抗人細胞角蛋白7（CK7）單克隆抗體的制備及鑒定

曾 璇，吳 意，劉如石，曾冰潔，扶春艷，楊玉皎，鄭 姣*，鐘志宏*

（1. 湖南師范大學醫學院，長沙 410013；2. 湖南師范大學免疫診斷試劑湖南省工程研究中心， 長沙 410013；3. 湖南師范大學附屬第一醫院（湖南省人民醫院）臨床檢驗科， 長沙 410005；4. 湖南省株洲市婦幼保健院產科，株洲 412008）

細胞角蛋白是一種復雜的中間絲蛋白質，是角質細胞中的主要骨架蛋白，主要存在于上皮細胞，可為上皮細胞提供機械凝聚力和抗創傷性。目前，細胞角蛋白家族包含20多種不同的多肽［1-2］。根據摩爾目錄［3］，細胞角蛋白被分為酸性細胞角蛋白（Ⅰ型）和堿性細胞角蛋白（Ⅱ型）兩個亞組。細胞角蛋白1（cytokeratin 1，CK1）的相對分子質量最大（68 kD），細胞角蛋白9（cytokeratin 9，CK9）的相對分子質量最小（40 kD）。細胞角蛋白存在于良性和惡性上皮細胞，且大部分惡性腫瘤上皮組織中都被證實存在細胞角蛋白。

細胞角蛋白7（cytokeratin 7，CK7）是相對分子質量為54 kD的堿性角蛋白，存在于各種導管細胞及腺上皮細胞中。在肺、乳房、子宮內膜、卵巢、子宮頸、唾液腺、甲狀腺癌、膽管癌、胰腺癌等組織中均有CK7的表達［4-8］。有研究發現，在與人類乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）相關的宮頸癌中也有CK7的表達［9］。另有研究表明，CK7有助于原發性肺、結腸直腸癌和轉移性肺、結腸直腸癌的鑒別，且有助于轉移性病變的診斷區分。在轉移性癌癥患者中，CK7有助于腫瘤原發部位的確定和預后評估［2，10-13］。因此，制備抗CK7單克隆抗體并用于臨床免疫組化檢測CK7的表達，對癌癥的診斷和預后有重要意義。

目前，CK7作為一種腫瘤標志物已得到臨床的普遍重視，國內研究工作主要集中于其臨床免疫組化檢測。目前醫院使用的高質量CK7 單克隆抗體大多依賴于國外進口，價格較高，使其檢測成本較高，未能在臨床檢測中推廣使用。本試驗通過對CK7多肽序列進行分析，合成針對優勢表位的C14多肽免疫小鼠，制備單克隆抗體，并進行免疫組化鑒定，為CK7的基礎研究及制備特異性好和靈敏度高的國產化低成本免疫組化診斷試劑提供試驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 CK7多肽片段和動物

CK7多肽片段（14個氨基酸，簡稱C14多肽）由上海強耀生物合成，其純度＞95%，將其與血藍蛋白（kyhole limpet hemocyanin，KLH）偶聯；BALB/c小鼠購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。

1.1.2 組織樣本和倫理批準

組織標本取自湖南師范大學第一附屬醫院，室溫干燥保存備用，試驗經湖南師范大學倫理委員會批準。

1.1.3 主要試劑

HRP-羊抗鼠二抗由廈門大學夏寧邵教授惠贈；KLH購自Sigma；SP2/0骨髓瘤細胞系保存于本實驗室；培養基1640購自Gibco；胎牛血清 （fetal bovine serum，FBS） 購自ExCell Bio；次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸苷培養基 （hypoxanthine-aminopterinthymidine，HAT）、次黃嘌呤和胸苷（hypoxanthine -thymidine，HT）、弗氏完全和不完全佐劑、聚乙二醇（PEG1 500）購自Sigma-Aldrich；聚氰基丙烯酸正丁酯（bicinchoninic acid，BCA）蛋白檢測試劑盒、硫酸銨、Protein A/G親和柱購自生工生物。使用的所有化學品購自生工生物技術公司，均為分子生物學級或更高級別。

1.2 方法

1.2.1 C14多肽序列

通過對CK7的氨基酸序列進行優勢表位預測，選擇抗原性最強的多肽來制備抗CK7單克隆抗體。該多肽片段由14個氨基酸組成，簡稱C14多肽，氨基酸序列為KYEDEINHRTAAEN。

1.2.2 C14偶聯蛋白動物免疫

將偶聯后的C14多肽溶解后與弗氏完全佐劑以1∶1的體積比充分乳化。取5只4～6周齡BALB/c雌鼠采用皮下多點注射的方法進行免疫，共免疫4次，每兩周進行一次免疫，劑量為每只50 μg。對達到免疫效價的小鼠，在細胞融合前3 d，對脾臟進行加強免疫，劑量為每只20 μg。每次免疫前取5只小鼠的眼球靜脈血，檢測血清中抗體滴度變化。

1.2.3 細胞融合、陽性雜交瘤細胞篩選與亞克隆

將生長狀態良好的SP2/0骨髓瘤細胞與免疫小鼠的脾臟細胞分別用無血清1640培養基洗滌至無明顯顆粒后，以1∶5到1∶10的數量比進行混合，離心棄上清。輕搖離心管使細胞均勻分散后，緩慢加入1 mL 37℃預熱的PEG 1500并輕輕吹打混勻，60 s后，立即加入預熱的20 mL 1640培養基終止融合，然后加入20% FBS-HAT-1640培養基懸浮細胞并混勻。

將混勻后的培養基均勻鋪于96孔板中，置于5% CO2、37℃的培養箱中培養，每天跟蹤觀察，融合后7～10 d用10% FBS-HT-1640培養液換液，當克隆長至孔底面積的1/3～1/2時，通過有限稀釋法對細胞集落數目少且陽性值高的孔進行克隆化。經過4次亞克隆后即得到能穩定分泌特異性單克隆抗體的細胞株，再轉移至24孔細胞培養板中擴大培養，取細胞上清進行單克隆抗體效價檢測和亞型鑒定。

1.2.4 單克隆抗體效價測定

將C14多肽用碳酸氫鹽緩沖液稀釋至質量濃度為1 μg/mL，用酶聯免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）板包被，4℃過夜。洗板1次后，加入封閉液，37℃放置2 h。洗板5次，加入3株單克隆抗體（0.5 mg/mL），從1∶1 000開始進行倍比稀釋，稀釋6個梯度，空白為磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS），設置重復對照，37℃孵育30 min。洗板5次，加入HRP-羊抗鼠二抗，37℃孵育30 min。洗板5次，最后加3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺（3，3′，5，5′-Tetramethylbenzidine，TMB）底物顯色劑，37℃反應10 min。加終止液，于450 nm/630 nm雙波長處檢測光密度（optical density，OD）值。

1.2.5 單克隆抗體的純化

選用6周以上的BALB/c小鼠，在接種雜交瘤細胞1～2周前，將0.5 mL的液體石蠟注射入小鼠腹腔。收集生長良好的雜交瘤細胞，離心洗滌1次，無血清培養液中重懸，將細胞密度調整為每毫升1×106～2×106個，每只小鼠腹腔注射細胞懸液0.5 mL。7～12 d后，小鼠腹部明顯膨大后消毒腹部皮膚，用注射器抽取腹腔腹水。離心吸取淡黃色腹水進行分裝，-20℃保存備用。

將飽和硫酸銨溶液以1∶1的體積比緩慢加入抽取的腹水中，混勻，直到出現白色沉淀。離心去上清，用一定體積的PBS（pH 7.45）溶液溶解沉淀，透析平衡至20倍體積的結合緩沖液（Protein A Sefinose Kit中提供）中以除去高濃度的離子。

將試劑盒中的親和柱保存，垂直安裝好，用5 mL結合緩沖液先預平衡親和柱。加入樣品1 mL，用30 mL的結合緩沖液連續穿透親和柱，控制1 mL/min流速；再用10～15 mL的洗脫緩沖液對親和柱沖洗，并收集蛋白峰進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）鑒定。親和層析純化后收集的抗體透析平衡至PBS（pH 7.45）中，4℃透析12 h，分裝后保存備用。

1.2.6 單克隆抗體亞型鑒定

將C14多肽用碳酸氫鹽緩沖液稀釋至質量濃度為1 μg/mL，ELISA板包被，4℃過夜。洗板1次后加入封閉液，37℃放置2 h。洗板5次，加入3株單克隆抗體的雜交瘤細胞培養上清液，37℃孵育30 min 。洗板5次，分別加入抗IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM的抗體，37℃孵育30 min。洗板5次，最后加TMB 底物顯色劑，37℃反應10 min。加終止液，450 nm/630 nm雙波長處檢測吸光度值。

1.2.7 單抗相對親和力測定

將C14多肽用碳酸氫鹽緩沖液稀釋至質量濃度為1 μg/mL， ELISA 板包被，4℃過夜。洗板1次后加入封閉液，37℃放置2 h。洗板5次，加入純化的單克隆抗體（0.5 mg/mL），從1∶1 000開始進行倍比稀釋，稀釋12個梯度，PBS緩沖液為空白，設置重復對照，37℃孵育30 min。洗板5次，加入HRP-羊抗鼠二抗，37℃孵育30 min。洗板5次，最后加入TMB底物顯色劑，37℃反應10 min，加入終止液終止反應，最后用酶標儀雙波長（450 nm/630 nm）進行檢測。

1.2.8 免疫組化檢測抗體效價

制備標本，將收集的臨床膀胱上皮癌組織和腎嫌色細胞癌組織石蠟標本連續切片，放于載玻片，在65℃烤箱烤片30 min；脫蠟1 h；用3%H2O2進行內源性過氧化物酶阻斷，反應15 min。將切片浸入0.01 mol/L枸櫞酸鈉修復緩沖液，微波爐中加熱至沸騰，冷卻，重復2次；5%牛血清白蛋白（albumin from bovine serum，BSA）室溫封閉1 h，吐溫-20磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline Tween-20，PBST）洗滌3次，每次5 min；滴加以1∶200、1∶1 000、1∶5 000梯度稀釋的7A8（初始質量濃度為0.49 mg/mL）一抗，37℃、1 h，或者4℃過夜，PBST洗滌3次，每次5 min；滴加二抗，37℃、1 h，PBST洗滌3次，每次5 min；3，3-二氨基聯苯胺（Diaminobenzidine，DAB）顯色，室溫反應約5 min；流水沖洗，蘇木精復染2 min，鹽酸酒精分化；常規脫水，樹膠封片，鏡檢。

1.2.9 免疫組化檢測抗體反應性

制備標本，將收集的臨床膀胱上皮癌組織、腎上皮癌組織、腎嫌色細胞癌組織石蠟標本連續切片10片，直腸腺癌組織和正常腸遠端切緣組織石蠟標本連續切片5片后，放于載玻片上進行烤片，脫蠟后再用3% H2O2進行內源性過氧化物酶阻斷。將切片浸入0.01 mol/L枸櫞酸鈉修復緩沖液，微波爐中加熱至沸騰，冷卻，重復2次；5% BSA室溫封閉1 h，PBST洗滌后滴加以1∶1 000稀釋的7A8一抗；PBST洗滌后滴加二抗；PBST洗滌后DAB室溫顯色；流水沖洗，蘇木精復染后進行鹽酸酒精分化；常規脫水，樹膠封片，鏡檢，對結果進行分析，并評價篩選的抗CK7的7A8單克隆抗體。

2 結果與分析

2.1 間接ELISA檢測偶聯多肽的免疫原性

用間接ELISA檢測免疫小鼠血清中抗體效價，免疫前血清作為陰性對照，一般以2.1倍陰性值設定為臨界值。小鼠體內IgG抗體水平隨著加強免疫，血清陽性值快速增高（圖1），說明用KLH偶聯的C14多肽能在小鼠體內引起較強免疫反應，具有良好的免疫原性；在第4次免疫之后，百萬倍稀釋后小鼠血清中IgG效價均已達到制備單克隆抗體的要求。

圖1 百萬倍稀釋后免疫小鼠血清效價Fig. 1 The antibody titers in mice serum after diluted million

2.2 細胞融合、陽性雜交瘤細胞篩選與抗體效價檢測

將SP2/0骨髓瘤細胞與免疫小鼠脾臟細胞以1∶5到1∶10的數量比混合，使細胞分散均勻后，將1 mL 37℃預熱的PEG 1500緩慢加入并輕輕混勻，60 s后，立即加入預熱的1640培養基終止融合，同時加入20% FBS-HAT-1640培養基混勻并懸浮細胞。

將融合后的培養基均勻鋪板，于5% CO2、37℃培養，融合后7～10 d換液，再用間接ELISA法對雜交瘤細胞上清液中抗體效價進行檢測。采用有限稀釋法對陽性克隆進行4次亞克隆后，從50多個陽性克隆中篩選到了3株能穩定分泌抗CK7多肽的單克隆抗體雜交瘤細胞株，此3株單抗第4次亞克隆后，均為陽性，命名為7A8、3H5和6E10。對單克隆抗體效價進行檢測，3株抗體效價均達到1∶64 000，即7.8 ng/mL（圖2）。

圖2 7A8單克隆抗體效價測定Fig. 2 Titer detection of 7A8 monoclonal antibodies.

2.3 單克隆抗體的純化

將3株雜交瘤細胞株進行培養，取約106個雜交瘤細胞注入BALB/c小鼠腹腔， 8～10 d后可明顯看到小鼠腹部膨大，待小鼠腹水達到一定的抗體滴度后，抽取腹水。腹水首先經50%飽和硫酸銨沉淀初步純化，然后用Protein A親和柱純化，收集洗脫峰。將純化后的腹水抗體制備蛋白樣品并進行SDS-PAGE電泳，如圖3所示出現了3條條帶：25 kD的輕鏈、50 kD的重鏈和約100 kD的條帶，不煮沸時主要為100 kD的條帶，而煮沸后50 kD重鏈條帶質量濃度明顯變強（Lane 3、4）。純化后的抗體主要是25 kD的輕鏈和50 kD的重鏈，凝膠上基本沒有其他雜蛋白條帶。這說明經親和柱層析后單克隆抗體純度達到了后續試驗的要求。

圖3 單克隆抗體純化鑒定 Fig. 3 Identification purity of monoclonal antibody

2.4 單克隆抗體亞型鑒定

取細胞上清，對抗體亞型用間接ELISA鑒定。IgM抗體只產生在第1次免疫后，進行多次免疫后產生的均為IgG抗體。本研究對小鼠進行4次免疫后所獲得單克隆抗體均為IgG，與理論相符。經鑒定，單克隆抗體7A8、3H5和6E10亞型均為 IgG2b（圖4）。

圖4 單克隆抗體亞型鑒定Fig. 4 Subtype identification of monoclonal antibodies

2.5 單抗相對親和力測定

純化后單克隆抗體親和力與其稀釋度的關系如圖5所示。曲線開始趨于平坦表明抗原與抗體的結合變化不大，即達到飽和，把此時的OD值當作100%，將7A8、3H5和6E10單克隆抗體達到50%飽和時的質量濃度值作為其相對親和力。單克隆抗體親和力越小則所需的質量濃度越大，故相對親和力大小 ：7A8＞3H5＞6E10（表1和圖5）。因此，將7A8單克隆抗體用于后續免疫組化鑒定。

表1 純化抗體的相對親和力Tab. 1 Relative affinities of purified antibodies

圖5 單克隆抗體相對親和力測定Fig. 5 Determination of relative affinity of monoclonal antibodies

2.6 免疫組化測定抗體效價

自制的7A8（0.49 mg/mL）單克隆抗體以1∶200、1∶1 000、1∶5 000梯度稀釋后，分別對臨床收集的膀胱上皮癌組織和腎嫌色細胞癌組織進行免疫組化檢測，并于顯微鏡下觀察結果。如圖6所示，1∶1 000（0.49 μg/mL）稀釋后能夠更好地對膀胱上皮癌組織和腎嫌色細胞癌組織進行染色，且染色較深，效果更好。目前醫院常用的CK7檢測試劑盒中抗體質量濃度為2～5 μg/mL，高于本研究篩選獲得的7A8單克隆抗體的使用質量濃度0.49 μg/mL，表明本研究7A8抗體靈敏度高，可用于后續臨床檢測。

圖6 7A8單克隆抗體的免疫組化效價鑒定（400ⅹ）Fig. 6 Immunohistochemical titer identification of 7A8 monoclonal antibody (400ⅹ)

2.7 免疫組化鑒定臨床組織樣本

對臨床收集的膀胱上皮癌組織、腎上皮癌組織、腎嫌色細胞癌組織、直腸腺癌組織和正常腸遠端切緣組織石蠟標本連續切片后進行免疫組化檢測，并通過顯微鏡觀察結果。如表2和圖7所示，自制的7A8單克隆抗體以1∶1 000（0.49 μg/mL）稀釋后能夠較好地對各組織進行染色，膀胱上皮癌組織、腎上皮癌組織、腎嫌色細胞癌組織標本均表達CK7且與篩選的7A8單克隆抗體反應較好，染色較深，與不表達CK7的直腸腺癌組織和正常腸遠端切緣組織不反應，表明7A8單克隆抗體特異性較好。

圖7 7A8單克隆抗體的免疫組化分析Fig. 7 Immunohistochemical assay of 7A8 monoclonal antibody

表2 CK7在不同組織中的表達 Tab. 2 Expression of CK7 in different tissues

3 討論

細胞角蛋白的相對分子質量為40～68 kD，廣泛存在于上皮細胞中［14］。細胞角蛋白的不同亞型在上皮細胞中以組織特異性方式表達，具有極高的保守性和組織分化特異性。細胞角蛋白與上皮細胞的增殖分化密切相關，是一種常用的腫瘤免疫組織化學標記物，陽性表達見于上皮細胞、間皮細胞等。

CK7是細胞角蛋白家族中一種低相對分子質量蛋白，主要用于上皮組織腫瘤的特異性診斷［15］。研究表明，CK7可以在胰腺、膽管和膽囊中表達，此外在尿路上皮等其他上皮細胞中也有表達［16-17］。由于CK7主要存在于扁平結腸黏膜發育不良病變細胞中，將抗CK7抗體應用于免疫組化鑒定中，是鑒別診斷上皮發育不良的的有用工具。有研究發現，CK7表達還可作為局部晚期宮頸癌同步放化療反應的預測因素［1，18］。臨床工作中通常采取多個指標聯合檢測提高診斷效率，更有利于對疾病的診治［19］。將CK7和CK20聯合檢測，原發性肺腫瘤患者CK7染色結果為強陽性，而CK20為陰性，在癌癥轉移患者中CK7染色也為陽性。因此，CK7可以作為免疫組化診斷指標，具有明顯的診斷、預后和治療意義［20］。

本研究目的在于獲得 CK7 優質單克隆抗體。合成的針對優勢表位的 C14 多肽，由14個氨基酸組成，氨基酸序列為 KYEDEINHRTAAEN。該多肽抗原性值最高，制備的抗CK7單克隆抗體用于臨床樣本檢測時具有高特異性。C14多肽對小鼠進行免疫，表現出良好的抗原反應性和免疫原性。本研究經細胞融合和亞克隆篩選出靈敏度高、特異性好的單克隆抗體，并對抗體的性質進行了鑒定，篩選到特異性好、靈敏度高且穩定分泌抗CK7單克隆抗體的細胞株。這為研發免疫組化等方法檢測CK7抗原提供了基礎，同時也為免疫診斷試劑盒的研制提供了原材料。

將獲得的抗C14多肽單克隆抗體建立免疫組化檢測方法。收集膀胱上皮癌組織、腎上皮癌組織、腎嫌色細胞癌組織石蠟標本連續切片10片、直腸腺癌組織和正常腸遠端切緣組織石蠟標本連續切片5片后進行免疫組化檢測CK7。陽性標本均表現出很好的特異性和靈敏度，陰性標本和正常組織均不與本研究制備的7A8單克隆抗體反應，表現出很好的特異性，為相關腫瘤的診斷及治療提供有效的方法。目前醫院常用的CK7檢測試劑盒中抗體的質量濃度為1 mg/mL，以1∶200到1∶500稀釋，即抗體質量濃度為 2～5 μg/mL，均高于本研究篩選獲得的7A8單克隆抗體使用的質量濃度0.49 μg/mL。這表明該單克隆抗體靈敏度高，且本研究的單克隆抗體對陽性標本、陰性標本和正常組織檢測結果與醫院常用試劑盒檢測結果一致，表現出很好的特異性，可用于后續臨床檢測的研究。目前，國內CK7單克隆抗體市場緊缺，CK7作為腫瘤檢測指標還未全面推廣。因此，本研究獲得的擁有自主知識產權的針對優勢表位的單克隆抗體可以特異性快速地識別組織標本中的CK7抗原，很大程度上降低了檢測費用，提高了檢測效率，具有較好的應用前景，為國內CK7的臨床診斷及研究提供了有效的原材料。