DNA甲基化和組蛋白甲基化修飾的表觀遺傳調控作用研究進展

張淼 楊露露 賈巖龍 王天云

（1.新鄉醫學院藥學院，新鄉 453003；2.新鄉醫學院重組藥物蛋白表達系統國際聯合實驗室，新鄉 453003；3.新鄉醫學院基礎醫學院，新鄉 453003）

表觀遺傳基因調控作用在DNA和組蛋白N末端，對基因表達穩定性起著關鍵性作用。染色質是由真核生物細胞核內的DNA和蛋白質組成，根據致密程度的不同可分為常染色質（euchromatin）和異染色質（heterochromatin）［1］。基因組表觀修飾的主要機制可分為DNA中的甲基化和染色質中組蛋白的轉錄后修飾，DNA的CpG二核苷酸和組蛋白H3賴氨酸9（H3-K9）中胞嘧啶的甲基化是其中兩種重要的表觀遺傳修飾，其高水平狀態是轉錄沉默基因啟動子和組成型異染色質的特征［2］。

DNA甲基化（DNA methylation）是核苷酸胞嘧啶上甲基（CH3）基團的共價修飾，在真核細胞中，基因沉默、DNA甲基化和染色質的結構三者之間相互依存相互影響［3］。例如，CpG甲基化的高水平表達與異染色質區域的形成相關，相比之下，基因組中富含非甲基化CpG的區域，稱為CpG島，與基因啟動子和其他調節功能相關聯，在此區域內它們似乎更有助于轉錄［4］。由于與基因沉默有關，這些CpG島的甲基化區域在癌癥沉默基因中也普遍存在。在染色質的背景下，DNA甲基化與組蛋白修飾都不是獨立存在的，兩者之間存在復雜且緊密的聯系，其中包括組蛋白甲基化、乙酰化和泛素化。已有研究表明，染色質中組蛋白的甲基化狀態會隨著DNA的修飾方式不同和序列的改變而改變，而染色質中組蛋白賴氨酸的甲基化狀態又可能影響DNA自身的修飾［5］。

1 DNA甲基化及其調控

1.1 DNA甲基化修飾及其功能

DNA甲基化是一種在原核和真核生物基因組中常見的復制后表觀遺傳修飾，也是哺乳動物中基因表達的重要調控方式，在基因轉錄抑制方面起關鍵作用［6］。

DNA甲 基 轉 移 酶（DNA methyltransferase，Dnmt）具有催化和維持的作用，其主要分為兩種類型，一種是DNA的兩條鏈都未發生甲基化，而在DNA甲基轉移酶的催化下都發生甲基化，稱為新生甲基化。另一種是DNA的其中一條鏈已甲基化，而另一條未甲基化的DNA鏈被甲基化，這種類型稱為保留甲基化。這兩類甲基化過程都需要C5胞嘧啶甲基轉移酶的參與，即是指在S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）作為甲基供體的前提下，胞嘧啶的第5位碳原子被甲基化［7］。哺乳動物細胞中DNA甲基轉移酶主要分為dnmt1、dnmt2、dnmt3a、dnmt3b和 dnmt3l，但只有 dnmt1、dnmt3a和dnmt3b三種酶具有甲基轉移活性。Dnmt1為持續性甲基轉移酶，它主要是參與DNA復制新合成鏈的完全甲基化，dnmt3a和dnmt3b主要參與從頭甲基化，其中dnmt3a主要以自抑制的方式存在［8］。在腫瘤細胞中，抑癌基因的甲基化程度影響其表達從而影響細胞周期，很多癌變組織中dnmt的表達也隨之發生改變，大部分呈上升趨勢［9］。DNA從頭甲基化和DNA甲基化的維持與不同的組織細胞、不同基因的表達有關［10］。作為一種遺傳信息，DNA甲基化既可以傳給后代，又可以表達DNA的亞序列水平。細胞周期調控機制失調的主要原因是由于甲基化漂移，基因沉默或過表達從而影響衰老組織的基因表達［11］。

1.2 DNA甲基化與基因表達調控

DNA甲基化基本上是在胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤（CpG）和非CpG二核苷酸位點的胞嘧啶殘基的碳原子上增加一個甲基（5mC），其功能主要是抑制啟動子區和轉錄起始位點的甲基化，因此在基因表達調控、轉座子的沉默和異染色質的維持方面起著重要作用。相比之下，基因組中富含非甲基化CpG的區域，稱為CpG島，與基因啟動子和其他調控特征相關，它們似乎更有助于轉錄，其特點是此區域的甲基化與基因沉默有關，常在癌癥中存在［12］。有研究表明DNA甲基化啟動基因序列將會導致基因沉默、基因點突變以及影響基因錯配修復［13］。啟動子甲基化與RNA聚合酶有關，若該區域發生甲基化，RNA聚合酶則無法與啟動子結合，從而使目的基因的轉錄受到抑制，表達也受到影響。此外在一些癌變及腫瘤發生過程中，DNA甲基化水平會發生變化并影響基因的表達［14］。增強子是控制基因表達中不含CpG島的關鍵因子，一般認為增強子的DNA甲基化狀態與其活性之間成反比關系［15］。基因上游是通過CpG的甲基化差異區通過招募蛋白使目的基因沉默，基因的下游被DNA甲基化的印記控制區（imprinting control region，ICR）調控，使基因轉錄受到抑制，該區域被稱為沉默子［16］。總體而言，DNA甲基化造成基因沉默的原因大多都是由于轉錄受到抑制從而影響了目的基因的表達，可分為以下3個方面：（1）啟動子區域發生甲基化；（2）基因序列中某位點發生甲基化抑制蛋白的表達；（3）染色體結構由于受到DNA序列的變化從而變得緊密。

dnmt3a和dnmt3b主要作用是合成甲基化酶，而dnmt1則是維持甲基化酶的穩定。研究表明S-腺苷甲硫氨酸SAM和DNA鏈與結構域的結合是通過dnmt3a的催化，其N末端調節結構域主要參與核酸定位和蛋白質的相互作用［17］，其C末端主要催化其活性，調節結構域將核蛋白進行招募并進行染色質重塑。組蛋白修飾及其基因轉錄等研究［18］表明dnmt3a與腫瘤、肝癌、大腸癌等疾病有著密不可分的作用。大多數基因組DNA的低甲基化與癌癥初始階段有關，并且可能有助于癌癥形成。DNA甲基化狀態發生異常可能是由于dnmt3a的蛋白表達發生變化，進而使抑癌基因變為高甲基化狀態，而在敲除相關的dnmt之后，癌細胞的甲基化狀態又會恢復正常，即在腫瘤中DNA甲基轉移酶改變的方式主要由突變、缺失及過表達組成［19］。而癌癥的調節劑miRNA則是通過靶向dnmt3a抑制癌細胞的進展［20］。利用CRISPR/Cas9基因編輯技術敲除dnmt3a酶后，影響蛋白水平并增加了表達穩定性，而其生長特性并未受到影響。有研究表明，通過建立DNA甲基轉移酶dnmt3a缺陷的CHO細胞系觀察到缺陷型細胞對穩定轉染的CHO細胞重組蛋白表達的維持有積極影響［21］。也有研究表明敲除dnmt3a對CHO和HEK293T細胞起積極作用，會降低其甲基化水平，但是對表達外源基因并無積極作用［22］。在CHO細胞中，dnmt3a基因的敲除對細胞的生長無明顯影響，但會影響外源基因的表達；而對于HEK293T細胞來說，dnmt3a基因可能對這兩方面都起著重要作用，該基因的敲除會導致細胞生長延緩以及外源基因的表達水平降低。

2 組蛋白甲基化

2.1 組蛋白甲基化修飾及其功能

在真核細胞中，DNA存在于細胞核的染色質中，核小體是染色質的結構和功能的基本單位，由146-147個堿基對的DNA和一個組蛋白八聚體組成，帶有一個H2A-H2B四聚體和兩個H3-H4二聚體［23］。組蛋白的N末端和C末端被翻譯后修飾，可分為乙酰化、磷酸化、甲基化、糖基化和泛素化［24］。這些轉錄后修飾可以通過影響與DNA結合的組蛋白末端的電荷和結構，從而改變染色質狀態和基因表達。組蛋白甲基化是主要的轉錄后修飾之一，由組蛋白甲基轉移酶（histone methyltransferases，HMTs）催化將甲基轉移到組蛋白的H3和H4的賴氨酸殘基上。作為基因表達的活性或抑制標記，組蛋白的賴氨酸殘基分別可以進行單甲基化、二甲基化和三甲基化（分別為 me1、me2 和 me3）［25］。

2.2 組蛋白甲基化與基因表達調控

組蛋白甲基化在基因表達調控、維持基因組穩定性等方面起著重要的作用。一般來說，甲基化發生在不同的氨基酸殘基上，其中賴氨酸和精氨酸的甲基化的研究較為廣泛，主要催化組蛋白的位點和特異性賴氨酸甲基化［26］。到目前為止，組蛋白H3和 H4的 N末端尾部（H3K4，H3K9，H3K27，H3K36和H4K20）的5個殘基的甲基化，以及組蛋白H3的球狀結構域（H3K64和H3K79）的兩個殘基的甲基化已經被功能性表征［27］（表1）。H3K4、H3K36和H3K79被認為是活躍標記，它們占據染色質中活躍轉錄的基因區域，H3K9、H3K27和H4K20被稱為抑制標記，通常與沉默的基因表達和濃縮的染色質有關［28］。H3K4甲基化在增強子區、啟動子區和轉錄起始位點（TSSs）高度富集，在卵母細胞中，H3K4me3調控癌基因和抑癌基因的結構域為非典型排列方式［29］。H3K9甲基化通常與基因阻遏和異染色質形成有關，H3K27甲基化通常被認為是基因抑制的標志，通過啟動子和增強子的富集，H3K27me3對相關基因的抑制起重要作用［30］。H3K36甲基化通常被認為是基因間和基因內區域富集的活性標記。在人類細胞中，通過H3K9甲基化和轉錄延伸的相互作用保持基因轉錄后被抑制的染色質狀態。在基因間區，H3K36me2還可以招募dnmt3a來調控DNA甲基化的建立和維持，H3K79甲基化在編碼區富集，并與活性轉錄相關，H4K20甲基化是組蛋白修飾的抑制標志［31］，H4K20me1標記了低轉錄基因的編碼區，并在細胞分裂過程中積累在親代核小體中。多種證據表明H4K20甲基化與基因組穩定性、DNA損傷反應、染色質壓縮、DNA復制和核小體翻轉有關［32］。總的來說，組蛋白賴氨酸甲基化對細胞的發育和增殖起著關鍵性作用。

表1 組蛋白甲基轉移酶及其在組蛋白上賴氨酸的靶向位點Table 1 Targeting sites of histone methyltransferase and its lysine on histone

精氨酸甲基化由蛋白質精氨酸甲基轉移酶（protein arginine methyltransferase，PRMTs）的酶家族催化，所有成員都能夠將精氨酸單甲基化。但根據二甲基化的類型，它們被分為兩類：Ⅰ型（PRMT1、3、4、6、8）不對稱二甲基精氨酸和Ⅱ型（PRMT5、7、9）對稱二甲基精氨酸［33］。H3R2、H3R8、H3R17、H3R26、H4R3和H2AR3是已知的體內PRMT靶標，相同精氨酸的對稱或非對稱甲基化可以標記不同的染色質區域，精氨酸甲基化在染色質結構和轉錄中的功能作用至今仍未被充分研究。此外，精氨酸甲基化的一般水平似乎低于賴氨酸甲基化，這表明基因調控的功能更受限制，而不是染色質形成的一般結構作用［34］。當被PRMT1不對稱甲基化時，H4R3me2作為幾個ER調節基因的轉錄激活標記，并且在體內對于由H3和H4乙酰化標記的開放染色質結構域的建立和維持是必需的［35］。然而，當被PRMT5對稱二甲基化時，H4R3me2反而參與轉錄沉默［36］。H3R8me2和H4R3me2已被證明以 DNA 甲基化依賴的方式調節DNA啟動子活性［37］。

2.3 H3K9甲基化與基因表達調控

H3K9甲基化對基因轉錄起抑制作用，常與異染色質的形成、X染色體失活及Rb介導的基因抑制等有關［38］。H3K9甲基化，特別是二甲基化H3K9me2和三甲基化H3K9me3，通常與基因抑制和異染色質形成相關［39］，H3K9me1也在與活性基因相關的TSSs周圍被檢測到［40］。H3K9me1和 H3K9me2同時存在于細胞質和細胞核中，而H3K9me3僅存在于細胞核中［41］。在哺乳動物細胞中，幾種H3K9甲基轉移酶-SUV39H1/KMT1A、SUV39H2/KMT1B、SETDB1/KMT1E、二聚體G9a/KMT1C-GLP（G9a-like protein）/KMT1D和PRDM家族具有不同的催化活性和靶基因，在不同的細胞中發揮作用［42］。Suv39（suppressor of variegation 3-9）為組蛋白H3第9位賴氨酸的甲基化酶雜色抑制因子3-9被發現是第一個能催化組蛋白賴氨酸甲基化的酶［43］。在哺乳細胞中，suv39在哺乳動物中可分為suv39h1和suv39h2，可使H3K9二甲基化、三甲基化，被催化形成三甲基化的H3K9是異染色質蛋白1（Heterochromatin Protein 1，HP1）停泊位點［44］，suv39h1/2也含有一個染色質域，它們可以被hp1α/β或自身進一步招募，hp1α/β、suv39h1/2和 H3K9me3之間的多重相互作用確保了H3K9me3在異染色質區域的擴散［45］。Suv39h1 被認為參與細胞分化的方式，是調節細胞周期的轉錄因子［46］。Setdb1主要在常染色質區域發揮作用，是唯一能催化H3-K9三甲基化的常染色體HMT，這被認為是中心周圍異染色質的標志，表明Setdb1在連接基因表達的轉錄沉默和局部異染色質形成中的作用［47］，與HP1及其共抑制子KAPI在異染色質的結合，促進H3K9me3生成［48］，同時參與核糖體DNA轉錄和核仁染色質重塑，調控基因的轉錄形成［49］。作用于常染色區的SUV蛋白為G9a，又稱常染色質組蛋白賴氨酸 N-甲基轉移酶 2（Euchromatic histone lysine N-methylase 2，EHMT2），既能夠催化組蛋白H3K9一甲基化和二甲基化，也可催化組蛋白H3K27的甲基化修飾［50］。G9a-GLP主要產生基因表達的抑制作用，通過與不同的DNA結合蛋白直接相互作用來招募靶基因啟動子［51］，調節H3K9的單甲基化和二甲基化。

組蛋白賴氨酸甲基化也與癌癥密切相關。組蛋白甲基轉移酶在腫瘤細胞中，通過甲基化組蛋白發揮重要作用。因此，對組蛋白甲基化轉移的研究具有重要的理論和臨床價值。在胃癌細胞中，小干擾RNA敲低Suv39h2，H3K9me3的富集程度顯著降低，阻斷了轉錄的抑制作用；敲低Setdb2，胃癌細胞中抑癌基因表達增強，胃癌細胞系的增殖、遷移和侵襲顯著降低［52］。有研究結果表明在細胞水平上抑制Suv39h1基因可以促進外源轉基因的表達［53］，可能在各種人類疾病中起作用如致癌基因的急性激活和腫瘤的形成，使用suv39h1和HDAC抑制劑的聯合治療在白血病和癌癥的治療中具有潛在的價值［54］。Setdb1與內源性DNA甲基轉移酶活性相關，與dnmt3a的共表達對于抑制基因的表達至關重要。已經證明mbd1與setdb1相互作用，從而以依賴于DNA甲基化的方式建立了復制偶聯的H3-K9三甲基化模式［55］。也有一些研究報道了組蛋白修飾狀態、甲基化以及去甲基化酶在信號通路途徑中的作用，在非典型的Wnt通路中，setdb1發生磷酸化并產生抑制作用，從而導致H3K9甲基化進而抑制了PPARγ對其目的基因的激活，這都是由于Wnt5a激活 NLK（Nemo-likekinase）［56］。在肺癌結腸癌等一些癌癥患者中發現，高表達setdb1后病人恢復較差，這可能是由于setdb1能夠促進癌細胞的生長，然而癌細胞的侵襲能力、增殖能力、轉移能力也會隨著下調setdb1后顯著降低［57］。G9a在癌細胞中主要以過表達的形式存在，下調G9a則可抑制癌細胞的生長，上調則加快乳腺癌細胞和肺癌細胞的轉移［58］。

3 DNA甲基化與組蛋白甲基化協同作用

從真菌到人類的真核生物中，組蛋白甲基化和DNA甲基化都與基因沉默有關，尤其是組蛋白H3K4me的缺失和H3K9甲基化。H3K9甲基化的發生可能是DNA甲基化的前提［59］。有研究表明DNA甲基化可能在賴氨酸甲基化過程中起積極作用，甲基化的CpG連接蛋白（methyl-CpG binding domain，MBD）使組蛋白去乙酰化酶的復合物聚集，染色體上組蛋白被高度乙酰化，甲基化的組蛋白末端可募集 DNMTs，使基因轉錄受到抑制［60］。在研究甲基CpG結合蛋白的同時發現，除了與甲基化CpG二核苷酸特異性結合之外，這些蛋白還與多種不同的染色質修飾酶結合，包括組蛋白去乙酰化酶和組蛋白賴氨酸甲基轉移酶，像DNA甲基化一樣，H3K9me通常與轉錄抑制的基因調控元件和基因組的異染色質區有關［30］。Suv39h1/2是通過它們的酶定位H3K9me3在著絲粒周圍異染色質上建立DNA甲基化所必需的，Dnmt3a/3b通過與HP1直接相互作用而被招募到H3K9甲基化的異染色質中，這二者的關系主要歸因于MBD1蛋白和setdb1甲基轉移酶，這種相互作用為確保復制偶聯染色質組裝期間H3K9甲基化的正確位置，被認為在DNA復制過程中在異染色質H3K9甲基化的正確維持中起著重要作用［61］。Dnmt3a/3b通過與HP1直接相互作用而被招募到H3K9甲基化的異染色質中，HP1通過其染色域與H3K9me3結合［62］。Dnmt3a也可能通過色域蛋白MPP8與常染色質相關的H3K9甲基轉移酶G9a/GLP相互作用［63］（圖1）。

圖1 DNA與H3K9甲基化之間的相互作用Fig.1 Interaction between DNA and H3K9 methylation

4 總結與展望

近年來，許多研究發現DNA甲基化和組蛋白修飾之間的密切聯系，我們開始逐漸解開CpG甲基化是如何建立的這個長期以來的謎團。DNA甲基化與組蛋白甲基化尤其是H3K9甲基化相結合，促進了長期轉錄抑制。然而，對這些表觀遺傳修飾之間相互作用的理解還不全面，接下來主要的挑戰是需要更深入了解表觀遺傳調控在特定情況下沉默特定基因組區域所需的共價組蛋白和DNA修飾的不同狀態，DNA甲基化是否與其他組蛋白修飾之間的聯系。