哺乳動物DNA甲基轉移酶DNMT1和DNMT3結構與功能的研究進展

王晨晨 張凡麗 陳珮琪 翁思瑤 王慧芳 崔小娟，2

（1.湖南科技大學生命科學與健康學院，湘潭 411201；2.湖南科技大學經濟作物遺傳改良與綜合利用湖南省重點實驗室，湘潭 411201）

DNA甲基化是表觀遺傳修飾的重要方式，在基因表達調控、基因組印跡、X染色體失活等事件中發揮了關鍵作用［1-4］。哺乳動物DNA甲基化主要由DNA甲基轉移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）催化甲基從S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）轉移至胞嘧啶第5位碳原子上。哺乳動物DNMTs家族成員主要包括DNMT1、DNMT2、DNMT3A、DNMT3B和 DNMT3L， 其 中，DNMT1、DNMT3A和DNMT3B具有DNA甲基轉移酶活性，因此，該綜述主要針對DNMT1、DNMT3A和DNMT3B展開討論。

DNMTs的結構和功能與機體組織器官的生長發育密切相關，例如，哺乳動物的減數分裂過程高度依賴于DNA甲基轉移酶實現甲基化模式的重塑［5］。在骨折愈合的過程中，DNMT3B缺失誘發軟骨發育缺陷，CXCL12和OPN等血管生成因子表達水平顯著降低，阻礙血管生成、骨重塑等事件的發生［6］。在腫瘤細胞中，腫瘤抑制因子啟動子高甲基化抑制抑癌基因的表達，或癌細胞整體低甲基化誘導基因組不穩定，促進了腫瘤的發生［7-9］。因此，DNA甲基轉移酶在個體發育和疾病發生中發揮了重要作用，本文將對哺乳動物DNA甲基轉移酶的結構特點、DNA甲基化的動態調節以及DNA甲基轉移酶在個體發育和疾病發生中的作用等方面進行綜述，旨在對DNA甲基轉移酶的深入研究和應用奠定理論基礎。

1 DNMTs的結構特征

DNMTs由N端調控域、C端MTase（methyltransferase catalytic domain，MTase）結構域和GK重復序列3部分組成［10］。N端調控域包含多個功能結構域，對DNMTs的轉錄抑制、細胞核定位、位點特異性結合以及酶活性調節至關重要［3，11-16］。DNMT1的N末端主要包括DNMT1相關蛋白1結合結構域（DNMT1-associated protein 1 binding domain，DMAPD）、增殖細胞核抗原結合結構域（proliferating cell nuclear antigen binding domain，PBD）、復制叉靶向序列（replication foci targeting sequence，RFTS）、CXXC 鋅 指結構域和兩個相鄰的溴鄰同源結構域（bromo-adjacent homology，BAH）［16-17］（ 圖1）。DMAPD 是 DMAP1結合結構域，DMAP1是TIP60-p400組蛋白乙酰轉移酶復合物的組成部分，對于維持胚胎干細胞的多能性至關重要［13］。PBD是PCNA結合結構域，有助于DNMT1與DNA復制叉結合，PBD缺失導致DNA復制后甲基化延遲［14，16］。復制叉靶向序列RFTS引導DNMT1結合到DNA復制叉位置，進而與含有PHD和RING指的泛素樣結構域（ubiquitin-like with PHD and Ring finger domains 1，UHRF1）互作，通過UHRF1的SRA結構域識別并結合半甲基化的CpG位點，實現DNA甲基化的維持，在缺乏底物的情況下，RFTS將封閉催化中心，實現DNMT1自抑制機制［16，18-20］。CXXC 識別未甲基化 CpG 位點，通過與RFTS結合或者在DNA與DNMT1之間插入一段高酸性氨基酸序列（CXXC-BAH1自抑制連接子），阻斷DNMT1的活性位點，抑制從頭甲基化［3，18，21］。BAH 結 構 域 包 括 BAH1 和 BAH2，BAH1通過長接頭片段與CXXC相連形成自抑制連接子，有助于CXXC、RFTs介導的DNMT1自抑制，BAH2參與DNMT1的定位和維持甲基轉移酶活性，其與MTase結構域中的靶向識別結構域（Target recognition domain，TRD）相互作用參與酶活性的調節［3，19］。與 DNMT1 不同，DNMT3A 和 DNMT3B 的N端包含PWWP（Pro-Trp-Trp-Pro）和ADD（ATRXDNMT3-DNMT3L）結構域，而DNMT3L和DNMT3C的N端只有ADD結構域［22］（圖1）。PWWP能識別并結合甲基化的組蛋白，介導DNMT3A/3B與染色質結合［5，23-25］。DNMT3A 的 PWWP 突變和缺失導致小鼠異常超甲基化并表現出生長滯后，DNMT3B與靶基因的結合也需要 PWWP 參與［5，26-27］。ADD能特異性結合未甲基化的H3K4（H3K4me0），調節酶的催化活性［15，28-29］。ADD結構域可與自身催化結構域相互作用，阻斷DNA的結合，產生自抑制，而與H3K4me0結合可以破壞ADD結構域和催化結構域之間的互作，自抑制被解除［15，29-30］。

圖1 小鼠DNMTs蛋白家族的保守結構域Fig.1 Conserved domains of mouse DNMTs protein family

C末端MTase結構域是DNMTs催化甲基轉移的核心區域。MTase結構域包含10個不同的基序，其中6個（I、IV、VI、VIII、IX、X）在進化上高度保守，并且在催化過程中有直接作用［10，31］。I、II、III是SAM結合位點，I、X是輔助因子結合位點，IV（PCN）、VI（ENV）、VIII（RxRxR）是底物催化位點［10，31］。PCN中的Cys殘基對靶堿基進行親核攻擊，ENV中的Glu殘基與翻轉堿基相互作用，并將胞嘧啶定位在活性位點，RxRxR中的Arg殘基與酶-堿基復合物的脫質子化有關［11-12，31-32］。VIII和 IX 之間的一段保守程度較低的區域被稱為靶向識別結構域（TRD），負責底物DNA上甲基化位點的識別［33］。DNMT1的C端單獨存在時沒有活性，BAH2與TRD的相互作用可能會導致MTase結構域的錯誤折疊［34-35］。DNMT3A和DNMT3B的C端單獨存在時有活性，且比全長蛋白質的酶活性更高，其催化活性可能受N端調節結構域的變構調節［12，36］。

GK重復序列是一段賴氨酸-甘氨酸二肽重復序列，在進化上高度保守，負責將N端調控域和C端MTase結構域的連接［10］。目前的結構研究表明，GK重復序列不參與酶和DNA相互作用，但GK重復序列具有去泛素化酶USP7（ubiquitin-specific protease7）的結合位點，兩者結合后，阻止DNMT1的泛素化和降解，在DNMT1介導的維持DNA甲基化中起調節作用［37］。研究還表明，GK重復序列可能參與小鼠ES細胞中DNMT1介導的父本印跡控制區的從頭甲基化，說明DNMT1在必要情況下也可參與從頭甲基化［19］。

2 DNMTs與DNA甲基化動態調節

DNA甲基化包括維持甲基化和從頭甲基化（圖2）。維持甲基化依賴于DNA復制過程，識別半甲基化CpG位點，催化甲基轉移到新合成DNA鏈的CpG位點的胞嘧啶碳原子上［12，16］。DNA甲基轉移酶DNMT1主要負責維持甲基化，需要UHRF1、H3K9me2/3等的協同作用，UHRF1可以將DNMT1招募到半甲基化CpG位點，H3K9me2/3介導UHRF1與染色質結合，UHRF1依賴于組蛋白修飾與DNMT1互作來實現維持甲基化的功能［38-40］。從頭甲基化是指在未甲基化的CpG位點建立新的甲基化，主要在未分化細胞中表達，發生在胚胎發育和配子形成時期［41-42］。DNA甲基轉移酶DNMT3A和DNMT3B主要負責從頭甲基化，PWWP結構域通常識別并結合H3K9me2/3，參與DNA甲基化、組蛋白修飾、DNA修復和轉錄調控等多個與染色質相關的生物學過程，ADD結構域特異性結合未甲基化的H3K4，誘導構象發生改變以刺激酶的活性［3，15，24，28，31］。DNA去甲基化途徑分為被動去甲基化和主動去甲基化［2，43］（圖3）。被動去甲基化過程中，參與維持甲基化的DNMT1/UHRF1缺失，或參與從頭甲基化的DNMT3A/3B減少，細胞發生快速去甲基化，基因組甲基化水平顯著降低［2，38，40］；主動去甲基化過程中，10-11易位甲基化胞嘧啶雙加氧酶（ten-eleven translocation methyl cytosine dioxygenases，TETs） 家族蛋白可將5-甲基胞嘧啶（5mC）氧化為5-羥甲基胞嘧啶（5hmC），5hmC可進一步被氧化為5-甲酰胞嘧啶（5fC）和5-羥基胞嘧啶（5caC），TET1/2/3缺失小鼠細胞中 5mC 水平升高［2，16，44］。進一步的研究表明，5fC和5caC可在胸腺嘧啶DNA糖苷酶TDG（thymine DNA glycosylase，TDG）的作用下參與堿基切除修復（base excision repair，BER）途徑，最終形成未被修飾的胞嘧啶［16，45-47］。

圖2 DNA甲基化模式的建立和維持Fig.2 Establishment and maintenance of DNA methylation patterns

圖3 DNA甲基化的動態調節Fig.3 Dynamic regulation of DNA methylation

3 DNMTs的生物學功能

DNA甲基化是一種涉及個體發育和疾病發生的表觀遺傳過程［17，48-49］。DNA甲基化與去甲基化的動態平衡對機體的正常運轉是必需的，這種平衡狀態被破壞會造成DNA甲基化模式紊亂，機體可能面臨早期胚胎發育異常、生殖細胞發生缺陷、學習記憶能力受損、疾病發生等問題［16，31，49-57］。

3.1 DNMTs與個體發育

DNMTs活性的改變導致早期胚胎發育缺陷［1，41，58-59］。研究發現，胚胎干細胞 DNMT1 缺失，基因組發生去甲基化，導致細胞快速死亡［59-60］。DNMT3A突變小鼠胚胎發育幾乎不受影響，但出生時表現出矮小表型，并在 4 周齡時死亡［1，26-27，41］。去除DNMT3B小鼠染色體著絲粒處小衛星重復序列去甲基化，并在妊娠后期死亡［1，58-59］。另外，早期胚胎發育過程中印跡基因甲基化的維持和X染色體的失活也與 DNMTs有關［4，61］。DNMT1 在卵母細胞和早期胚胎發育時期特異性表達，在維持印跡基因甲基化形式中發揮重要作用［61-62］。X染色體失活（X chromosome inactivation，XCI）使雄性（XY）和雌性（XX）之間的X染色體得到劑量補償，防止雌性體內的兩個X等位基因同時發揮作用，從而維持雌性體細胞正常的生長發育［63-66］。長鏈非編碼RNA Xist（X-inactive specific transcript，Xist）的激活是XCI發生的重要原因，甲基化的Xist不能被轉錄，因此活性X染色體通常表現出高甲基化［4，66］。

DNMTs還參與原始生殖細胞（Primordial germ cells，PGCs）甲基化的消除和隨后性別特異性生殖細胞甲基化模式的建立［16-17］。研究表明，維持甲基化缺失是PGCs基因組去甲基化的主要原因，DNMT1和UHRF1參與PGCs中活性DNA的去甲基化［2，38］。在PGCs增殖和遷移過程中，UHRF1蛋白質水平下調，DNMT1不能準確定位到復制叉，維持DNA 甲基化減弱，PGCs發生去甲基化［2，38-40］。生殖細胞特異性的甲基化標記使精子或卵子建立性別特異性甲基化模式［16-17，66］。研究表明，DNMT3A和DNMT3L負責配子發生過程中印跡區域的從頭甲基化，DNMT3A或DNMT3L缺失導致DNA甲基化印跡缺失，并顯示整個基因組的低甲基化［1］。在UHRF1存在的特定條件下，DNMT1具有從頭甲基轉移酶活性［67］。Stella（也稱為Dppa3或PGC7）通過抑制DNMT1和UHRF1介導的異常從頭甲基化來保護卵母細胞甲基化水平，Stella缺失導致卵母細胞甲基化水平升高，阻礙合子基因組激活［68-69］。

3.2 DNMTs與疾病

3.2.1 DNMTs與癌癥 癌癥也稱為惡性腫瘤，腫瘤細胞在惡性轉化過程中通常表現出異常的DNA甲基化模式，具有全基因組低甲基化和局部高甲基化的特點［48，70-71］。腫瘤細胞的全基因組低甲基化，主要發生在基因編碼區和衛星重復區，可能導致有絲分裂重組、拷貝數缺失和染色體重排［48，72］。局部高甲基化主要發生在抑癌基因啟動子區域，研究發現，乳腺癌細胞中DNMT1、DNMT3B過表達分別導致ISL、BRCA1啟動子高甲基化［73-74］。胃癌細胞中DNMT3A、DNMT3B過表達使ADAMTS9、MGMT、CNR1等抑制因子啟動子甲基化水平升高［75-76］。DNMT1、DNMT3A和DNMT3B在酒精性肝病組織和肝細胞癌中均上調［77-78］。以上研究表明，抑癌基因啟動子高甲基化導致的基因表達沉默可能是癌癥發生的重要原因。由于DNA甲基化異常具有重要的致病作用，因此靶向DNMTs的表觀遺傳療法為癌癥患者提供了新的治療途徑［51-52，55，79-81］。

3.2.2 DNMTs與神經系統疾病 DNMTs參與動物的學習記憶和神經系統退行性改變，大腦神經元的低甲基化與成人神經系統發生退行性改變有關［49，82］。研究發現，帕金森病（Parkinson Disease，PD）、阿爾茲海默癥（Alzheimer disease，AD）患者DNA甲基化紊亂，DNMT1功能缺失可能是PD、AD等神經退行性疾病出現異常甲基化的基礎［49，83］。研究表明，有絲分裂后神經元中的DNMT3A是正常記憶形成所必需的，在情景記憶中具有特殊作用［84］。DNMT3B的多態性可以調節環境對認知能力的影響，促紅細胞素可以改善SAMP8小鼠的空間學習和記憶能力［85-86］。研究還發現，恐懼記憶重現使負面情緒遷延不愈，限制了抑郁癥、焦慮癥、創傷后應激障礙等多種精神疾病的治療，而DNMT3A過表達可以阻止恐懼記憶重現，顯著提高治療效果［87］。

3.2.3 DNMTs與其他疾病 除了癌癥和神經系統疾病，DNMTs還與代謝疾病、腎臟疾病、關節疾病等其他疾病有關。研究發現，DNMT1和DNMT3參與脂肪酸或炎性細胞因子誘導的DNA甲基化變化，脂肪細胞DNMT1的缺失會引起脂肪細胞肥大和葡萄糖穩態缺陷，導致肥胖、II型糖尿病及心血管疾病的產生［88-90］。慢性腎臟病中TGF-β信號誘導DNMT1、DNMT3A異常上調，導致Klotho啟動子超甲基化，而阻斷TGF-β信號或DNMT1、DNMT3A活性可以維持腎臟Klotho水平，有效緩解慢性腎臟病和腎臟纖維化［91-93］。骨關節炎小鼠過氧化物酶體增殖物激活 受 體（Peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）明顯下調，DNMT1/DNMT3A異常增多和PPARγ高甲基化可能是PPARγ被抑制的主要原因，PPARγ去甲基化可減輕小鼠骨關節炎程度［94］。

4 總結與展望

近年來，DNMTs及DNMT-底物復合物晶體結構的解析促進了我們對DNMT1維持甲基化和DNMT3從頭甲基化的理解。DNMT1中RFTs、CXXC結構域和DNMT3中ADD結構域介導的自抑制機制保證了各自甲基轉移酶的活性。但在一定條件下，DNMT1可以參與從頭甲基化，DNMT3也可以參與維持甲基化，無催化活性的DNMT3B亞型還可作為其他甲基轉移酶的輔助因子參與從頭/維持甲基化。DNMTs參與DNA甲基化的動態調節，主要體現在DNA復制過程中DNA甲基化的維持、從頭甲基化的建立和去甲基化三個方面，如何通過多種調控機制維持細胞的DNA甲基化動態平衡值得進一步探索。DNMT3A參與記憶形成與調節，異常DNA甲基化在多種疾病的發病機制中起重要作用，靶向DNMTs的小分子藥物有望成為相關難治疾病的新療法。然而，DNMTs在作用機制方面仍面臨許多問題，例如，DNMTs的N-末端結構域是如何協調酶活性和基因組靶向性的？生殖細胞發生過程中印跡基因和性別特異性DNA的甲基化模式的建立是由什么決定的？以DNMTs為靶點的小分子藥物是如何發揮作用的？個體因素是否對藥效有影響？這些問題仍需要進一步研究，而對DNMTs結構和功能的研究將有助于DNA甲基化調控機制的闡明。