PLA2G7基因在宮頸癌中的表達及與臨床預后 和免疫浸潤的關系

王小燕，李虎玲，張 晶，王 凱

（新疆醫科大學 a. 公共衛生學院；b. 醫學工程技術學院，烏魯木齊 830017）

宮頸癌（cervical cancer，CC）作為最常見的女性惡性腫瘤之一，是女性癌癥死亡的第四大原因，2020年全世界約有60.4萬新發病例和34.2萬死亡病例［1］。雖然對宮頸癌的早期篩查和預防接種工作有所擴大，但全球宮頸癌新發病例數量仍持續增加，這意味著宮頸癌仍是一個重大的公共衛生問題［2］。目前，仍缺乏有效地指導宮頸癌治療的預后生物標志物和治療靶點。因此，尋找新的生物標志物，探討其病理機制，對改善宮頸癌患者的生存具有重大價值。

磷脂酶A2-VII（phospholipase A2 groupⅦ，PLA2G7）的基因位于6號染色體6p12.3條帶，編碼的蛋白質為Lp-PLA2，又名PAF-AH［3］。既往研究表明，PLA2G7是一種腫瘤相關巨噬細胞衍生因子［4］，在調節肝癌［5］、乳腺癌［6］、前列腺癌（prostate adenocarcinoma，PRAD）［7］的細胞遷移中起關鍵作用。目前，有關PLA2G7在宮頸癌發生發展中的作用研究鮮有報道。本文旨在通過多種腫瘤數據庫探索PLA2G7在宮頸癌中的表達、預后價值及其生物學功能情況，以期作為預測宮頸癌免疫治療應答的新的生物標志物。

1 材料與方法

1.1 cBioPortal數據庫分析

cBioPortal數據庫（https://www.cbioportal.org/）可用于多種癌癥基因組數據集的交互式探索［8］。該數據庫包含TCGA數據庫（https://portal.gdc.cancer.gov/）的同源數據，可用于研究體細胞突變、DNA拷貝數突變、DNA甲基化和其他基因類型。本研究使用該數據庫分析PLA2G7基因在所有TCGA腫瘤類型中的突變類型和拷貝數改變信息。在cBioPortal數據庫首頁點擊“Quick select”中的“TCGA PanCancer Atlas Studies”，然后點擊“Query By Gene”，輸入基因名稱“PLA2G7”進行分析。

1.2 GEO數據庫分析

GEO數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）是數據集的國際公共數據庫，包括來自單通道和雙通道測定mRNA表達的數據以及基因組DNA和蛋白質的試驗數據［9］。本研究使用GEO中的GEO2R分析平臺識別4個表達譜數據集（GSE63514、GSE67522、GSE9750和GSE7803）中PLA2G7的差異表達。GSE63514包含28個宮頸腫瘤組織和24個宮頸正常組織，GSE67522包含20個宮頸腫瘤組織和22個宮頸正常組織，GSE9750包含27個宮頸腫瘤組織和24個宮頸正常組織，GSE7803包含21個宮頸腫瘤組織和10個宮頸正常組織。以|log2FC| ＞1和調整P值（adj.P）＜0.05為差異基因的篩選條件。

1.3 GEPIA2數據庫分析

GEPIA2（http://gepia2.cancer-pku.cn）是最近發布的分析工具，包含8 587個正常樣本和9 736個腫瘤樣本的RNA測序表達數據，可用于差異分析、患者生存分析和相關性分析［10］。使用“Profile”工具確定泛癌中PLA2G7表達水平，“Survival Map”工具確定泛癌中PLA2G7表達與總生存（overall survival，OS）的關聯，對數秩檢驗比較高表達PLA2G7組與低表達PLA2G7組的患者Kaplan-Meier生存圖。

1.4 PLA2G7表達在臨床特征亞組中的預后分析

在TCGA數據庫中下載宮頸癌患者的轉錄組數據和臨床特征數據。排除總生存時間為0 d的患者，以PLA2G7表達的中位數為截斷值，分為高表達和低表達兩個亞組。采用分層Cox比例風險模型分析PLA2G7在不同臨床特征亞組中的預后情況。

1.5 基因集富集分析和基因集變異分析

采用基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）和基因集變異分析（gene set variation analysis，GSVA）方法研究PLA2G7在宮頸癌中的生物學功能。從GSEA官方網站（http://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/index.jsp）下載基因本體（gene ontology，GO）基因集文件c5.go.v7.4.symbols.gmt和京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）基因集文件c2.cp.kegg.v7.4.symbols.gmt。R中的GSEABase和GSVA包分別用于GSEA分析和GSVA分析，并能將與PLA2G7表達相關的5個富集基因集和15條信號通路進行可視化。

1.6 TIMER數據庫分析

TIMER數據庫（https://cistrome.shinyapps.io/timer/）是系統分析不同癌癥類型免疫浸潤的綜合資源，擁有來自TCGA數據庫的大部分同源數據［11］。通過“Gene”模塊分析PLA2G7表達與免疫浸潤細胞豐度的相關性，包括B細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、中性粒細胞、巨噬細胞和樹突細胞。此外，通過“Correlation”模塊探索了PLA2G7表達與腫瘤浸潤免疫細胞基因標志物之間的相關性。腫瘤浸潤免疫細胞包括CD8+T細胞、T細胞（一般）、B細胞、單核細胞、腫瘤相關巨噬細胞（tumor-associated macrophage cell，TAM）、M1巨噬細胞、M2巨噬細胞、中性粒細胞、自然殺傷細胞（natural killer cell，NK）、樹突狀細胞（dendritic cell，DC）、輔助性T1細胞（type 1 T helper cell，Th1）、輔助性T2細胞（type 2 T helper cell，Th2）、濾泡輔助T細胞（T follicular helper cell，Tfh）、輔助性T17細胞（type 17 T helper cell，Th17）、調節性T細胞（regulatory T cell，Tregs）和衰竭T細胞。這些腫瘤浸潤免疫細胞的基因標志物在以往的研究中已被引用［12］。

1.7 統計分析

使用R語言（版本3.6.2）分析數據。采用Cox比例風險回歸模型分析在臨床特征亞組中的PLA2G7表達與預后的關系，并計算風險值及其95%置信區間。基因表達的相關分析通過Spearman相關性和統計顯著性進行評估。相關性的強度使用以下絕對值指南確定：0～0.19“非常弱”，0.20～0.39“弱”，0.40～0.59“中等”，0.60～0.79“強”，0.80～1.00“非常強”。P＜0.05被認為具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 PLA2G7基因在泛癌中的遺傳變異情況

研究使用cBioPortal數據庫，對PLA2G7基因的遺傳變異進行了泛癌分析。該數據包括32項TCGA泛癌研究中的10 953例患者/10 967例樣本，基因改變的頻率為2.1%。較為常見的DNA改變是擴增和突變。在彌漫性大B細胞淋巴瘤（lymphoid neoplasm diffuse large B-cell lymphoma，DLBC）、食管癌（esophageal carcinoma，ESCA）、卵巢漿液性囊腺癌（ovarian serous cystadenocarcinoma，OV）中擴增占比較高，在皮膚黑色素瘤（skin cutaneous melanoma，SKCM）、子宮內膜癌（uterine corpus endometrial carcinoma，UCEC）、子宮肉瘤（uterine carcinosarcoma，UCS）中突變頻率較高（圖1）。

圖1 PLA2G7在泛癌中的遺傳變異Fig. 1 Genetic aberration of PLA2G7 in TCGA pan-cancer

2.2 PLA2G7基因在泛癌中的差異表達和預后分析

如表1所示，PLA2G7在4個宮頸癌GEO數據集中的差異表達分析結果表明，PLA2G7在宮頸腫瘤組織中的表達水平顯著高于宮頸正常組織。如圖2a所示，PLA2G7在膀胱尿路上皮癌（bladder urothelial carcinoma，BLCA）、宮頸鱗癌和腺癌（cervical squamous cell carcinoma and endocervical adenocarcinoma，CESC）、結腸癌（colon adenocarcinoma，COAD）、彌漫性大B細胞淋巴瘤、食管癌、頭頸鱗狀細胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSC）、腎透明細胞癌（kidney renal clear cell carcinoma，KIRC）、腎乳頭狀細胞癌（kidney renal papillary cell carcinoma，KIRP）、胰腺癌（pancreatic adenocarcinoma，PAAD）、前列腺癌、直腸腺癌（rectum adenocarcinoma，READ）、皮膚黑色素瘤、胃癌（stomach adenocarcinoma，STAD）、睪丸癌（testicular germ cell tumors，TGCT）、胸腺癌（thymoma，THYM）、子宮內膜癌、子宮肉瘤腫瘤組織中顯著高于其正常組織中的表達水平。如圖2b所示，PLA2G7表達水平與宮頸癌患者的預后密切相關。圖3所示的生存曲線表明，PLA2G7高表達的患者OS較長（Log-rankP=0.030）。

圖2 PLA2G7的表達和預后分析Fig. 2 Expression and prognostic analysis of PLA2G7

圖3 PLA2G7在宮頸癌中的生存曲線Fig. 3 Survival curve of PLA2G7 in cervical cancer

表1 PLA2G7在4個GEO數據集中的差異表達Tab. 1 Differential expression of PLA2G7 in 4 GEO datasets

2.3 PLA2G7表達在臨床特征亞組中的預后分析

本研究以PLA2G7表達的中位數為截斷值，將291例患者分為高表達組和低表達組并進行單因素Cox回歸分析。如表2所示，在291例宮頸癌患者中，PLA2G7高表達是影響患者生存的保護因素（HR=0.50，95%CI：0.31～0.80，P=0.004）。為進一步探索PLA2G7表達是否在宮頸癌患者臨床特征亞組中仍具有預后價值，通過對PLA2G7表達在臨床特征亞組中的單因素Cox回歸分析發現，PLA2G7高表達在年老組（HR=0.49，95%CI：0.26～0.93，

P=0.030）、stageⅠ&stageⅡ（HR=0.47，95%CI：0.26～0.85，P=0.012）以及G3&G4（HR=0.30，95%CI：0.12～0.71，P=0.006）中與患者良好的預后顯著相關（表2）。結果表明，在預測宮頸癌患者的生存中PLA2G7高表達具有較高的預后價值。

表2 不同臨床特征亞組中PLA2G7的表達與預后的關系Tab. 2 The relationship between PLA2G7 expression and prognosis in different clinical characteristics subgroups

2.4 GSEA和GSVA

為探索PLA2G7在宮頸癌中表達的生物學意義，本研究進行了GESA和GSVA分析。如圖4a所示，GSEA分析結果表明，PLA2G7正向調節宮頸癌炎癥反應、防御反應調節、細胞膜表面、MAPK級聯調控以及凋亡信號通路等相關功能。如圖4b所示，GSVA分析結果表明，PLA2G7的表達與造血細胞譜系、利什曼原蟲感染、趨化因子信號通路以及一些免疫相關通路，包括同種異體排斥反應、T細胞受體信號通路、自然殺傷細胞介導的細胞毒性、產生IgA的腸道免疫網絡等呈正相關。相反，PLA2G7的表達與細胞周期相關途徑和果糖、丁酸代謝等的特定代謝途徑呈負相關。

圖4 宮頸癌中PLA2G7的GSEA和GSVA分析Fig. 4 GSEA and GSVA analysis of PLA2G7 in cervical cancer

2.5 PLA2G7表達與免疫浸潤細胞相關

圖5表明，在宮頸癌患者中，PLA2G7表達與腫瘤純度（r=-0.323，P=3.60e-08）、B細胞（r=0.274，P=3.68e-06）、CD8+T細胞（r=0.447，P=7.51e-15）、CD4+T細胞（r=0.440，P=1.51e-14）、巨噬細胞（r=0.367，P=3.07e-10）、中性粒細胞（r=0.487，P=6.47e-18）和樹突狀細胞（r=0.697，P=1.55e-41）的浸潤水平顯著相關。這些發現提示，PLA2G7在宮頸癌免疫浸潤中發揮特定作用，尤其是在中性粒細胞和樹突狀細胞中。

圖5 宮頸癌中PLA2G7與免疫浸潤細胞水平的相關性Fig. 5 Correlation analysis between PLA2G7 and immune infiltration cells level in cervical cancer

2.6 PLA2G7表達與免疫標記基因的相關性分析

如表3所示，通過純度相關性調整后，在TIMER數據庫中PLA2G7表達與免疫細胞基因標記物CD8A、CD3D、CD3E、CD2、CD68、IL10、VSIG4、CD11b（ITGAM）、CCR7、HLA-DPB1、HLA-DRA、HLA-DPA1、T-bet（TBX21）、STAT4、STAT1、IFN-γ（IFNG）、FOXP3、CCR8、PD-1（PDCD1）、LAG3和GZMB的表達之間存在中等強度的相關性，并與免疫細胞基因標記物CD86、CD115（CSF1R）、CD163、MS4A4A、CD11c（ITGAX）、CTLA4和TIM-3（HAVCR2）的表達存在強相關性。這些基因標記物主要為CD8+T細胞、T細胞（一般）、單核細胞、TAM、M2巨噬細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞以及不同功能性T細胞，如Th1細胞、Tregs細胞和衰竭T細胞的標記蛋白。

表3 （續） Tab. 3 (continued)

表3 PLA2G7與免疫細胞基因標志物的相關性分析Tab. 3 Correlation analysis between PLA2G7 and relate genes and markers of immune cells

3 討論

PLA2G7編碼蛋白Lp-PLA2（又名PAF-AH），是一種與脂蛋白結合的血漿酶，主要由巨噬細胞和活化的血小板產生［13-14］。既往研究表明，Lp-PLA2可以作為心腦血管疾病的炎癥生物標志物［15］，對預測心腦血管疾病的發生風險具有重要價值。在腫瘤的發生發展中，PLA2G7作為巨噬細胞衍生因子調節腫瘤細胞的遷移［16］。在鼻咽癌細胞中，PLA2G7可以增強腫瘤細胞的遷移和存活［17］；在彌漫性大B細胞淋巴瘤［18］、乳腺癌［6］、前列腺癌［7］細胞中也有類似的發現。目前，在宮頸癌中有關PLA2G7的研究鮮有報道。本研究分析了PLA2G7在宮頸癌患者中的表達、預后價值及其生物學功能，這為進一步研究PLA2G7在宮頸癌中的作用奠定了基礎。

研究發現，與正常組織相比，PLA2G7在多種腫瘤組織中顯著高表達。生存分析表明：PLA2G7高表達組的宮頸癌患者預后更好；同時，在全人群中的Cox風險比例模型顯示，PLA2G7為保護因素；在年老組、stageⅠ&stageⅡ及G3&G4中，PLA2G7的高表達患者預后較好，而在年輕組、stageⅢ&stageⅣ和G1&G2中，PLA2G7的高表達與患者的預后無關。由此表明，在不同患者的臨床亞組分析中，PLA2G7高表達能夠穩定地預測患者的生存。在BRCA1突變卵巢癌中的研究表明［19］，PLA2G7高表達與總生存期的延長顯著相關，并首次表明其保護特性可能與負調節Wnt/β-catenin通路相關。這與本研究中PLA2G7高表達在宮頸癌患者中的預后價值一致，表明PLA2G7可作為宮頸癌的預后生物標志物。

本研究發現，PLA2G7表達與宮頸癌患者不同的免疫浸潤水平相關。結果表明，PLA2G7表達與CD8+T細胞、CD4+T細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞存在中等強度的相關性。腫瘤純度是由臨床腫瘤樣本中的表達數據計算而來，是分析免疫浸潤水平的重要影響因素［20］。通過TIMER數據庫，進一步探索PLA2G7表達與腫瘤純度調整后的免疫浸潤細胞基因標記物的相關性分析發現，PLA2G7的表達與多種免疫浸潤細胞基因標記物之間存在顯著相關性。例如，PLA2G7的表達與T細胞的基因標記物CD3D、CD3E、CD2的表達存在中等相關性，與單核細胞基因標記物CD86和CSF1R以及M2巨噬細胞基因標記物CD163和MS4A4A的表達呈強相關性。同時發現，PLA2G7的表達與輔助T細胞的基因標記物T-bet（TBX21）、STAT4、STAT1和IFN-γ（IFNG）的表達存在顯著相關性，表明PLA2G7可能調節宮頸癌中輔助T細胞功能的潛在機制。此外，PLA2G7的表達與調節性T細胞和衰竭T細胞的基因標記物FOXP3、CCR8、TIM-3、PD-1、CTLA4、LAG3、TIM-3和GZMB的表達呈正向相關。其中TIM-3是衰竭T細胞上的一種關鍵表面蛋白［21］，與宮頸癌中的PLA2G7表達高度相關。由此表明，PLA2G7具有激活調節性T細胞和誘導T細胞衰竭的潛力，提示PLA2G7在宮頸癌腫瘤免疫中發揮調節作用。

GSEA和GSVA分析了PLA2G7在宮頸癌中的生物學功能和潛在影響的信號通路，發現PLA2G7主要在炎癥反應、防御反應調節、細胞膜表面、MAPK級聯調控以及凋亡信號通路發揮相關功能。同時，PLA2G7的表達與細胞黏附分子CAMS、造血細胞譜系、趨化因子信號通路以及一些免疫相關通路顯著相關，表明PLA2G7在宮頸癌患者中具有潛在的免疫調節作用，從而改善宮頸癌患者的生存狀況。

綜上所述，本研究基于多種腫瘤數據庫以生物信息學方法分析發現，在宮頸癌患者中PLA2G7高表達可能是通過增強免疫細胞的募集信號通路、調節免疫浸潤細胞的富集，從而改善宮頸癌患者的生存狀況。后期的進一步研究主要是進行前瞻性試驗驗證，未來PLA2G7或可成為一個預測宮頸癌患者免疫治療應答的生物標志物。