中等強度穩態磁場影響小分子結晶的初步探索

張翔飛，周 數，謝 燦，張 磊*

（1. 中國科學院合肥物質科學研究院強磁場科學中心，合肥 230031； 2. 中國科學技術大學科學島分院，合肥 230036）

水、無機鹽、糖類、脂質和蛋白質是構成和維持生物體生命活動所需的基本物質。其中，葡萄糖是自然界中分布最廣的一種重要單糖，它是生物體內新陳代謝不可缺少的營養物質，也是生物體生命活動所需能量的主要來源［1］。鈣是生物體的必需元素，骨骼、肌肉等組織中富含鈣調蛋白，神經傳遞、激素釋放等功能需要鈣的參與，缺乏鈣元素易得骨質疏松、佝僂病以及骨發育不全等疾病［2］。氯化鈉同樣也是人體必不可缺的物質，在維持細胞內外液滲透壓，調節體內酸堿平衡以及維持神經與肌肉的興奮等多種功能上都有作用［3-4］。

相分離在生物功能行使中起著重要作用，P顆粒（P granules）具有類似液體的特性就是相分離的一個例子［5］。相分離可以實現細胞內部功能區域的劃分，協助細胞進行生理活動［6］。越來越多的證據表明，相分離過程有可能是這種混亂和秩序的聯結者［7-8］。結晶是分子有序排列和堆積的過程，而許多分子在特定參數的磁場下可能受到磁場力的作用而出現有序排列［9］。研究磁場對結晶過程的影響有助于揭示磁場對分子有序性的作用規律以及磁生物學效應的機理。

磁場影響溶液結晶的過程已有部分研究，磁場處理可以對晶體的結晶熱力學和動力學產生影響，尤其是在一定的磁場條件下能顯著地影響晶核形成和晶體生長速度［10-13］。雖然很多文獻都報道了磁場可以改善晶體的結晶過程，但由于結晶過程復雜，影響因素眾多，如結晶物本身的結構、溶劑的選擇、溫度、飽和度、不同的結晶方式等均會對結晶與否以及結晶過程產生重要的影響。磁場作為一種可能改變分子有序性的物理場，不同參數的磁場是否能影響不同物質的結晶過程尚未可知。本文對外加磁場作用下的葡萄糖和葡萄糖酸鈣的冷卻結晶和氯化鈉的蒸發結晶過程進行初步探究，揭示了不同磁場對不同物質的結晶過程影響不同，同時也對不同磁場對水分蒸發量的影響做了初步探索。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

葡萄糖（G5767）和一水合葡萄糖酸鈣（G4625）購于Sigma-Aldrich公司，氯化鈉（1.06404）購于Supelco公司，去離子水由Thinklab超純水系統產出。

1.2 主要儀器

上海一恒三孔三溫水浴鍋、低溫恒溫培養箱［MIR-254（-PC），Panasonic］、Olympus-SZX10光學顯微鏡以及ME204E分析天平。

1.3 試驗設置

靜磁場作用于結晶過程的試驗設置由加磁/對照裝置和結晶裝置兩部分組成，具體如圖1中a～c所示。試驗裝置按照加磁條件設置為對照組、磁場1組（magnetic field 1，MF1）和磁場2組（magnetic field 2，MF2）。對照組裝置使用長×寬×高為100 mm×100 mm×10 mm左右的鋁板，加磁裝置分別使用長×寬×高為100 mm×100 mm×10 mm左右的釹鐵硼磁板和長×寬×高為100 mm×100 mm×20 mm左右的釹鐵硼磁板作為靜磁場源。磁場1組施加在液滴高度（距磁體表面約3 mm）的平均磁感應強度約為0.036 T，與此相對應，磁場2組的平均磁感應強度約為0.068 T。結晶部分用底部長×寬為103 mm×103 mm的4×4的16孔結晶培養板（天津翔宇順高分子材料有限公司）。冷卻結晶時將圓形硅化蓋玻片（直徑22 mm，BioJane公司）扣在邊緣涂了真空脂（七聚二甲基硅油分子內聚二氧化硅，DOW CORNING?公司）的結晶孔上以達到密封的效果；蒸發結晶時則為開放式自然蒸發，不密封。結晶培養板底部可以穩定地恰好卡住鋁板和磁板，保證液滴受到的磁場作用恒定。整個結晶過程的試驗都在16℃的晶體恒溫培養箱中進行。

圖1 靜磁場作用于結晶過程的試驗設置示意圖和磁場對葡萄糖冷卻結晶的影響Fig. 1 Schematic diagram of the experimental setup of static magnetic field acting on the crystallization process and the effect of magnetic field on the cooling crystallization of glucose

1.4 晶體的培養和測試

1.4.1 待結晶溶液的配置

根據各物質的溶解度曲線和結晶方法［14-16］，結合前期試驗結果，選取合適的質量濃度、水浴溫度和時間進行試驗。基本流程為用分析天平稱取所需藥品，加入去離子水，選取不同水浴溫度和時間，將藥品徹底溶解至澄清透明，用于后續的結晶試驗。本試驗使用的葡萄糖的配置質量濃度為2.80 g/mL（溶質/溶劑），水浴溫度為70℃，水浴時間為12 h；葡萄糖酸鈣的配置質量濃度為0.115 2 g/mL，水浴溫度為65℃，水浴時間為6 h；氯化鈉的配置質量濃度為0.10 g/mL和0.28 g/mL，水浴溫度為室溫，水浴時間為1 h。值得注意的是，進行下一步試驗之前需將溶液再次搖晃混勻。

1.4.2 結晶試驗和觀測

結晶試驗統一采用50 μL體系進行晶體培養。具體來說，將配置好的待結晶溶液用微量移液器取50 μL緩慢滴入結晶板上的結晶孔中心進行晶體培養和觀察。其中，冷卻結晶試驗，如葡萄糖和葡萄糖酸鈣的結晶，采用圓形硅化蓋玻片和真空脂對結晶孔進行密封；蒸發結晶試驗則無需密封。

分裝完畢后的晶體培養板分別放置在無外加磁場或不同磁場強度的試驗裝置上進行晶體的培養。在不同的時間分別記錄晶體的生長狀況，根據產生晶體的實際情況，如單晶或者晶簇，分別記錄晶體板中所有結晶孔中晶體析出的比例，或者對每個結晶孔中的晶體或晶簇進行計數或稱重。圖片由FLUOCAD和FCSnap軟件拍攝并進行定性定量分析統計，其他試驗數據用GraphPad Prism 9處理分析并作圖。

1.5 磁場影響溶液蒸發量的試驗

每次試驗包括3組試驗同時進行，3組分別為無外加磁場組、磁場1組和磁場2組。每組試驗包括3種溶液，500 μL去離子水、500 μL不同質量濃度（0.10 g/mL和0.28 g/mL）的氯化鈉溶液，分別加入18 mm培養皿中，用分析天平稱重并記錄為0 h質量。將上述3種溶液置于無外加磁場和2種不同磁場中進行自然蒸發試驗，環境濕度為88%，每隔1.5 h稱其質量并記錄，直到6 h結束。后一時間點與前一時間點的質量差即為該種溶液在這一時間段內的蒸發量。

1.6 統計學分析

所有試驗均重復至少3～4次。定量分析數據顯示為平均值±標準誤（±sχ），并利用Graphpad軟件進行t檢驗計算P值，結果表示為：*代表P＜0.05，**代表P＜0.01，***代表P＜0.005和****代表P＜0.001。

2 結果與分析

2.1 磁場對葡萄糖冷卻結晶過程的影響

試驗發現，中等強度穩態磁場對葡萄糖的冷卻結晶有明顯促進作用，表現在晶體析出的比例和質量等多方面，但不同參數的磁場處理會有差異（圖1）。其中，磁場1對葡萄糖的冷卻結晶促進效果相對更明顯。圖1d顯示，經過1 h磁場處理后，葡萄糖晶簇的析出孔數比例明顯高于對照組，2種磁場下的晶簇析出比例分別為對照組的2.42倍（磁場1）和2.15倍（磁場2）。同時，在磁場下葡萄糖單孔析出的晶體質量也明顯高于對照組（圖1e），分別約為對照組的1.94倍（磁場1）和1.46倍（磁場2）。利用顯微鏡成像對3種結晶條件下的晶體析出情況進行對比和分析，圖1f為3種結晶條件下的典型照片，結果表明，與對照組相比，磁場下的晶體析出明顯更密集更多。

2.2 磁場對葡萄糖酸鈣冷卻結晶過程的影響

磁場同樣也影響了葡萄糖酸鈣的冷卻結晶過程。首先，選取一系列質量濃度的葡萄糖酸鈣溶液進行冷卻結晶的嘗試（圖2a），發現經過36 h后，質量濃度為0.115 2 g/mL的葡萄糖酸鈣溶液晶簇的析出比例最高，且在多次試驗中重復性較好，因此，選擇這一質量濃度進行后續磁場結晶試驗。

在磁場下12 h后，如圖2b所示，僅有磁場1的條件下觀察到了晶簇的析出，析出孔數的比例約為90%，而對照組和磁場2均無晶簇明顯析出。圖2c所示的單孔晶體質量與晶簇析出比例類似。在磁場下處理24 h后，如圖2d所示，對照組、磁場1組和磁場2組的晶體析出比例約為81%、100%和90%，磁場1組和磁場2組分別約為對照組的1.23倍和1.11倍，加磁兩組單孔晶體的質量比對照組高約78%和43%（圖2e）。

圖2 磁場對葡萄糖酸鈣冷卻結晶的影響Fig. 2 Effect of magnetic field on cooling crystallization of calcium gluconate

2.3 磁場對氯化鈉蒸發結晶過程的影響

因為氯化鈉的溶解度隨溫度變化較小，根據以往文獻報道［17］和前期試驗，我們決定采用自然蒸發法對氯化鈉溶液進行結晶，因此，首先需要了解磁場是否會對氯化鈉溶液的蒸發過程產生影響。由圖3可知，在12 h的蒸發過程中，與對照組無外加磁場相比，磁場1對去離子水和2種不同質量濃度（0.10 g/mL和0.28 g/mL）的氯化鈉溶液的水分蒸發均顯示出很強的促進作用，磁場下的蒸發量分別約為無外加磁場對照組的1.17倍、1.17倍和1.15倍，但磁場2的效果則相對較為微弱。試驗中低質量濃度蒸發速度比高質量濃度蒸發速率快的現象也符合“拉烏爾定律”。

圖3 磁場對氯化鈉溶液蒸發量的影響Fig. 3 Effect of magnetic field on the evaporation of sodium chloride solution

隨后，對磁場是否影響氯化鈉蒸發結晶過程進行了研究，選擇了0.10 g/mL和0.28 g/mL兩種不同的氯化鈉溶液。如圖4所示：加磁處理6 h和12 h后，無論是低質量濃度還是高質量濃度的氯化鈉溶液的單孔晶體析出數量都無顯著性差異；但在磁場下析出的晶體體積普遍比無外加磁場析出的相對要大，導致了單孔析出晶體的質量增加。如圖4c、4f所示：在加磁場處理12 h后，低質量濃度氯化鈉加磁組析出晶體質量遠高于對照組，磁場1和磁場2中單孔晶體析出質量分別約為對照組的4.58倍和3.11倍；高質量濃度氯化鈉加磁組的效果稍弱，分別為無外加磁場對照組的1.19倍和1.47倍。

圖4 磁場對氯化鈉蒸發結晶的影響Fig. 4 Effects of magnetic field on evaporative crystallization of sodium chloride

3 討論

磁場影響葡萄糖和葡萄糖酸鈣結晶主要體現在單孔析出的晶體比例和晶體析出質量等方面。單孔析出的晶體比例與晶核的形成率相關，而晶體析出的質量一定程度上取決于晶體生長的過程。一般來說，晶核的形成率由晶核的“臨界尺寸”、“表面能”和“過冷度”等因素共同決定［18-20］。磁場可能會在一定程度上提高溶液中葡萄糖和葡萄糖酸鈣的有序性，從而增加其晶核的形成效率。同時，據文獻報道，磁場還可能影響溶液的黏度和渦流，從而影響結晶速度［19］，這可能是在磁場下葡萄糖和葡萄糖酸鈣晶體析出的數量和質量均增加的原因之一。需要指出的是，結晶過程是一個非常復雜的過程，磁場并不是單一的影響因素或者主要影響因素，且不同的磁場參數對結晶過程的影響也有差異。

磁場影響氯化鈉蒸發結晶的其中一個重要因素是蒸發量。據已有文獻報道，磁場處理導致溶液表面張力減小，從而使得氣泡核化勢壘降低，其臨界半徑也減小，促進了更小的氣泡的汽化，從而提高了溶液的蒸發速率［10，21］。但從我們的試驗來看，不同參數的磁場對溶液蒸發量的影響是不同的，這充分說明了其機理的復雜性。

根據磁場對氯化鈉蒸發結晶影響的試驗，從晶體析出質量來看，磁場對低質量濃度和高質量濃度氯化鈉溶液的蒸發結晶都有促進作用，但對低質量濃度氯化鈉溶液的效果更強。這一結果和圖3所示是一致的。如前所述，磁場1加速了溶液的蒸發，使得溶液更早地到達過飽和狀態并析出晶體，而磁場2僅對高質量濃度溶液的蒸發有加速作用，從而促進晶體的析出。同時，磁場處理還將導致溶液渦流增強和黏度降低，這種磁場效應對低質量濃度溶液作用更為明顯。因此，對于氯化鈉溶液的蒸發結晶來說，在低質量濃度下磁場1組受到磁場和蒸發的雙重作用，從而析出結晶效果更強；而在高質量濃度下，磁場2組的結晶效果更強。

綜上所述，本研究以葡萄糖、葡萄糖酸鈣和氯化鈉3種物質為例，使用2種不同磁感應強度的中等穩態磁場（靜磁場），研究了磁場對溶液的冷卻結晶和蒸發結晶過程的影響。研究結果表明，磁場對以上3種物質的結晶均有促進作用，但不同參數的磁場對不同物質的結晶過程影響程度不同。磁場對結晶過程的影響為我們進一步研究磁場對生物相分離的影響，以及磁生物學效應的機制提供了新的視野。此外，靜磁場具有高效、節能、環保的優點，因此，利用靜磁場提高結晶的效率和產量，對于制藥和工業生產也具有現實意義，在深入研究后于未來有望被廣泛應用于制藥和各種工業結晶工藝中。