3.74 μm遠紅外激光致小鼠角膜損傷修復觀察

尹貽雪，焦路光，王嘉睿，王 超，任子淇，趙乙瓏，鄭 紅，楊在富*

（1. 安徽醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，合肥 230032；2. 軍事科學院軍事醫(yī)學研究院輻射醫(yī)學研究所，北京 100039）

處于大氣傳輸窗口的3～5 μm遠紅外激光在分子光譜學［1］、環(huán)境遙感［2］、紅外光電對抗［3］等領域有重要的應用價值。近年來，隨著紅外光參量振蕩器（optical parametric oscillator，OPO）技術的發(fā)展［4-7］，該波段的激光器已經(jīng)實現(xiàn)小型化和較高功率輸出，極大地促進了該光譜區(qū)段的開發(fā)和應用，但其對人身健康的危害也應引起足夠重視。人眼是激光損傷最重要的靶器官。紅外（0.7 μm～1.0 mm）激光具有強烈的“水吸收”作用［8］，人眼受到該波段激光照射時，輻射能量主要被含水量豐富的角膜組織吸收，通過熱效應造成角膜損傷［9］。角膜被紅外激光損傷后可造成混濁、瘢痕、不透明甚至失明，危害嚴重，是近年來激光損傷防護研究的重要方向［10-12］。以往的紅外激光角膜損傷研究主要集中在近紅外（0.7～1.4 μm）和中紅外（1.4～3.0 μm）波段，包括波長1.315 μm的氧碘化學激光（chemical oxygen-iodine laser, COIL）［13］、波長1.319 μm的釔鋁石榴石晶體（yttrium aluminium garnet，YAG）激光［14-16］、波長1.338 μm的YAG激光［10］、波長1.54 μm的鉺（erbium，Er）激光［17-19］、波長2.0 μm的銩（thulium，Tm）激光［20-22］、波長2.94 μm的自由電子激光 （free electron laser，F(xiàn)EL）［23］等。遠紅外波段（3 μm～1 mm）激光角膜損傷的研究主要集中在波長為10.6 μm的CO2激光上［24］。目前，3～5 μm波段激光角膜損傷的研究尚未見報道。我們前期通過試驗研究確定出了處于該波段的3.74 μm激光兔角膜損傷閾值［25］。本文在前期研究的基礎上，構建3.74 μm激光小鼠角膜損傷模型，觀察激光角膜損傷特點和損傷修復過程，為激光角膜損傷危害評價和損傷治療研究提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗對象

C57BL/6J小鼠（Mus musculus）30 只，6～8 周齡，體重25～30 g，雌雄不限，由北京斯貝福實驗動物養(yǎng)殖中心提供，在軍事醫(yī)學研究院實驗動物中心飼養(yǎng)。經(jīng)裂隙燈顯微鏡和檢眼鏡檢查，小鼠眼屈光介質和眼底均正常。

1.2 儀器

遠紅外激光器由國防科技大學提供，波長為3.74 μm。采用光參量振蕩技術，輸出激光中包含1.06、1.50和3.74 μm三個波長，發(fā)射方式為連續(xù)輸出。濾除1.06和1.50 μm激光，保留3.74 μm激光，其最大功率為12.8 W。

1.3 光路搭建

3.74 μm激光依次經(jīng)過楔形分束片、凸透鏡、快門、反射鏡后垂直入射到小鼠角膜，光路中所有光學元件均為適合于遠紅外透射傳輸?shù)腃aF2材質。楔形角為8o的楔形分束片分出的部分激光，照射到激光功率計1（power meter 1，PM1）上，用于監(jiān)測激光照射過程中的功率。另一個激光功率計2（power meter 2，PM2）測量到達小鼠角膜處的激光功率。焦距為500 mm的凸透鏡用于改變光束直徑，調節(jié)角膜光斑大小，凸透鏡與小鼠眼角膜間的距離為28.3 cm，此處光斑直徑為2 mm。機械快門控制曝光時間為0.8 s。兩個低功率的655 nm激光筆發(fā)射的激光束交叉點與3.74 μm激光光斑中心重合，用于精確指示小鼠角膜位置。試驗前先測出PM2與PM1讀數(shù)的比值即監(jiān)視比，角膜照射時撤掉PM2，根據(jù)PM1讀數(shù)和監(jiān)視比計算出實際輻射功率。通過調整激光器驅動電流，激光照射角膜的功率可自由改變。

1.4 構建小鼠角膜激光損傷模型

試驗前30 min，30 只C57BL/6J小鼠采用5%水合氯醛（750 mg/kg）腹腔注射全身麻醉，然后用鹽酸奧布卡因滴眼液表面麻醉。將小鼠固定在升降臺上，微調小鼠眼的位置和角度使激光束照射角膜中心。根據(jù)本研究前期試驗結果［23］，光照時間為1.0 s、光斑直徑為1.5 mm的條件下，3.74 μm遠紅外激光致兔角膜損傷閾值為7.91 J/cm2。依據(jù)該數(shù)據(jù)，預試驗分別用大約2 倍、3 倍、4 倍閾值劑量激光照射小鼠角膜，每個照射劑量1 只小鼠，摸索可導致熱凝固損傷但不會發(fā)生角膜缺損或穿孔（中度損傷）的激光照射條件，得出能量密度為23.2 J/cm2，對應的激光照射功率為0.91 W。正式試驗時，每只眼僅照射一個光斑，照射位置盡量靠近角膜中心。對照組為3只小鼠，試驗組為照后3 h、6 h、12 h、1 d、3 d、7 d、14 d、21 d等8個時間點，每個時間點3只小鼠。

1.5 大體觀察

在激光損傷后各觀察時間點，肉眼或借助放大鏡觀察小鼠角膜損傷斑情況，用數(shù)碼相機拍照記錄。

1.6 裂隙燈顯微鏡觀察

在激光損傷后各觀察時間點，用TOPCON裂隙燈顯微鏡觀察小鼠角膜損傷情況，觀察方法包括大光斑斜照法以及窄裂隙照明法，評估角膜混濁程度、損傷深度，并拍照記錄。

1.7 光學相干斷層掃描（optical coherence tomography, OCT）

在激光損傷后各觀察時間點，采用光學相干斷層掃描儀（Cirrus HD-OCT 5000）對小鼠角膜損傷區(qū)進行斷層掃描，并進行拍照記錄。用Cirrus HD-OCT系統(tǒng)自帶標尺測量損傷中心的角膜厚度，用于統(tǒng)計分析。

1.8 組織病理觀察

在激光損傷后各觀察時間點，頸椎脫臼處死小鼠，摘取眼球，快速置入甲醛-乙酸固定液（10%中性甲醛80 mL，乙酸20 mL）固定24 h［26］，固定后標本經(jīng)梯度酒精脫水，二甲苯使之透明，石蠟包埋后制作4 μm切片，蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，HE），中性樹脂封片，光學顯微鏡下進行病理切片的觀察和拍照。

1.9 統(tǒng)計分析

使用SPSSv23.0統(tǒng)計軟件包對Cirrus HD-OCT測得的損傷中心角膜厚度進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以平均值±標準差（±s）表示，采用Student’sttest比較損傷后各個時間點與損傷前厚度是否有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 大體觀察

圖1 3.74 μm遠紅外激光致小鼠角膜損傷光路示意圖Fig. 1 Schematic drawing of 3.74 μm laser set up for the mice corneal exposure

如圖2所示，C57BL/6J小鼠正常角膜表面光滑，清澈透明。3.74 μm遠紅外激光所致角膜損傷即刻可見為灰白色凝固斑，損傷后3～12 h角膜表面凹凸不平，角膜混濁程度隨時間逐漸加重，1 d時最重，3～7 d逐漸減輕，14 d再次加重，21 d角膜仍不透明，未恢復正常。另外，激光損傷后12 h可見上下眼瞼腫脹和分泌物增多，1 d時癥狀最為明顯，其后逐漸消退。

圖2 3.74 μm遠紅外激光損傷角膜后損傷斑的變化Fig. 2 Corneal lesions under digital camera after 3.74 μm laser irradiation

2.2 裂隙燈顯微鏡觀察

大光斑斜照法觀察（圖3a）正常角膜透明度高，其后方的虹膜和瞳孔清晰可見。3.74 μm遠紅外激光損傷后，角膜混濁非常明顯，后方虹膜和瞳孔被遮擋不可分辨，角膜混濁隨時間的變化特性與大體觀察一致。損傷后6 h混濁區(qū)擴展至損傷斑周邊，1 d時混濁面積達到頂峰，3～7 d混濁面積明顯減小，14 d混濁再次加重，21 d角膜未恢復正常。

窄裂隙照明法觀察發(fā)現(xiàn)（圖3b）：正常角膜光散射弱，為厚薄均勻的淡灰白色條帶，虹膜清晰可見；角膜受損后光散射顯著增強，為亮白色條帶，損傷累及角膜全層，損傷區(qū)角膜增厚，虹膜模糊；白色條帶隨時間先增強后減弱，1 d時條帶最顯著，21 d時角膜厚薄仍不均勻，未恢復正常。

圖3 裂隙燈顯微鏡觀察3.74 μm遠紅外激光損傷角膜后損傷斑的變化Fig. 3 Corneal lesions under slit lamp microscope after 3.74 μm laser exposure

2.3 OCT觀察

OCT觀察正常角膜為亮度均勻的高反射光帶。3.74 μm激光損傷后，損傷區(qū)角膜反射光帶增強，角膜凸起明顯；反射光帶增強區(qū)域隨時間先擴大后逐漸縮小，1 d時反射光帶增強區(qū)域達到最大，21 d時角膜損傷區(qū)反射光帶仍較強，未恢復正常（圖4）。此外，損傷后6 h～1 d可觀察到虹膜與角膜黏連（但無法判斷虹膜是否與晶狀體黏連）。

圖4 OCT觀察3.74 μm遠紅外激光損傷角膜后的損傷區(qū)的變化Fig. 4 Corneal lesions under OCT after 3.74 μm laser exposure

激光損傷引起角膜腫脹，角膜厚度隨時間先增大后減小，12 h時最厚，達（218.30±8.18）μm，約為正常角膜厚度的2 倍；21 d角膜厚度基本恢復正常（圖5）。

圖5 3.74 μm遠紅外激光損傷后角膜厚度的變化Fig. 5 The thickness of corneal after injury induced by 3.74 μm laser

2.4 組織病理觀察

HE染色觀察發(fā)現(xiàn)：正常小鼠角膜組織結構清晰，上皮層由4～5 層上皮細胞構成，排列規(guī)整；基質層纖維規(guī)則排列，包含梭形基質細胞；內皮層為單層內皮細胞均勻分布。3.74 μm激光致C57BL/6J小鼠角膜損傷后3 h，上皮細胞核固縮深染，成拉伸狀，基質細胞核染色質大部分脫失，僅有少量殘存，內皮細胞完全脫落；6 h上皮細胞核染色變淡，基質細胞核染色質消失，出現(xiàn)無核區(qū)，后表面平整；12 h上皮層不再平整，出現(xiàn)皺褶，上皮細胞核染色消失，基質層出現(xiàn)浸潤細胞，基質后表面皺褶彎曲；1 d壞死上皮脫落，1～2 層新生上皮細胞完全覆蓋損傷區(qū)，細胞排列不規(guī)則，基質層浸潤細胞增多，基質后表面出現(xiàn)零星橢圓形核的內皮細胞；3 d上皮層細胞增多，出現(xiàn)單層扁平上皮，表面恢復平整，基質層浸潤細胞進一步增多，且多集中在深層，內皮層橢圓形內皮細胞增多；7 d新生上皮增加到3～4 層細胞，大量細胞呈空泡狀，基質浸潤細胞多集中在淺層，扁平內皮細胞呈單層分布，恢復平整；14 d 上皮層有少量空泡細胞，排列趨向規(guī)整，基質層浸潤細胞減少；21 d上皮層基本恢復正常，厚薄均勻，由4～5 層排列規(guī)整的上皮細胞構成，單層內皮細胞均勻分布，鋪滿內皮層，基質層浸潤細胞進一步減少，基質層出現(xiàn)空隙，基質纖維排列仍不規(guī)則，未恢復正常（圖6）。

圖6 3.74 μm中紅外激光照射角膜損傷病理切片F(xiàn)ig. 6 Corneal histological sections after 3.74 μm laser exposure

組織病理顯示：損傷后6 h虹膜與角膜黏連；12 h虹膜組織碎裂，部分與角膜黏連，部分與晶狀體黏連；1 d可見虹膜與角膜緣黏連，偶見與晶狀體黏連（圖7），說明虹膜也已經(jīng)受損。上述虹膜與角膜黏連的特征與OCT觀察結果一致。

圖7 3.74 μm遠紅外激光致角膜損傷后組織黏連的病理切片F(xiàn)ig. 7 Iris adhesion to the cornea or lens revealed by histological sections after 3.74 μm laser exposure

3 討論

本研究中，我們構建了3.74 μm遠紅外激光致C57BL/6J小鼠角膜熱凝固損傷模型，損傷累及小鼠角膜全層，損傷后角膜腫脹增厚，混濁隨時間加重，隨著受損上皮細胞脫落以及水腫消退，角膜變薄，混濁減輕。新生上皮細胞遷移覆蓋損傷區(qū)，先形成1～2 層細胞組成的薄層上皮，然后逐漸增厚形成接近完整的正常上皮；基質層受損基質細胞核染色質消失，出現(xiàn)浸潤細胞，其自房水途經(jīng)受損內皮進入基質深層，進而遷移至基質淺層。21 d浸潤細胞退去，基質層膠原纖維未恢復正常結構；受損內皮細胞脫落，新生內皮細胞遷移覆蓋損傷區(qū)，形成均勻分布的單層扁平結構。

與本試驗中3 倍閾值劑量造成小鼠角膜全層損傷特征不同，該激光致新西蘭白兔角膜閾值損傷研究的觀察只持續(xù)到24 h。在閾值水平損傷僅累及角膜上皮層，損傷后上皮壞死脫落，24 h上皮層即可恢復正常［25］。2 倍閾值劑量的損傷累及角膜上皮層和淺層基質，損傷后6 h上皮壞死脫落，淺層基質細胞核染色質大部分脫失；24 h可見上皮層基本恢復正常，淺層基質細胞核染色質消失，未恢復正常［25］。本試驗眼損傷明顯偏重，原因一方面是激光照射劑量高，另一方面是小鼠角膜厚度低。

就動物模型的選擇上，角膜損傷閾值研究多以兔作為動物模型［13-24］，而角膜損傷修復研究則多以小鼠作為動物模型［27-29］。3～4月齡兔角膜厚度在350～380 μm［30］，而6～8 周齡C57BL/6J小鼠的角膜厚度為85～95 μm［31］。3.74 μm激光在1.97 倍損傷閾值條件下?lián)p傷累及兔角膜上皮層和基質淺層，損傷深度約是兔角膜厚度的一半［25］；按損傷深度推斷，本試驗所用照射劑量不僅能損傷小鼠角膜全層，還包括角膜后組織。因此，在損傷修復中觀察到虹膜與角膜黏連，或者虹膜與晶狀體黏連的現(xiàn)象?？傊?，本研究通過觀察3.74 μm遠紅外激光在23.2 J/cm2的劑量下致小鼠角膜損傷后的修復過程，為紅外激光角膜損傷修復研究提供了試驗依據(jù)。