Bacillus coagulans X3角蛋白酶的酶學性質 及其應用研究

雷 平，尹紅梅，陳 薇，吳民熙，郭照輝，劉惠知，劉 標*

（1. 湖南省微生物研究院，長沙 410009；2. 湖南省農用微生物應用工程技術研究中心，長沙 410009）

隨著我國畜禽規模養殖的發展，飼用蛋白質原料的需求量持續增加，同時又產生了大量的角蛋白廢棄物，如羽毛。如果能采用適宜方法水解利用這些角蛋白廢棄物，以部分代替畜禽日糧中的蛋白質原料，不僅可解決環境污染的問題，還將產生較大的經濟效益［1-2］。角蛋白含有大量的二硫鍵，結構穩定，不易被動物消化道中的蛋白酶（胃蛋白酶、胰蛋白酶等）降解，動物消化率極低，需要處理后才能應用［3-4］。采用傳統方法（如高溫高壓法、膨化法、堿性水解法）加工角蛋白廢棄物存在能耗高、二次污染、營養損失嚴重等問題，而利用微生物或角蛋白酶處理具有操作簡單、成本低、不會破壞氨基酸等優點，是最有前景的替代方法之一［2，5-7］。

目前已報道了較多能夠產生角蛋白酶的微生物［8］，由于微生物的來源不同，其產生的角蛋白酶酶學性質差異很大。如地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）PWD-1分泌的角蛋白酶最適反應pH為7.5，最適反應溫度為50℃［9］，而高溫放線菌（Thermoactinomyces）CDF分泌的角蛋白酶最適pH為11.0，最適反應溫度為80℃［10］。金屬離子對不同來源角蛋白酶活性的影響也不同，如Cu2+對擬蕈狀芽孢桿菌（Bacillus paramycoides）Gxun-30分泌的角蛋白酶有顯著的抑制作用［11］，但10 mmol/L的Cu2+可使蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）DHW-06相對角蛋白酶活力提高120%［12］。

課題組在前期研究中獲得了1株可高效降解角蛋白廢棄物的凝結芽孢桿菌（Bacillus coagulan）X3，其產生的角蛋白酶的酶學性質尚不明晰，應用工藝條件有待進一步明確。因此，本研究對該菌株粗酶液的酶學性質及降解羽毛角蛋白的效果進行了測試，以期為其實際應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

凝結芽孢桿菌（Bacillus coagulan）X3菌株由本課題組篩選獲得并保存。

1.1.2 培養基

種子培養基（g/L）：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，pH 7.0。

發酵產酶培養基（g/L）：羽毛15.0 g，K2HPO40.5 g，KH2PO40.5 g，NaCl 0.5 g，pH 7.0。羽毛從家禽屠宰場收集，用蒸餾水洗凈，60℃烘干至恒重。

1.2 方法

1.2.1 發酵粗酶液的制備及角蛋白酶活性的測定

1.2.1.1 發酵粗酶液的制備

將菌株X3接種至種子培養基中培養24 h制備種子液，以體積分數為2%的接種量接種到發酵產酶培養基中，35℃、200 r/min培養72 h，發酵液經10 000 r/min離心10 min后去除沉淀，收集上清液。向上清液中添加飽和度為40%的硫酸銨，4℃過夜鹽析，10 000 r/min離心10 min收集沉淀，用蒸餾水復溶，利用透析袋透析去除殘留的銨離子，獲取粗酶液。

1.2.1.2 角蛋白酶活性測定方法

取適當稀釋的粗酶液500 μL與500 μL用Tris-HCl緩沖液（50 mmol /L，pH 8. 0）稀釋的 1%角蛋白溶液混勻，50℃水浴1 h，加入500 μL 0.4 mol/L三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）溶液終止反應，對照組在反應前先加入TCA溶液。10 000 r/min離心10 min后，吸取500 μL上清液，依次加入2.5 mL 0.4 mol/L Na2CO3溶液和0.5 mL福林酚試劑，50℃反應20 min，660 nm處檢測吸光值。一個酶活單位定義為每分鐘催化水解角蛋白產生1 μg酪氨酸所要的酶量。

1.2.2 粗酶液的酶學性質分析

1.2.2.1 粗酶液的最適反應溫度及熱穩定性的測定

反應溫度分別設定為20、30、40、50、60、70、80、90℃，測定不同反應溫度下的酶活力，以試驗組中最大酶活力定義為100%，確定其他試驗組的相對角蛋白酶活力。每組處理設置3個重復試驗，下同。

將粗酶液分別在70、80、90℃的條件下保溫2、4 h后，測定不同溫度處理后的剩余酶活力，以未經處理的初始酶液為對照，活性設為100%。

1.2.2.2 粗酶液最適反應pH的測定

分別配制pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0的不同緩沖液：檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（0.1 mol/L，pH 4.0～7.0）、Tris-HCl緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.0～8.0）、甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液（0.1 mol/L，pH 9.0～10.0）、KCl-NaOH緩沖液（0.1 mol/L，pH 11.0）。將角蛋白底物溶于其中，在最適酶反應溫度下進行試驗。以試驗組最大酶活力為100%，確定其他試驗組的相對角蛋白酶活力。

1.2.2.3 金屬離子對粗酶液活性的影響

在反應體系中分別加入低濃度（5 mmol/L）和高濃度（20 mmol/L）的Na+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Fe3+、Cu2+、Mn2+、Ni2+，室溫下放置1 h后，在最適反應溫度下測定角蛋白酶活性。以不加金屬離子的處理為對照，酶活設為100%，計算各處理組的相對酶活力。

1.2.2.4 化學試劑對粗酶液活性的影響

蛋白酶抑制劑：苯甲基磺酰氟（phenyl methyl sulfonyl fluoride，PMSF，10 mmol/L）、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetra acetic acid，EDTA，10 mmol/L）；還原劑：二硫基蘇糖醇（dithiothreitol，DTT，10 mmol/L）、β-巰基乙醇（10 mmol/L）；表面活性劑：十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS，1%）；有機溶劑：二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，1%）。依次向酶液中添加上述化學試劑，常溫下保持1 h后，在最適反應溫度下測定酶活性。以添加蒸餾水處理組為對照，酶活性設為100%，計算各處理組的相對角蛋白酶活力。

1.2.3 粗酶液水解羽毛角蛋白的應用

將粗酶液與雞羽毛在最適反應條件下（60℃、pH 8.0）混合反應6 h，取反應上清液以1∶5的體積比與5%磺基水楊酸均勻混合，4℃、12 000 r/min離心15 min，收集上清液并用0.22 μm濾膜過濾，利用全自動氨基酸分析儀（日立L-8900）分析游離氨基酸的組成。同時，將降解前后的羽毛用無菌水沖洗后烘干，利用掃描電鏡觀察粗酶液對其降解效果。

1.2.4 數據處理與分析

試驗數據利用軟件SPSS 25.0和Microsoft Excel 2007進行統計分析和作圖。圖表中的數據為平均值±標準差（±s），采用One-way ANOVA方法對不同處理間的差異顯著性進行分析。

2 結果與分析

2.1 凝結芽孢桿菌 X3所產角蛋白粗酶液的酶學 性質

2.1.1 最適反應溫度和熱穩定性

圖1a結果顯示：菌株X3產生的角蛋白粗酶液在60℃以下時，酶活性隨著反應溫度升高而逐漸增加；60℃時酶活性達到最大值，此后隨著反應溫度升高酶活性顯著下降。熱穩定性結果顯示（圖1b）：粗酶液在70、80℃條件下分別處理4 h后仍能保留95.0%、86.7%的殘余酶活性，說明菌株X3產生的角蛋白酶熱穩定性較好；但在90℃條件下處理4 h后，殘余酶活性僅為37.5%，可能是酶蛋白結構在過高溫度下遭到了破壞。

圖1 菌株X3粗酶液的最適反應溫度（a）和熱穩定性（b）Fig. 1 Optimal temperature (a) and thermal stability (b) of crude enzyme from strain X3

2.1.2 最適催化反應pH

如圖2所示：菌株X3的粗酶液在pH 4.0、5.0的條件下，相對角蛋白酶活力較低，僅為14.2%、31.8%；調節反應體系pH 在7.0～10.0范圍內時，均顯示出較高的酶活性，其中在pH 7.0～8.0時相對酶活力達到最高值；當pH增大至11.0時，相對酶活性又顯著下降。試驗結果表明，菌株X3的粗酶液在微堿性環境中能發揮最大的催化角蛋白降解活性。

圖2 菌株X3粗酶液的最適反應pHFig. 2 Optimal pH of crude enzyme from strain X3

2.1.3 不同金屬離子對粗酶液活性影響

由表1可知，不同類型金屬離子對粗酶液角蛋白酶活的影響差異較大。Ca2+和Mn2+對粗酶液角蛋白酶活力具有顯著的促進作用，其中Mn2+的促進作用較強，20 mmol/L的Mn2+可使相對酶活力達125%；不同濃度的Cu2+、Ni2+對角蛋白酶活性有較強的抑制作用，而Na+、Mg2+、Fe3+對角蛋白酶活性無顯著影響；Zn2+對酶活性的影響與使用濃度有關，濃度為5 mmol/L時對酶活性產生較強抑制作用，提高濃度至20 mmol/L時則有促進作用。

表1 金屬離子對粗酶液活力的影響Tab. 1 Effects of metal ions on keratinase activity of crude enzyme

2.1.4 化學試劑對粗酶液活性影響

如圖3所示：反應體系中加入蛋白酶抑制劑PMSF、EDTA對酶活性有較強的抑制作用，相對酶活力僅為30.8%、41.8%；而β-巰基乙醇和DTT對酶活性有顯著的激活作用，分別使相對酶活力提高至123.4%和129.2%；SDS和DMSO對酶活性沒有顯著影響。

圖3 化學試劑對X3粗酶液角蛋白酶活性的影響Fig. 3 Effects of chemical reagent on the keratinase activity of strain X3

2.2 凝結芽孢桿菌X3粗酶液的應用效果

Bacillus coagulasX3粗酶液水解羽毛6 h后，大部分羽小枝被降解，羽軸變軟，空間結構被分解（圖4）。水解產物的游離氨基酸組成如表2所示，水解前共檢測到17種游離氨基酸，水解后增加到18種（增加的種類為半胱氨酸），游離氨基酸的含量從0.035 3 mg/mL提高至4.322 6 mg/mL。降解產物中所有種類氨基酸的含量均有較大程度的增加，其中含量較高的氨基酸為纈氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、谷氨酸等。結果表明，X3的粗酶液可提高羽毛角蛋白的營養價值，能有效改善動物對降解產物的吸收利用。

圖4 X3粗酶液水解羽毛掃描電鏡觀察Fig. 4 SEM analysis of chicken feather degradation by crude enzyme of X3

表2 羽毛酶解液中游離氨基酸組成Tab. 2 Free amino acid composition in feather degradation broth

3 討論

大部分來源于微生物的角蛋白酶最適反應溫度在35～70℃之間，少部分來源于熱泉中的角蛋白酶最佳溫度為100℃，這均與來源微生物的生存環境有關［13］。菌株X3從畜禽糞便堆肥高溫期樣品中分離獲得，其粗酶液最適反應溫度為60℃，與堆肥高溫期溫度范圍相吻合。大部分微生物角蛋白酶是中性或堿性蛋白酶，最適pH 在7.0～9.0之間，菌株X3所產角蛋白酶最適pH與目前文獻報道類似［13］。本研究中，Ca2+對酶活性具有顯著的促進作用，這與已報道的Bacillus paramycoidesGxun-30［11］、Bacillus cereusDHW-06［12］、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）KS12［14］結果一致，但與菌株耐輻射奇異球菌（Deinococcus actinosclerus） RM［15］結果相反；Cu2+可強烈抑制菌株X3粗酶液的角蛋白酶活性，這一結果與菌株Gxun-30、KS12相同［11,14］，但文獻報道菌株DHW-06、RM分泌的角蛋白酶可被Cu2+激活［12,15］；其他金屬離子對菌株X3酶活性的影響也與其他已報道菌株不完全一致。結果表明，同種金屬離子對不同微生物來源角蛋白酶活性的影響差異較大。目前已報道的角蛋白酶均屬于金屬蛋白酶或絲氨酸蛋白酶家族［16-19］。本研究中常見的絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF可抑制X3的酶活力，表明該菌株所產生的酶可能屬于絲氨酸蛋白酶類。角蛋白降解的關鍵步驟是二硫鍵的斷裂，還原劑β-巰基乙醇和DTT可顯著提高X3的角蛋白酶活性，可能是因為還原劑能夠催化二硫鍵的斷裂，有助于角蛋白的水解。

X3粗酶液降解羽毛角蛋白產物中的游離氨基酸種類豐富、含量高，說明其在廢棄角蛋白飼料化利用方面具有一定的應用潛力。降解產物中的主要氨基酸為纈氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、谷氨酸，這與菌株貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）NLG1［20］降解羽毛產物的氨基酸組成類似，但與放線菌（Thermoactinomyces）YT-06降解產物組成有差異（主要氨基酸為甘氨酸、纈氨酸和天冬氨酸）［21］，這說明不同來源的角蛋白酶性質不同，對底物作用位點不同，導致游離氨基酸的組成和含量有差異。