曲霉屬的現代分類命名研究進展

劉警鞠 張雨森 陳娟 孫炳達 趙國柱

（1.北京林業大學生物科學與技術學院 林業食品加工與安全北京市重點實驗室，北京 100083；2.中國醫學科學院北京協和醫學院藥用植物研究所，北京 100193；3.中國科學院微生物研究所中國普通微生物菌種保藏管理中心，北京 100101）

曲霉屬真菌分布廣泛，是常見的食品、糧食、環境污染菌，部分種是重要的人體及動物條件致病菌，曲霉也能產生各種酶、有機酸、抗生素、代謝產物，在食品、釀造、醫藥等發酵工業、生物技術中有重要應用［1-8］。黃曲霉（Aspergillus flavus）污染糧食、食品、飼料引起霉變，產生致癌的黃曲霉毒素；煙曲霉（A.fumigatus）對器官移植、艾滋病等免疫缺陷患者引起的感染已超過念珠菌Candida spp.，成為臨床上常見的真菌病原菌之一；而黑曲霉（A.niger）、米曲霉（A.oryzae）是釀酒、制醬、醬油生產等的主要發酵菌種，檸檬酸的生產主要依賴于黑曲霉；土曲霉（A.terreus）發酵產生的次生代謝產物洛伐他汀（lovastatin）等是臨床上降膽固醇預防心臟病的重要藥物；此外，黑曲霉（A.niger）和構巢曲霉（A.nidulans=Emericella nidulans）是基因工程、組學、遺傳學、生物化學、細胞生物學、發酵工程等研究的重要模式生物。

近年來人們對曲霉的開發利用，毒素檢測，曲霉病的防范越來越重視。《國際藻類、菌物、植物命名法規》（簡稱《墨爾本法規》）［9-10］“一個真菌一個名稱（one fungus, one name, 1F1N）” 的規則于 2013年生效，使整個曲霉屬的分類命名系統發生重大變化。了解曲霉的現代分類系統，正確鑒定、系統分類及規范使用名稱，對于曲霉屬真菌的國際國內研究、學術交流，相關行業的開發和應用都非常重要。

1 曲霉屬的近代分類研究歷史

曲霉屬Aspergillus P.Micheli ex Haller最初由Micheli建立，拉丁名稱“Aspergillus”，（源于一種天主教會用來灑圣水的裝置“aspergillum”），用來描述該類真菌產生爆炸頭式（噴灑式）的產孢結構（分生孢子頭）特征。1768年由Haller合格發表，Fries于1832年認可了屬名，灰綠曲霉Aspergillus glaucus（L.）Link（= Mucor glaucus L.） 為 該 屬 模式種。曲霉屬自建立起長期歸屬在無性型的半知菌門（類）。1854年，de Bary首次建立了無性型曲霉屬Aspergillus與其有性型散囊菌屬Eurotium的聯系。Benjamin于1955年將曲霉屬的有性型分為Eurotium、Emericella和Sartorya，隨后對如何處理、描述、命名，分類曲霉及相關有性型一直存在爭議。至《墨爾本法規》生效（2013）之前，曲霉菌的分類研究歷史主要有兩個時期及分類體系［11］。

（1）1985年以前，以Thom-Raper-Fennell為代表的傳統經典分類系統［12-13］。該系統曾廣泛應用，主要以形態分類為依據。認為人們接觸的曲霉絕大部分為無性型，只有少數產生有性子囊孢子繁殖階段，為避免不必要的命名混淆，將最早用來描述無性型的名稱Aspergillus包含了無性型和有性型在內的全部種類，而不承認獨立有性型名稱的地位。在屬與種之間的分類等級使用“群”（group），Raper在專著中，將所承認的150個種及變種劃分為18個群［13］。但這不符合當時的《國際植物命名法規》（斯德哥爾摩法規），即真菌的第一個合格發表的有性型名稱享有優先權。另外，由于“群”不是《國際植物命名法規》中規定的分類術語，不具有正式的分類學地位。因此，該分類體系雖然廣泛應用，但一直存在很大爭議，并被不斷修改和完善［14］。

（2）1985年至《墨爾本法規》生效的2013年之前，曲霉有性型和無性型命名并存，但通常有性型被認為代表全型（holomorph），屬下分亞屬subgenus和組section，分子系統學研究結果在曲霉分類中逐步得到應用。1985年在荷蘭阿姆斯特丹召開的首屆國際青霉和曲霉研討會上認為應把曲霉屬以下分類等級正規化與《國際植物命名法規》一致，為了合法化曲霉屬下的分類單位。同年，Gams等［15］根據形態學及對應有性型特征，引入了“亞屬subgenus”和“組section”的概念和名稱，將曲霉屬分為6個亞屬包含17個組（1個亞屬未分組），對應1965年Raper & Fennell提出的18個群。而有性型另外分別歸入了不同的有性型屬，如Eurotium，Petromyces，Emericella等。

隨著分子系統學技術的飛速發展，從《真菌學詞典》第八版開始［16］，取消半知菌（亞門）類的高等級分類階元，無性型真菌改稱絲分孢子真菌（mitosporic fungi），以無性型為主的曲霉屬Aspergillus也相應按照分子系統發育或對應的有性型歸于子囊菌門（Ascomycota）下，但無性型和有性型名稱仍然可以單獨使用和命名。2000年，Pitt等［17］對曲霉類群進行了修正，接受了184個無性曲霉名稱和70個相應的有性型名稱。2008年，Peterson［18］建立曲霉屬的多基因系統發育樹，發現曲霉屬的有性型屬與無性型的6個亞屬系統發育關系非常密切，Houbraken和 Samson［19］也支持這一觀點。因此，在這一時期無性與有性雖然仍有爭議，但大多仍然可以分別分類命名，各自獨立合法使用，廣義的曲霉大類群包含了無性型曲霉屬Aspergillus及其相關的有性型屬超過10個（表1）。

表1 曲霉原主要的有性型及相關屬的處理Table 1 Treatment of major teleomorph and related genera of Aspergillus

2 《墨爾本法規》對曲霉現代分類命名的影響

2011年7 月，在第18屆（墨爾本）國際植物學大會命名法分會上通過新的《國際藻類、菌物、植物命名法規》（簡稱《墨爾本法規》），與舊法規相比一個重大的變化是修改了第59條規則（article 59），對真菌命名采用“一種真菌，一個名稱”即1F1N（one fungus，one name）的規則，規定從2013年 1月 1日起 1F1N 生效［9-10，20］。這一偉大的變革，具有劃時代的意義，對真菌尤其復型多名稱及無性型真菌影響巨大。法規改變原有性型名稱優先代表全型的規定，真菌的無性型名稱享有與有性型名稱同等的優先權，如果無性型名稱有效發表的時間更早，且被廣泛使用和引用，則該無性型名稱可以被用于表示全型真菌［10］，即一種真菌無論有性無性只保留一個優先合法的名稱。這需要對2013年之前發表的所有曲霉屬Aspergillus及其相關的有性型屬種（上千個）名稱進行全面的唯一性確認和修訂。為此，國際青霉及曲霉專業委員會（InternationalCommission of Penicillium and Aspergillus, ICPA）針對曲霉屬及其有性型屬的處理以及命名問題展開了廣泛討論，審議了多種方案，其中主要三種方案影響比較大。

方案一，將曲霉無論有性還是無性型根據不同的系統發育分支拆分成相應的不同屬，使用每一分支中最古老名稱作為屬名，如有性型的屬名Neosartorya，Emericella，Petromyces等會保留代表不同分支的屬名稱。這個方案優點保留了主要有性型屬名，而缺點在于，會導致一些常見和重要（無性型為主）的種，如黑曲霉A.niger、赭曲霉A.ochraceus、煙曲霉A.fumigatus和黃曲霉A.flavus等因在相應的系統發育分支中并非最早而需要更名，改到相應有性型屬名下。

方案二，在方案一的基礎上做了改善，保留曲霉屬Aspergillus及重要種類，需要重新選擇保留的Aspergillus的模式種（例如A.fumigatus或A.niger）。如果模式種選擇A.niger，則屬名Aspergillus可用于黑曲霉A.niger、黃曲霉A.flavus、米曲霉A.oryzae等，常見重要種類名稱保持不變；其余種類歸為保留的幾個不同有性型名稱的屬，如原有性型的屬Emericella、Neosartorya和Eurotium名稱將分別用于容納原曲霉屬Aspergillus下的不同組sections，如Versicolores、Fumigati和Aspergillus中對應的種。這個方案基于經濟及物種重要性考慮，缺點在于多個屬需重新選擇其他的模式種，有悖于命名法規，導致命名混亂，會引起爭議。

方案三，繼續保留最早的曲霉屬Aspergillus的名稱及模式種灰綠曲霉A.glaucus，將相關的有性型名稱視為Aspergillus聯系在一起的具有生物學意義的結構特征（異名）。如，A.glaucus（原無性型）被保留，則其原有性型名稱蠟葉散囊菌Eurotium herbariorum則被廢棄，但可以描述該種有性型為產生散囊菌型（Eurotium-type）的子囊座（ascomata）；這樣曲霉屬Aspergillus原有性型屬，如Neosartorya、Emericella、Eurotium和Petromyces等及一些相關屬Dichotomomyces、Polypaecilum 和 Phialosimplex將 成為曲霉屬Aspergillus的異名屬。這個方案使得大多數曲霉保留無性型名稱的同時其有性型名稱（異名）能以所代表的特征而出現在Aspergillus名下，有利于命名法的穩定性，便于不同領域人員的使用和理解，得到了ICPA和大多數分類學者的認可，被逐步廣泛采用（http://www.aspergilluspenicillium.org/images / PDF / minutes.pdf）。

對曲霉屬的界定還存在其他的觀點，Pitt和Taylor［21-22］對曲霉及其相近屬之間的系統發育關系研究，認為青霉屬Penicillium是曲霉屬巢狀亞屬（subgenus Nidulantes）的姐妹分支，主張將曲霉屬分成幾個小屬，不同亞屬沿用相關有性型屬名，如將subgenus Nidulantes改為裸胞殼屬Emericella，將subgenus Aspergillus改為散囊菌屬Eurotium。但Samson等［1］認為這種劃分方式會破壞曲霉屬的單系性，引起不必要的名稱改變，堅持將曲霉屬作為一個單系屬，并在屬下劃分不同的亞屬。

3 曲霉屬的分類研究現狀

圍繞《墨爾本法規》的1F1N規則及ICPA的方案，隨后曲霉屬及相關的無性有性屬種的大規模的系統分類修訂展開，新修訂更注重分子系統發育學及多相分類方法的應用。其中最系統代表性工作為荷蘭菌種保藏中心（CBS）的Samson團隊基于收集到的Aspergillus模式菌株（ex-type）系統研究結果［1］。其推薦曲霉的標準現代多相分類方法主要包括：一、分子鑒定及系統發育，測定通用DNA分子條形碼（barcoding）ITS及特定的第二條形碼基因（鈣調蛋白CaM，β-微管蛋白BenA及RNA聚合酶II第二大亞基 RPB2）（表2）［1］；二、形態學特征（基物、標準培養基、菌落、培養條件、分生孢子頭、子囊孢子等）；三、代謝物譜（extrolite）分析（毒素、酶、有機酸、抗生素及其他次級代謝產物）。通過系統發育分析顯示曲霉菌Aspergillus與傳統的9個相關有性型屬為單系分支與青霉菌密切相關；根據《墨爾本法規》1F1N條款及ICPA的意見，接受保留Aspergillus作為曲霉屬唯一合法的名稱，相關有性型屬處理為Aspergillus的異名；重新修訂了屬級分類特征；對已接受尚缺乏曲霉Aspergillus名稱的種引入了5個新名稱，21個新組合；更新了接受的曲霉屬種，包含339種；對于僅有標本，沒有模式菌株或DNA序列條形碼及其他資料信息不全的16種列為排除和懷疑的種。此研究奠定了《墨爾本法規》之后，Aspergillus系統分類修訂研究基礎。

表2 曲霉屬真菌PCR基因片段，引物及相關參數Table 2 Gene fragments，primers and related PCR parameters of Aspergillus fungi

在Samson分類框架下，國內外學者近年來對Aspergillus及其屬下分類單位進行了更為系統的研究，一些基于基因組、代謝物譜、蛋白質譜分析的新技術、新方法也被推薦應用曲霉系統分類、代謝產物篩選預測、致病性分析中，如全基因組測序分析（whole genome sequencing，WGS）、基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption/ionisation time-of-flightmass spectrometry,MALDI-TOF MS）、（超）高效液相色譜結合二極管陣列檢測質譜分析（（ultra）high-performance liquid chromatography coupled with diode array detection and mass spectrometry, UHPLC/HPLC-DAD-MS）等［23-34］。其中Houbraken等［34］根據系統發育分析結合表型、生理型、代謝物結果進行最為系統的總結更新，并在原組section的等級下引入系/族series的等級，認為將曲霉種分配到相應的系series，可以高度預測物種可能具有的功能特征，在使用基于表型的識別時可能是有用的，同時補充Aspergillus從339種［1］到446種［34］，形成了包括亞屬、組、系、種的曲霉屬真菌最新現代分類系統。即Aspergillus為唯一合法屬名，為真菌界（Fungi），子囊菌門（Ascomycota），盤菌亞門（Pezizomycotina），散囊菌綱（Eurotiomycetes），散囊菌亞綱（Eurotiomycetidae），散囊菌目（Eurotiales），曲霉科（Aspergillaceae），曲霉屬（Aspergillus）真菌總稱。灰綠曲霉A.glaucus（L.）Link為曲霉屬模式種，屬下包含6個亞屬（subgenera），曲霉亞屬（subgenus Aspergillus）、環繞亞屬（subgenus Circumdati）、淡黃亞屬（subgenus Cremei）、煙色亞屬（subgenus Fumigati）、巢狀亞屬（subgenus Nidulantes）和多擬青霉亞屬（subgenus Polypaecilum），27個組 sections，75個系 series（附表），全部的有性型及相關屬被處理為Aspergillus的異名或從中移除獨立（表1）［34］。另外，ICPA網站（https://aspergilluspenicillium.org/）上也列出接受的曲霉種，并為每種提供了正確名稱、對應的異名（包括原有性型）、模式（標本）type、模式菌株ex-type（保藏機構菌株編號）、屬于哪一組section、DNA第一條形碼ITS及大部分第二條形碼（BenA，CaM，RPB2）序列注冊號等，非常方便使用者查證和參考。

4 全基因組序列分析（whole genome sequencing，WGS）在曲霉屬研究中的應用

近十年，以Illumina，PacBio為代表的高通量測序技術成熟，其通量高、準確率高、周期短、費用低的特點為真菌全基因組分析提供了強有力的支撐。曲霉一些重要亞屬、組、種類、不同菌株全基因組已獲得（表3），為深入研究曲霉基因組結構特點、遺傳多樣性、系統發育關系、比較致病性、預測或篩選關鍵酶和代謝產物、鑒定特定基因等及曲霉資源開發提供了豐富的信息［30］。

表3 曲霉重要種類的基因組分析情況Table 3 Genomic analysis of important Aspergillus species

2018年，美國科學家對A.arachidicola進行全基因組測序，并通過基因組學比較，推斷出其與A.parasiticus為一個祖先的可能性最大［35］。同年丹麥技術大學、美國聯合基因組研究所（JGI）等機構在Nature Genetics發文，公布了曲霉屬黑色組Nigri大規模基因組測序分析結果，獲得該組完整26個種的基因組概況（包括23個種首次基因組從頭測序）；建立該組種間及種內遺傳圖譜，并利用基因組信息預測了17 903個碳水化合物活性酶（CAZymes）和2 717個次級代謝物基因簇，發現了數千種新基因［31］。

對致病性的煙曲霉A.fumigatus 12個菌株的泛基因組（Pan-genome）分析，預測了116 230個推測蛋白及其相應的基因組位置。發現80%-90%的基因模塊是在所有菌株中高度保守的核心基因。剩余的“附屬”基因模塊聚集在基因組的亞末端區域，可能與發病機制和抗生素耐藥性有關［36］。Steenwyk等［37］和 Bartoletti等［38］從一名被曲霉屬真菌導致繼發性感染的COVID-19患者體內分離得到4株煙曲霉菌株CAPA A-D，表型特征和系統發育分析鑒定結果表明這些菌株與煙曲霉參考菌株A.fumigatus Af293和A1163并沒有明顯的差異存在；而通過基因組分析發現，與A.fumigatus Af293和A1163相比，CAPA A-D在毒力及相關性狀上表現出的菌株特異性是由編碼毒性蛋白的基因缺失突變引起。唑類藥物是預防和治療曲霉病的有效藥物，但長時間使用可能導致曲霉菌基因組的代償性突變，導致曲霉菌耐藥菌株的出現［39-41］。通過對耐藥菌株的全基因組分析，分生孢子中CYP51A基因的突變是導致耐藥性出現的主要原因，根據這一發現，針對CYP51A基因突變的新型藥物已經研發成功［42］。

曲霉屬黃綠組（sect.Flavi）是一重要類群，既包括有益的菌株，又有有害的種類，如用于食品發酵和酶生產的米曲霉A.oryzae，以及引起食物變質和產生真菌毒素的黃曲霉A.flavus。基因組測序技術如何精準的區分識別這些菌種及他們基因組水平上的差異。大規模基因組測序分析系統發育關系表明，A.oryzae的近緣種不是A.flavus而是A.minisclerotigenes或A.aflatoxiformans，并且鑒定出了基因組的高度多樣性，尤其是亞端粒區。預測黃綠組曲霉有大量的碳水化合物活性酶和次級代謝基因簇（每個菌株 73 個）［43］。

截止2021年6月，GenBank中已報道曲霉屬115種485個/株全基因組序列（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=Aspergillus），基因組大小從23.887 Mb（Aspergillus cejpii FS110）到77.556 Mb（A.latus ASFU1710）；已注釋的編碼蛋白質數量為7 761（A.rambellii SRRC1468）-19 260（A.fumigatus Af293）；GC含量：43%（A.coremiiformis CBS 553.77）-53.1%（A.olivimuriae NRRL66783）；tRNA 數 量：138（A.sydowii CBS593.65）-333（A.violaceofuscus CBS 115.71）；已注釋的基因數9 301（A.coremiiformis CBS 553.77）-15 384（A.calidoustus CBS 121 601）。與經典的擴增子條形碼相比，全基因組測序為曲霉的系統發育，基因分析、代謝調控、物種資源挖掘等研究提供更全面豐富的信息，將成為未來曲霉研究的重要方向和手段。

5 我國曲霉屬分類研究及展望

我國曲霉應用歷史悠久，物種多樣性豐富。齊祖同［14］主編《中國真菌志·第五卷·曲霉屬及其相關有性型》（以下簡稱曲霉志），以Raper等［13］和Gams等［15］的分類系統為基礎，研究包含我國曲霉屬14個組的82個種及變種；其中有26個具有性型，分別隸屬于子囊菌的裸胞殼、散囊菌、新薩托菌和石座菌4個屬。此后見一些零星的種類報道［44-48］。Chen 等［26-27，49］通過在荷蘭菌種保藏中心（CBS）訪學交流，對世界范圍內（包括我國部分）曲霉屬巢狀組、曲霉組等進行了系統的多相分類研究。我國對曲霉總體生產應用及污染防范較為關注，遺傳學及基因生物工程研究較多，但是《墨爾本法規》之后，面對整個曲霉分類系統的巨大變化，缺乏系統全面的分類修訂研究，影響其他相關領域的發展。如我國著名的茯磚茶核心發酵菌株‘金花菌’，曾認為是灰綠曲霉群Aspergillus glaucus group、匍匐曲霉A.repens、謝瓦氏曲霉A.chevalieri、冠突曲霉A.cristatus、冠突散囊菌Eurotium cristatum等，近年在食品發酵行業更多的認同冠突散囊菌［50-51］，但后兩者實際為同一菌種的無性-有性型，按《墨爾本法規》及現代曲霉分類系統，應該保留和使用的為冠突曲霉A.cristatus名稱。

通過對我國主要的菌種保藏機構收集的曲霉菌種的調查發現，來自土壤、糧食霉污、釀造等相關環境較多，一些來源歷史久遠，缺乏分子鑒定數據，還有部分以有性型名稱收錄（表4）。我們對收錄于《曲霉志》中的以及其他保存于CGMCC（中國普通微生物菌種保藏管理中心）的原屬裸胞殼屬菌株進行了重新鑒定和定名［52］。對保存于CGMCC的其他300余株曲霉系統整理，分析發現其中大部分來自于土壤，時間跨度大，從1952-2015年不等，多為上世紀50-60年代收集，保藏時間久遠，主要以形態分類鑒定為主，沿用的分類系統古老，缺乏分子數據，分類鑒定命名問題較多。我們按照《墨爾本法規》1F1N規則，經過形態及分子生物學研究，對其進行重新鑒定復核，共鑒定出曲霉屬51種，分布于4個亞屬，11個組，包括中國新記錄種20個；鑒定名稱發生變化的菌株有279株，占總比例（317株）的88%；例如菌株CGMCC 3.03554原鑒定為A.niger（黑曲霉），通過我們的多相分類鑒定為A.flavus（黃曲霉），另有18個菌株排除出曲霉屬［53-54］。

表4 我國主要菌種保藏機構收集曲霉及主要有性型屬情況Table 4 Information of Aspergillus and major related teleomorph by major strain collection institutions in China

曲霉屬真菌既包括能夠引起食品霉變、人類和動物疾病的有害菌，又包括代謝物豐富，能應用于生產生活的有益菌。曲霉菌種類的準確鑒定有利于有益菌的充分開發利用，更有利于有害菌的防治。但是我國傳統的曲霉屬鑒定和分類以形態和菌落培養特征為主，缺乏分子數據，有性無性名稱缺乏關聯，名稱使用不規范，有性型名稱仍然應用，不適應《墨爾本法規》新的分類命名體系，給霉菌的防治和疾病病原的精確診斷及對癥治療等帶來很大影響。我們建議十分有必要積極參與國際前沿研究合作，以《墨爾本法規》為指導，參照國際模式標本菌株材料，采用國際標準多相分類方法，同時引入全基因組測序分析手段，重新鑒定、分類、修訂、評估我國曲霉的分類與多樣性及系統發育關系。為挖掘重要種類的基因組學數據信息，尋找新的及重要的曲霉物種及基因資源，探索曲霉菌引起的疾病的治療切入點，開發霉菌代謝產物，研制新型防霉劑提供重要參考，為工農業生產、糧食食品環境安全、人們健康提供保障和支撐。

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