有的甲醛熒光探針多數(shù)基于氨基、肼和雙氨基的席夫堿的生成和Aza-Cope重排等幾種經(jīng)典化學反應，同時結(jié)合PET、ICT、AIE、FRET、TICT、ESIPT等熒光開啟策略，實現(xiàn)了對于生物體內(nèi)源性和外源性甲醛的檢測。這些熒光探針分別具有特異性強、靈敏度高、響應時間短和通用性強等優(yōu)點。但是，大多甲醛探針很難同時具備上述多種優(yōu)點，各自有著明顯的缺點，如基于席夫堿反應的熒光探針其特異性和通用性具有很大的限制，基于Aza-Cope重排的熒光探針響應時間極其漫長，這些缺點都限制了這些探針在生物體內(nèi)的進一步應用。

甲醛具有高反應活性，是一種半衰期非常短的活性物質(zhì)。良好的甲醛探針應該同時具備上述特異性強、靈敏度高、響應時間短和通用性強等優(yōu)點。同時，探針的激發(fā)和發(fā)射波長越長，越有利于減少生物體自身熒光串擾和提高成像深度。因此，基于近紅外（NIR I、 NIR II）吸收和發(fā)射的甲醛熒光探針的設計和合成是今后甲醛熒光探針的主要研究目標。另外，基于化學反應的甲醛探針，在檢測甲醛的過程中會使甲醛局部濃度改變，進一步導致甲醛穩(wěn)態(tài)失衡。開發(fā)出甲醛可再生的可逆甲醛熒光探針以防止化學副產(chǎn)物的產(chǎn)生和維持檢測區(qū)域原有甲醛濃度，這對于破譯甲醛的生理學或病理學功能是非常必要的。對甲醛熒光探針機理的詳細了解可以幫助化學家開發(fā)預期的近紅外甲醛檢測探針，這將有助于突破當前甲醛熒光探針的局限性。我們希望這種對傳感機制的討論和對最新進展的總結(jié)，對于進一步設計和開發(fā)用于選擇性甲醛檢測的分析物可再生的近紅外甲醛熒光探針有所幫助。