天然類胡蘿卜素的生物合成研究進展

周琳 梁軒銘 趙磊

（1.中國科學院天津工業生物技術研究所，天津300308；2.中國科學院系統微生物工程重點實驗室，天津300308）

類胡蘿卜素因具有抗氧化和抗腫瘤等特性，已被廣泛應用于醫藥保健、食品和化妝品生產等行業［1］，其主要來源為微藻和高等植物及微生物和部分動物等。由于每種藻類或植物富含的類胡蘿卜素種類存在很大差異，故需要從不同藻類或植物中使用不同的提取方法來分離得到各種類胡蘿卜素。微藻中分離提取的蝦青素和β-胡蘿卜素均已實現商業化生產。近年來，人類對類胡蘿卜素的需求量顯著增加。據統計，2016-2021年，類胡蘿卜素的市場值年復合增長率為3.5%；到2021年時，其全球生產總值可達 15.2億美元［2］（圖1）。

圖1 2021年主要類胡蘿卜素所占市場份額預測Fig.1 Market share forecast of major carotenoids in 2021

經濟的發展使人類生活水平不斷提高，人們更加注重營養保健，對類胡蘿卜素需求量增加。同時，相對于化學合成的類胡蘿卜素，天然合成類胡蘿卜素更受人青睞。但是，由于藻類和植物中類胡蘿卜素的含量較低，即使提取技術的不斷發展也無法滿足人類對天然類胡蘿卜素日益增長的需求。合成生物學技術的不斷的發展，極大的推動了類胡蘿卜素和脫輔基類胡蘿卜素等產品在微生物底盤細胞中的合成［3］。類胡蘿卜素的強疏水性化學性質使其很容易鑲嵌在磷脂雙分子層生物膜上，這給底盤細胞造成很大壓力，在一定程度上也限制了可合成類胡蘿卜素的底盤細胞選擇空間［4］。隨著對類胡蘿卜素合成途徑的進一步解析，合成途徑中催化反應的大部分酶和調控基因已經被鑒定，一方面為合成類胡蘿卜素細胞工廠的構建提供理論背景；另一方面也為其在工業、醫學、美妝和食品等領域的廣泛應用提供了科學依據。

1 類胡蘿卜素的來源和生物學功能

類胡蘿卜素種類繁多，分布廣泛，在高等植物葉片和花瓣、微生物、藻類中都已發現類胡蘿卜素［5］。大多數的類胡蘿卜素分子骨架中都具有C40共軛雙鍵多烯鏈和末端碳環，每種類胡蘿卜素的特性由其環狀烴和含氧官能團的種類決定［6］。按照化學結構特性和所含官能團的差異，又可以將類胡蘿卜素分成胡蘿卜素類和葉黃素類。類胡蘿卜素不僅能調節植物的生長與發育，還與人類營養和保健有密切關系［7］。類胡蘿卜素還是天然的抗氧化劑，具有預防和減緩疾病的功能［8］，也是維生素A（視黃醇）的生物合成前體。

1.1 類胡蘿卜素的來源

天然類胡蘿卜素主要是從藻類、植物以及微生物發酵中獲得。在藻類中，雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）和杜氏鹽藻（Dunaliella salina）可分別合成蝦青素和β-胡蘿卜素。雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）合成蝦青素的能力最強，其蝦青素約占胞內類胡蘿卜素總量的90%，重量可達細胞干重的7%左右［9］。細菌和真菌等也能合成類胡蘿卜素，如歐文氏菌（Erwinia）和紅法夫酵母（Red Fife yeast）等［10］。高等植物的根、莖、葉和花瓣也能合成各種類胡蘿卜素。由于藻類、微生物和植物體系具有天然的類胡蘿卜素合成途徑，所以它們是類胡蘿卜素合成細胞工廠的理想選擇。

蝦青素在分類上屬于酮式類胡蘿卜素，在藻類、真菌和細菌中廣泛存在。其具有3種旋光異構體，分別是左旋蝦青素、右旋蝦青素和全反式消旋蝦青素，不同異構體在抗氧化作用方面存在差異［11］。β-胡蘿卜素廣泛存在于自然界中，其末端具有2個β-紫羅酮環結構［12］；其主要以4種異構體形式存在，天然合成和化學合成β-胡蘿卜素的主要差異就體現在全反式和順式異構體所占比例的不同［13］。葉黃素主要存在于綠色植物的葉片和花朵中［14］。其化學分子式結構包括2個酮環和3個手性中心，自然界中共存在8 種異構體。它主要參與捕獲光能、調節植物的生長和發育等［15］。大多數的藻類都含有葉黃素，如小球藻、柵藻和衣藻等。其中，以小球藻含量較高，是生產葉黃素的優勢藻株［16］。

1.2 類胡蘿卜素的生物學功能

類胡蘿卜素由于具有強抗氧化性，其在抗氧化方面有非常重要的作用（表1）。研究發現，添加250 mg/kg 體重的葉黃素不僅能有效減少輻射誘導給白化小鼠造成的氧化損傷，還有利于維持其抗氧化系統的穩定性［17］。此外，不同類胡蘿卜素的抗氧化強弱方面有很大差異，不同種類的類胡蘿卜素以一定濃度配比組合后，其在抗氧化方面還具有協同作用。例如，蝦青素和β-胡蘿卜素濃度比為1∶1時，其協同抗氧化作用最強［18］；玉米黃質和葉黃素質量比為2∶1時，其協同抗化學作用最強［19］。

表1 主要類胡蘿卜素的生物學功能Table 1 Biological functions of main carotenoids

葉黃素和玉米黃質是人類角膜中黃斑色素的重要成分，其能夠保護視網膜免受藍光損傷，提高視覺靈敏度［20］。因此，葉黃素常被用于眼部保健，可以預防和減緩白內障、老年性黃斑變性和視網膜神經疾病等眼部退行性疾病［21］。當人體葉黃素和玉米黃質攝入量不足時，會增加黃斑病變風險［22］。類胡蘿卜素中以蝦青素和角黃素抗癌效果較好。研究表明，蝦青素能夠顯著降低癌癥發病率，阻止癌細胞惡性增殖和轉移，并能減少腫瘤的重量和大小［23］。角黃素的抗癌活性更高，研究表明角黃素誘導的細胞凋亡與ROS有關，ROS引起的細胞毒性會造成半胱天冬酶-3和-9的催化裂解［24］。對前列腺癌的研究發現，巖藻黃素及其代謝物巖藻青醇可抑制細胞生長，并誘導前列腺癌PC-3細胞凋亡和激活半胱天冬酶-3［25］。巖藻黃質和巖藻黃醇也可通過調節各種分子的表達和信號轉導途徑，誘導腫瘤細胞周期阻滯［26］。

2 類胡蘿卜素的生物合成

人們對植物體中類胡蘿卜素的合成途徑研究最早。近年來，科學家對于微生物和藻類中的合成途徑進行深入解析后發現，不同生物的合成途徑存在差異，獲得的類胡蘿卜素種類和產量也不盡相同［28］。類胡蘿卜素合成途徑所需的酶在植物和微生物中有所不同，在植物中的分工更細。例如，催化八氫番茄紅素合成和番茄紅素環化的酶，在植物中由兩個酶分別負責，而在酵母和霉菌中僅由一個酶完成［29-30］。雖然微藻在分類學上被列為低等植物，但其兼具高等植物和微生物的特性，能合成的類胡蘿卜素種類較多。其既可合成高等植物中所特有的α-胡蘿卜素和葉黃素，又能合成微生物中普遍存在的角黃素和蝦青素，故微藻在用作類胡蘿卜素合成底盤細胞改造方面具有獨特的優勢［31］。類胡蘿卜素合成途徑的解析，為其合成細胞工廠的構建提供了理論依據，其合成始于前體物質牻牛兒基牻牛兒基焦 磷 酸（geranylgeranyl pyrophosphat，GGPP）。 下面將以高等植物為例，簡述類胡蘿卜素的合成過程（圖2）。

圖2 類胡蘿卜素合成途徑Fig.2 Carotenoid synthesis pathway

2.1 GGPP的生物合成途徑

GGPP的生物合成是類胡蘿卜素合成過程中的重要步驟，其合成過程可以簡單分成兩大步，即前體物質異戊二烯焦磷酸（isopenteny diphosphate，IPP）和二甲基丙烯焦磷酸（dimethylallyl diphosphate，DMAPP）的合成；由前體物質IPP和DMAPP合成GGPP。根據所發生場所的不同，IPP的合成途徑又分為甲羥戊酸（mevalonic acid，MVA）途徑［32］和甲基赤蘚糖醇（methyl erythritol phosphate，MEP）途徑［33］，合成過程都是被區室化的。其中，MVA途徑主要存在于大多數的哺乳動物和酵母細胞質基質和內質網上，起始物質是乙酰輔酶A；MEP 途徑一般存在于高等植物、部分細菌和藻類細胞原生質體中［34］，起始物質是3-磷酸甘油醛（GA-3-P）和丙酮酸［35］。在生成IPP和DMAPP后，MVA和MEP的催化步驟基本相同。

2.2 從GGPP到胡蘿卜素類合成

從GGPP起始，參與合成各種胡蘿卜素的酶包括氧化還原酶類（EC1）的PDS（phytoene desaturase）和 ZDS（ζ-carotene desaturase）、轉移酶類（EC2）的PSY（phytoene synthase）及異構酶類（EC5）的LCYe（lycopene ε-cyclase） 和 LCYb（lycopene β-cyclase）等。

主要過程為：首先，GGPP在PSY催化作下，合成八氫番茄紅素，其他各種類胡蘿卜素都是在此基礎上經進一步的脫氫和環化生成。PSY是該途徑的關鍵限速酶，其在細菌和真核生物中的編碼基因分別是CrtB和PSY，改變它的表達量或活性可以調節代謝途徑通量［36］。例如，在油菜籽和馬鈴薯衍生愈傷組織中，過表達組成型PSY可增加細胞中總類胡蘿卜素含量，β-胡蘿卜素的合成也顯著增加［37］。

2.3 從胡蘿卜素類到葉黃素類的合成

從胡蘿卜素類合成葉黃素類色素的代謝途徑需要5種氧化還原酶類參與，包括LUT1（carotenoid ε-hydroxylase）、CrtZ（β-carotene 3-hydroxylase）、LUT5（β-ring hydroxylase）、ZEP（zeaxanthin epoxidase）和 VDE（violaxanthin deepoxidase）。β-胡蘿卜素在經過連續的羥基化反應后，先生成β-隱黃質，后轉化為玉米黃質。其中，由玉米黃質脫環化生成花藥黃質，再進一步反應生成堇菜黃質的過程是可逆的；催化正向兩步反應（即環化反應）的酶都是ZEP，反應在弱光或黑暗條件下進行。在擬南芥中，該酶的編碼基因是AtABA1；催化逆向兩步反應（即脫環化反應）的酶均是ZEP，反應在強光條件下進行；在擬南芥中該酶的編碼基因為AtNPQ1，整個循環過程被稱作葉黃素循環（Lutein cycle）［41］。目前，參與各個反應步驟的催化酶都已得到解析，尤其是在高等植物擬南芥中（表2）。胡蘿卜素類到葉黃素類的合成途徑研究，可用于定向進化或逆境脅迫等方法合成特定種類的類胡蘿卜素。由于PSY 在多數植物中為單拷貝基因，故其是用基因工程技術改良植物類胡蘿卜素含量的理想靶標［38］。其次，八氫番茄紅素在PDS催化作用下生成ζ-胡蘿卜素，ζ-胡蘿卜素在ZDS的催化作用下生成番茄紅素。Gao等［39］的研究表明白光照可以抑制葡萄柚（Citrus paradisi）愈傷組織中CpPDS 和CpZDS 的表達，從而減少其番茄紅素的合成。Qin等［40］研究發現，擬南芥中類胡蘿卜素合成途徑的AtPDS3 基因發生突變后，AtPSY 和AtZDS 等基因的表達水平會顯著降低，其類胡蘿卜素合成受阻，葉綠素和赤霉素的合成途徑也受到抑制。

表2 參與類胡蘿卜素生物合成的酶及編碼基因Table 2 Enzymes and encoding genes involved in carotenoid biosynthesis

番茄紅素在不同的酶催化下可以生成不同的胡蘿卜素：在CrtE的催化作用下可環化生成δ-胡蘿卜素，再進一步生成ε-胡蘿卜素；在CrtY催化作用下可生成γ-胡蘿卜素，并進一步生成β-胡蘿卜素。同時，CrtB 還可催化δ-胡蘿卜素生成α-胡蘿卜素。由GGPP 起始合成的胡蘿卜素種類非常豐富，是天然類胡蘿卜素合成途徑的重要組成部分，對于該途徑的深入解析將為類胡蘿卜素生物合成途徑的設計、改造和應用提供理論依據。

3 類胡蘿卜素合成細胞工廠的構建及合成生物學策略

類胡蘿卜素的生物合成路徑可以分為上游路徑和下游路徑，以最基本的IPP/DMAPP 為節點。上游路徑是IPP和DMAPP的合成，有MEP和MVA兩種途徑；下游路徑則是以IPP和DMAPP 為起點，通過多步反應和修飾，最終合成多種類胡蘿卜素及其衍生物。

構建類胡蘿卜素合成細胞工廠是一個復雜的過程，涉及到多模塊的組裝和適配等諸多問題。這不僅需要根據目標產品選擇合適的催化元件；有時，為了解除代謝中間體的反饋抑制效應，還需要增強NADPH和ATP的合成以及增加GGPP前體供給或引入異源MVA路徑等［42］。類胡蘿卜素合成途徑所需的催化元件，包括催化途徑化學反應的各種酶，如合成酶、脫氫酶、環化酶、羥化酶和酮化酶等。為了提高類胡蘿卜素的產量，需要在底盤細胞中最大限度地增加從底物到目標產物的代謝通量，同時盡量減少非必需副產物或代謝中間體的產生。因此，需選擇最優底盤細胞和催化元件，并從催化特性、表達水平、底盤適應性等多個維度進行組合適配。

3.1 類胡蘿卜素合成底盤細胞的選擇和改造

合成生物學技術的不斷發展，極大的推動了大腸桿菌（Escherichia coli）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 和 耶氏 解 脂 酵母（Yarrowia lipolytica）等底盤細胞高效合成類胡蘿卜素及其衍生物（表3）［43］。大多數類胡蘿卜素都具有強疏水性，故大量的類胡蘿卜素在細胞內合成后，會損傷細胞膜結構并危害細胞的正常生理功能［44］。此外，微生物底盤細胞中有限的膜結構，也在一定程度上限制了類胡蘿卜素產量提升空間；而且，類胡蘿卜素的強還原性還會觸發底盤細胞脅迫響應，使胞內反應活性氧（reactive oxygen species，ROS）的水平顯著提高而反饋抑制細胞生長［45］。因此，采用誘導型啟動子使生產菌株的生長與生產解偶聯［46］、創建工程化轉運蛋白和膜囊泡轉運系統，可促進類胡蘿卜素外排、弱化膜系統壓力［47］等，降低類胡蘿卜素合成的反饋抑制效應。

表3 合成類胡蘿卜素細胞工廠的構建示例Table 3 Construction examples of a synthetic carotenoid cell factory

底盤細胞復雜的內環境系統，決定了目標產物的合成必然會受到胞內其他各方面因素的影響。尤其是，其內源非必需基因對類胡蘿卜素合成能力有重要的影響［48］。對底盤細胞非必需基因的調控、設計和改造，有助于增加外源表達模塊與其內環境的適配，增強細胞耐受力，強化目標路徑代謝流量。但考慮到可理性設計的非必需基因數目及其對內環境影響有限，因此，需借助隨機誘變等非理性設計策略以增加基因和相應表型的多樣性，進而加速菌株的實驗室進化過程［49］。

植物底盤因在蛋白表達、翻譯后修飾以及催化環境上更加貼近產物的天然宿主，近年來，已得到更多研究人員的青睞。目前，科研人員可使用煙草、番茄和水稻等作為底盤細胞生產番茄紅素等類胡蘿卜素產品［50］。例如，劉耀光院士團隊將類胡蘿卜素合成路徑導入到水稻胚乳中，獲得了富含各種類胡蘿卜素的大米新品種［51］。此外，萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）和集胞藻（synechocystis）等因具有天然類胡蘿卜素合成路徑，也是理想的植物底盤細胞［52］。

3.2 類胡蘿卜素合成途徑的模塊組裝與適配

類胡蘿卜素細胞工廠的構建涉及多模塊組裝，以及路徑模塊間催化性能、表達水平等多因素的組合適配等（圖3）。最終目標為最大限度地增加從底物到目標產物的代謝通量，減少非必需副產品和代謝中間體的積累［53］。類胡蘿卜素合成步驟中公認的限速酶包括CrtE、CrtI、CrtZ和CrtW，這些酶具有相對寬泛的底物選擇性，可以連續催化多步反應。但是，不同來源的限速酶在催化連續多步反應時，其反應步數可能不同，這極大的影響目標化合物在總類胡蘿卜素含量中的占比［54］。另外，催化元件的底物選擇差異，也會影響代謝中間體的轉化速率［55］。因此，篩選、組合不同來源的催化元件是提高類胡蘿卜素合成通量、降低代謝中間體積累的有效手段［56］。

圖3 類胡蘿卜素合成途徑的模塊組裝與適配Fig.3 Modular assembly and adaptation of carotenoid synthesis pathways

同時，通過調節模塊表達水平，也可達到提高整體代謝流量、弱化限速步驟的目的［57］。在調整模塊表達強度時，可改變啟動子強度、拷貝數、模塊在染色體上的整合位置等。通常，可將模塊分別克隆到不同質粒進行表達，這有利于快速建立強度多樣化的表達文庫，調整不同模塊的表達水平。同時，通過配合使用不同強度的啟動子、調整質粒的復制起始位點等手段可增加文庫的多樣性、拓寬模塊表達強度的動態范圍［58］。為實現類胡蘿卜素合成途徑基因模塊的穩定表達，可采用底盤基因組整合方式。表達模塊在染色體上的插入位置和拷貝數，對模塊的整體表達水平和類胡蘿卜素合成路徑通量有較大影響。

在類胡蘿卜素細胞工廠的構建中，要獲得模塊間的最佳適配效果，需對所用催化元件的催化性能、基因拷貝數、表達水平以及元件在染色體上的整合位置、排列順序等諸多因素進行篩選，這就需要構建足夠大的文庫以滿足所需覆蓋度。模塊化代謝工程（modular metabolic engineering，MME）可將代謝途徑中所涉及的催化單元進行聚類分組，將每組催化單元的表達盒子視為一個模塊［59］。該方法只涉及平衡模塊間的表達水平，這將極有利于降低類胡蘿卜素細胞工廠構建的復雜性。

4 總結和展望

類胡蘿卜素由于其具有鮮艷的色彩和重要的生物學功能，被廣泛用于醫藥、食品和保健行業，其商業價值較高。近年來，人們對類胡蘿卜素的需求在不斷加大。目前，類胡蘿卜素的化學全合成技術成熟，是生產的主要來源，但其食用安全性具有不確定性。因此，通過構建類胡蘿卜素合成細胞工廠生產相關產品，已得到更多關注。為使類胡蘿卜素合成細胞工廠獲得最大的生產能力，需要對其進行合理的改造和調控。為有效解決細胞代謝流失衡、中間體積累等問題，需要構建調控元件、設計基因線路以精確調節物質流及能量流，這也需要借助于高通量篩選、酶設計及計算機模擬、模型分析、耦合基因控制元件等。

合成生物學技術的不斷發展，為合成類胡蘿卜素細胞工廠構建帶來了新的契機。這不僅使類胡蘿卜素合成相關元件在工程學上模塊化，而且具有非常充分的生物學特征，為整合相關特征元件用于構建具有特定生物學功能的生物系統，并實現大規模的設計、開發、改造與應用等提供了更多可能。由此獲得的類胡蘿卜素合成代謝途徑，不僅具有更好的可預測性，而且簡化了改造過程，提高了傳統代謝工程效率。此外，計算機輔助設計、深度學習等可加速實現并優化代謝途徑設計、流程構建等。借助于連續的設計、構建、測試與學習模型，可望達到預先評價目標過程的效果，這將有助于構建出更高效、更穩定的人工合成細胞工廠。多學科的交叉融合，必定會促使類胡蘿卜素合成細胞工廠構建向著高通量、智能化、高效率的方向發展。