核黃素對IL-17A-/-氟中毒小鼠腎臟纖維化的影響

程陳凱，楊 威，李 想，楊 婕，王俊東，張建海

（山西農業大學動物醫學學院，太谷 030801）

氟在自然界中分布廣泛，主要應用于工業、農業和醫藥領域［1］。過量攝入氟不僅會導致氟斑牙和氟骨癥，還會損害肝臟、腎臟、腸道等軟組織［2-5］。腎臟是機體主要的排泄器官，氟主要通過尿液排出體外，易加重對腎臟的損傷。核黃素（riboflavin）是黃素腺嘌呤二核苷酸的中心成分，其在細胞功能、生長發育和能量代謝中起著關鍵作用［6-7］。王國光等［8］發現，核黃素可以通過抗氧化作用來實現延緩鏈脲佐菌素誘導的糖尿病腎病的發展進程。白細胞介素-17A（interleukin-17A，IL-17A）是一類促炎細胞因子，主要參與機體的炎癥反應，在自身免疫性疾病中發揮重要作用［9］。實驗室前期的研究證實，IL-17A在氟中毒所致的小鼠肝臟、睪丸和腸道等組織損傷中起重要作用［4，10］。因此，本試驗構建了核黃素干預IL-17A-/-氟中毒小鼠的模型，通過蘇木精-伊紅（hematoxylineosin，HE）染色、馬松（Masson）染色，以及血清腎臟功能指標肌酐（creatinine，Cr）、尿酸（uric acid，UA）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）的檢測，探究核黃素在正常和IL-17A-/-氟中毒小鼠腎臟纖維化中的影響，為氟中毒的診斷和干預提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

氟化鈉、苯胺藍、酸性品紅、麗春紅、磷鉬酸購自天津市化學試劑三廠；核黃素磷酸鈉購自北京國藥集團化學試劑有限公司；HE試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；Cr、UA、BUN試劑盒購自南京建成生物公司。冰醋酸、無水乙醇等均為實驗室常規試劑。

1.2 試驗動物及分組

選取體重相近的6周齡的野生型（wild type，WT）和IL-17A-/-C57BL/6J雄性小鼠（Mus musculus），各32只，分別分成4組，每組8只小鼠：1）對照組（Ctrl，0.9% NaCl）；2）氟化鈉組（NaF，24 mg/kg NaF）；3）核黃素組（Ribo，5 mg/kg 核黃素磷酸鈉）；4）氟化鈉+核黃素組（NaF+Ribo，24 mg/kg NaF+ 5 mg/kg核黃素磷酸鈉）。每組小鼠進行連續灌胃90 d。

1.3 樣本采集和前處理

采集血液，離心取上清液保存于-80℃冰箱，用于 Cr、UA、BUN的檢測。每組取3只小鼠的左腎固定于4%多聚甲醛溶液，用于組織形態學和纖維化的檢測。

1.4 腎臟臟器指數測定

稱取小鼠的體重和腎臟的質量，計算腎臟臟器指數：臟器指數=臟器濕重（g）/體重（g）×100%。

1.5 HE染色

腎臟組織包埋切片后，蘇木精染液染色1 min，鹽酸酒精分化1 min，伊紅染液染色3 min，梯度酒精脫水，利用二甲苯使之透明后封片，在光學顯微鏡下鏡檢觀察腎臟形態學變化。

1.6 Masson染色

腎臟組織包埋切片后，用Weigert鐵蘇木素染液染色7 min，充分水洗分化，麗春紅酸性品紅復合液染色1 min，磷鉬酸分化7 min，苯胺藍染液倒進倒出，1%冰醋酸分化1 min，梯度酒精脫水，利用二甲苯使之透明后封片，在光學顯微鏡下鏡檢觀察腎臟纖維化狀況。

1.7 血清腎臟功能指標檢測

使用試劑盒對小鼠血清中的腎臟功能指標（Cr、UA、BUN）含量進行測定，所有操作嚴格按照試劑盒說明書操作進行。

1.8 數據處理

采用GraphPad Prism 8軟件進行數據統計，數據用平均數±標準差（±s）表示。差異顯著性利用one-way analysis of variance（ANOVA）進行分析，*P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 核黃素對IL-17A-/-氟中毒小鼠腎臟臟器指數的影響

各組小鼠腎臟臟器指數如圖1所示，在核黃素干預氟中毒90 d之后，無論是WT小鼠，還是IL-17A-/-小鼠，各組之間的腎臟臟器系數均沒有明顯差異（P＞0.05）。

圖1 核黃素對IL-17A-/-氟中毒小鼠腎臟臟器指數的影響（n=8）Fig. 1 Effects of riboflavin on kidney coefficient of IL-17A-/- mice induced by fluoride (n=8)

2.2 核黃素對IL-17A-/-氟中毒小鼠腎臟組織形態學的影響

各組小鼠腎臟組織形態變化如圖2如示，在WT小鼠中，Ctrl組腎小球的結構清晰完整，腎小管排列較為整齊，基底膜完整和突出，管腔間隙正常，沒有明顯的組織病變發生。NaF組中腎小球結構變大且變得模糊，腎小管上皮細胞排列紊亂、管腔變窄。Ribo組腎小球結構清晰，腎小管上皮細胞排列緊湊且有規律。NaF+Ribo組中的腎小球結構變得清晰，腎小管上皮細胞排列變得規則，管腔增寬。而在IL-17A-/-小鼠中，與Ctrl組相比，NaF組腎小球變大，腎小管排列變得紊亂，Ribo組無明顯變化，與NaF組比較，NaF+Ribo組的腎臟結構明顯變得清晰，腎小球變小，腎小管排列整齊，腎臟形態病變得到改善。

圖2 核黃素對IL-17A-/-氟中毒小鼠腎臟組織形態學的影響Fig. 2 Effects of riboflavin on renal histomorphology in IL-17A-/- mice induced by fluoride

2.3 核黃素對IL-17A-/-氟中毒小鼠血清Cr、UA 和BUN的影響

如圖3a所示：在WT小鼠中，與Ctrl組相比，各處理組的血清Cr水平明顯上升（P＜0.05）；在IL-17A-/-小鼠中，與Ctrl組相比，各組之間的血清Cr水平沒有明顯變化（P＞0.05）。如圖3b和3c所示：與WT小鼠Ctrl組相比，NaF組的血清UA和BUN水平均顯著升高（P＜0.05）；而在IL-17A-/-小鼠中，各組之間的UA和BUN水平均無顯著差異（P＞0.05）。

圖3 核黃素對IL-17A-/-氟中毒小鼠腎臟功能的影響（n=6）Fig. 3 Effects of riboflavin on renal function of IL-17A-/- mice induced by fluoride (n=6)

2.4 核黃素對IL-17A-/-氟中毒小鼠腎臟纖維化的影響

Masson染色可以直觀反映出小鼠腎臟纖維化的程度，膠原纖維呈藍色，肌纖維和胞質呈紅色。由圖4可知，在WT小鼠中，Ctrl組小鼠腎臟組織腎小球、基底膜結構完整，纖維化程度低。與Ctrl組相比，NaF組出現大面積的藍染，膠原纖維沉積較多，呈現纖維化，而Ribo組以及NaF+Ribo組未出現大面積藍染明顯的膠原沉積現象，纖維化程度較輕。在IL-17A-/-小鼠中，與Ctrl組相比，NaF組的藍色膠原纖維沉積較多、纖維化程度加重，Ribo組無明顯變化，與NaF組相比，NaF+Ribo組中的藍色膠原沉積減少，纖維化程度減輕。與WT小鼠相比，IL-17A-/-小鼠各組的膠原纖維沉積減少，腎臟纖維化程度降低。

圖4 核黃素對IL-17A-/-氟中毒小鼠腎臟組織纖維化的影響Fig. 4 Effects of riboflavin on renal fibrosis in IL-17A-/- mice induced by fluoride

3 討論

腎臟纖維化是腎臟功能逐漸損傷到喪失的一個過程。氟可以引起機體氧化應激，導致腎臟纖維化［11］。作為一種廣泛存在的維生素，核黃素具有強的抗氧化作用，而IL-17A在腎臟纖維化過程中起著關鍵的作用［6,12］。我們構建核黃素干預IL-17A-/-氟中毒小鼠模型，探究核黃素在氟致腎臟結構功能損傷及纖維化中的潛在保護作用。

腎臟的臟器指數是反映腎臟生長發育的一個重要指標。本試驗中，氟、核黃素以及IL-17A-/-均未對腎臟生長發育產生影響。長期氟暴露會損壞腎臟的組織結構［3］。本試驗中，氟暴露同樣引起了小鼠腎臟腎小管排列紊亂和管腔變小等形態學病變。添加核黃素之后，腎小管排列變得整齊，管腔增大，而IL-17A敲除以后，各組的腎臟組織的形態損傷得到緩解，表明核黃素在氟導致小鼠腎臟組織形態損傷中起著重要的緩解作用，且核黃素在IL-17A-/-小鼠中的緩解效果更明顯。

血清中Cr、UA和BUN是臨床上檢驗腎臟功能的常用指標，當腎臟功能受損時，這三個指標含量都會上升［13-14］。研究表明，氟暴露會引起ICR雄鼠Cr、UA、BUN的含量明顯上升［15］。在本試驗中，氟同樣引起了小鼠血清Cr、UA、BUN的上升，而單獨補充核黃素以及氟和核黃素共處理后，也引起了Cr的上升，但是對UA和BUN沒有影響。 Mehrotra等［16］發現IL-17A的活化會加速腎臟的損傷進程。本試驗中，我們發現在敲除IL-17A后，各組小鼠血清之間的Cr、UA和BUN含量均無明顯變化，進一步證明了核黃素在IL-17A-/-小鼠氟中毒引起的腎臟功能損傷中未起到明顯的緩解效果。

Kido等［11］發現SD大鼠（Rattus norregicus）飲用150 mg/L NaF 14 d，可加重單側輸尿管梗阻引起的腎臟纖維化程度。在本試驗中，氟同樣會引起正常小鼠膠原纖維的沉積，誘導腎臟纖維化，這與前人的結果一致。添加核黃素后，膠原纖維沉積減少，纖維化程度降低，表明核黃素能夠減輕氟引起的腎臟纖維化。據報道，IL-17A可以調節各種纖維化信號通路，促進腎臟纖維化的進程［17-19］。本試驗中，敲除IL-17A之后，和WT小鼠相比，各組腎臟纖維化程度減輕，表明核黃素可以緩解氟致IL-17A-/-小鼠的腎臟纖維化程度，且緩解效果要好于野生型的小鼠。

綜上所述，核黃素對氟中毒引起的IL-17A-/-小鼠腎臟組織形態損傷和纖維化程度有著積極的緩解作用，且緩解效果要優于野生型的小鼠，其具體的分子機制值得我們深入研究。