絞股藍(lán)GpMIR156a和GpMIR166b的克隆與功能分析

于秋琳 馬婧怡 趙盼 孫鵬芳 何玉美 劉世彪 郭惠紅

（1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083；2.吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，吉首 416000）

絞股藍(lán)（Gynostemma pentaphyllum（Thunb.）Makino）是葫蘆科絞股藍(lán)屬的一種多年生草質(zhì)藤本植物，因其根狀莖中富含的絞股藍(lán)皂苷具有調(diào)節(jié)血壓、降低膽固醇等重要的藥用價(jià)值而得到廣泛關(guān)注［1］。絞股藍(lán)為了生存演變出了一種重要的越冬繁殖策略，即在入冬前其地上莖的近頂端區(qū)域會(huì)膨大后鉆入土中發(fā)育成根狀莖以便來年長(zhǎng)出新的植株［2］。絞股藍(lán)這種地上莖向根狀莖的轉(zhuǎn)變不僅是發(fā)育階段的變化，而且是其繁殖功能上的轉(zhuǎn)變，這種轉(zhuǎn)變機(jī)制是發(fā)育生物學(xué)領(lǐng)域中一個(gè)亟待解決的科學(xué)問題。

miRNAs是一類內(nèi)源性的小分子非編碼RNA，通過在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)節(jié)其下游靶基因的表達(dá)參與調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育過程［3］。越來越多的研究表明，一些miRNAs參與了植物發(fā)育的轉(zhuǎn)變，其中miR156和miR166被認(rèn)為是兩個(gè)關(guān)鍵的調(diào)控因子［4］。miR156調(diào)控植物發(fā)育轉(zhuǎn)變的功能最初在擬南芥中得到證實(shí)，miR156b過表達(dá)使植株葉片數(shù)目增多、側(cè)枝增加和開花延遲，即miR156b會(huì)延長(zhǎng)植株的童期，抑制童期向成熟期的轉(zhuǎn)變［5］。然而，通過突變或虛擬靶標(biāo)技術(shù)下調(diào)miR156的水平使得擬南芥葉片數(shù)量減少，促進(jìn)葉片背軸毛狀體的產(chǎn)生和童期向成熟期的轉(zhuǎn)變［6-7］。miR166也參與調(diào)節(jié)植物發(fā)育的轉(zhuǎn)變，但與miR156不同的是，在水稻中，miR166的表達(dá)下調(diào)延緩了生長(zhǎng)發(fā)育階段的轉(zhuǎn)變［8］，表明miR166促進(jìn)植株童期向成熟期的轉(zhuǎn)變。此外，在擬南芥中發(fā)現(xiàn)，miR166a表達(dá)水平的上調(diào)導(dǎo)致擬南芥植株矮化，miR166g過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的發(fā)育缺陷［9-10］，這些研究表明miR166還影響了器官發(fā)育中的正常轉(zhuǎn)變。miR156和miR166的這些表型在模式植物楊樹中也有類似的表現(xiàn)［11］。從前人的研究中可以發(fā)現(xiàn)，miR156是植物童期向成熟期轉(zhuǎn)變的負(fù)調(diào)控因子，而miR166是童期向成熟期轉(zhuǎn)變的正調(diào)控因子，并且還會(huì)影響器官的正常發(fā)育。

本課題組前期通過小RNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)miRNAs參與了絞股藍(lán)地上莖向根狀莖的發(fā)育轉(zhuǎn)變過程，首次發(fā)現(xiàn)GpmiR156a和GpmiR166b在這個(gè)發(fā)育轉(zhuǎn)變過程中發(fā)揮了重要作用［2］。鑒于不同物種中miR156和miR166的同源物可能存在功能分化，我們通過轉(zhuǎn)化擬南芥進(jìn)一步分析了GpmiR156a和GpmiR166b的生理功能，以期拓寬對(duì)miR156a和miR166b在調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育方面的認(rèn)識(shí)。

1 材料與方法

1.1 材料

用于基因克隆的絞股藍(lán)和用于遺傳轉(zhuǎn)化的擬南芥植株均栽培于組培室，溫度為（22±2）℃。

1.2 方法

1.2.1 絞股藍(lán)基因組DNA的提取 取絞股藍(lán)植株莖頂端的幼嫩莖段為材料，使用天根試劑盒提取絞股藍(lán)的基因組DNA。

1.2.2 絞股藍(lán)GpMIR156a和GpMIR166b的克隆 由于絞股藍(lán)未經(jīng)過全基因組測(cè)序，所以本實(shí)驗(yàn)采用兼并引物的方法設(shè)計(jì)絞股藍(lán)GpmiR156a和GpmiR166b的引物（表1）。以絞股藍(lán)基因組DNA為模版，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增片段與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)TOP10，平板涂布培養(yǎng)后經(jīng)抗性篩選獲得陽(yáng)性單菌落，菌液PCR后送公司測(cè)序鑒定獲得GpmiR156a和GpmiR166b的前體序列。

1.2.3 GpmiR156a和GpmiR166b的生物信息學(xué)分析利用RNAfold分析絞股藍(lán)GpmiR156a和GpmiR166b的二級(jí)結(jié)構(gòu)，通過MEGA X，構(gòu)建NJ-系統(tǒng)進(jìn)化樹（Bootstrap為1 000），利用在線網(wǎng)站psRNATarget預(yù)測(cè)絞股藍(lán)GpmiR156a和GpmiR166b的靶基因。

1.2.4 植物表達(dá)載體的構(gòu)建及農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化 以GpmiR156a和GpmiR166b測(cè)序驗(yàn)證正確的菌液為模板，加有酶切位點(diǎn)的GpmiR156a/miR166b-Ft/Rt為引物（表1），進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收目的產(chǎn)物，并利用Xma I和Xba I限制性內(nèi)切酶將pBI121載體線性化。利用T4連接酶進(jìn)行連接，獲得pBI121-GpmiR156a/166b重組載體，轉(zhuǎn)化大腸感受態(tài)TOP10。經(jīng)過菌液PCR檢測(cè)及測(cè)序驗(yàn)證后，轉(zhuǎn)入GV3101農(nóng)桿菌感受態(tài)，獲得陽(yáng)性菌液。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥的檢測(cè)與篩選 采用花序浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥，待擬南芥成熟后收取T0代種子，播在含有30 mg/L Kan的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至10-14 d時(shí)，將長(zhǎng)勢(shì)良好的擬南芥移栽到營(yíng)養(yǎng)土中。提取植株的基因組DNA，以pBI121載體的CaMV35S啟動(dòng)子序列和GUS報(bào)告基因序列設(shè)計(jì)引物為p121-F和p121-R（表1）。用 GpmiR156a和 GpmiR166b過表達(dá)載體的質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將電泳檢測(cè)陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行GUS檢測(cè)。待檢測(cè)為陽(yáng)性的植株成熟后收取T1代種子，按相同的篩選方法篩選出T2代種子，對(duì)T2代植株進(jìn)行表型觀察。

表1 絞股藍(lán)GpmiR156a和GpmiR166b的引物信息Table 1 Primer information of G.pentaphyllu GpmiR156a and GpmiR166b

1.2.6 GpmiR156a和GpmiR166b轉(zhuǎn)基因擬南芥種子的播種處理與統(tǒng)計(jì)觀察 取GpmiR156a和GpmiR166b轉(zhuǎn)基因擬南芥的種子與野生型擬南芥種子播種到1/2 MS出芽培養(yǎng)基上，在4℃春化2 d后于光照培養(yǎng)箱中（22℃，光照16 h/黑暗8 h）培養(yǎng)，分別統(tǒng)計(jì)野生型和轉(zhuǎn)基因株系的種子萌發(fā)率。

待擬南芥種子萌發(fā)后，將生長(zhǎng)8 d的幼苗移至1/2 MS生根培養(yǎng)基中，放置在光照培養(yǎng)箱中。生長(zhǎng)7 d后，用刻度尺分別測(cè)量野生型擬南芥和轉(zhuǎn)基因株系的主根（即最長(zhǎng)一條根）的長(zhǎng)度。種子萌發(fā)率和根長(zhǎng)均使用軟件SPSS Statistics 26進(jìn)行單因素ANOVA統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 絞股藍(lán)GpMIR156a和GpMIR166b的克隆

提取的絞股藍(lán)基因組DNA經(jīng)Nanodrop-2000檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，A260/A280在1.85-1.93之間，A260/A230范圍在1.9-2.0之間，在凝膠成像儀下顯示出清晰的基因組條帶（圖1），表明提取的基因組DNA樣品純度高，降解少，能夠用于后續(xù)基因克隆。通過PCR擴(kuò)增分別得到長(zhǎng)度為365 bp、425 bp的GpmiR156a和GpmiR166b前體序列，兩者的成熟體均為21 bp（圖2）。

圖1 絞股藍(lán)基因組DNA電泳圖Fig.1 Genomic DNA electrophoresis of G.pentaphyllum

圖2 絞股藍(lán)GpmiR156a和GpmiR166b的前體序列Fig.2 Precursor sequences of G.pentaphyllu GpmiR156a and GpmiR166b

2.2 絞股藍(lán)GpmiR156a和GpmiR166b的生物信息學(xué)分析

使用RNAfold在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)GpmiR156a和GpmiR166b的二級(jí)結(jié)構(gòu)，GpmiR156a和GpmiR166b的最小自由能（minimum free energy，MFE）分別為-31.39 kcal/mol和-25.29 kcal/mol。MFE的值越小結(jié)構(gòu)越趨于穩(wěn)定，GpmiR156a和GpmiR166b的MFE值較小說明它們的二級(jí)結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定。GpmiR156a和GpmiR166b的MFE結(jié)構(gòu)如圖3所示。

圖3 絞股藍(lán)GpmiR156a和GpmiR166b的二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.3 Secondary structures of G.pentaphyllu GpmiR156a and GpmiR166b

使用NJ法構(gòu)建GpmiR156a和GpmiR166b的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖4）。GpmiR156a與禾本科的二穗短柄草聚在同一進(jìn)化枝上，與葫蘆科的西葫蘆、南瓜、筍瓜親緣關(guān)系次之，GpmiR166b則與葫蘆科的物種親緣關(guān)系最近。GpmiR156a和GpmiR166b分別與禾本科和葫蘆科的親緣關(guān)系最近，這與核苷酸序列比對(duì)的結(jié)果一致。

圖4 絞股藍(lán)GpmiR156a和GpmiR166b的進(jìn)化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of G.pentaphyllu GpmiR156a and GpmiR166b

利用在線網(wǎng)站psRNATarget預(yù)測(cè)GpmiR156a和GpmiR166b的靶基因，獲得62個(gè)潛在的GpmiR156a靶基因和30個(gè)潛在的GpmiR166b靶基因。通過對(duì)靶基因的分析可知，GpmiR156a的靶基因主要為SPL家族成員，而GpmiR166b的靶基因主要為HDZIP III家族成員（表2）。

表2 絞股藍(lán)GpmiR156a和GpmiR166b的靶基因預(yù)測(cè)Table 2 Prediction of G.pentaphyllu GpmiR156a and GpmiR166b target genes

2.3 轉(zhuǎn)基因植株的檢測(cè)與表型分析

本實(shí)驗(yàn)通過Kan抗性篩選（圖5-C），初步篩選出63株待檢測(cè)的GpmiR156a轉(zhuǎn)基因植株和39株待檢測(cè)的GpmiR166b轉(zhuǎn)基因植株。對(duì)抗性篩選后的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)一步進(jìn)行PCR檢測(cè)（圖5-A）和GUS檢測(cè)（圖5-B），轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株檢測(cè)出了預(yù)期的PCR擴(kuò)增條帶、GUS染色明顯，獲得53株GpmiR156a過表達(dá)陽(yáng)性植株和24株GpmiR166b過表達(dá)陽(yáng)性植株。

為了探究轉(zhuǎn)基因植株的表型，我們將在培養(yǎng)基上培養(yǎng)了10-14 d、葉片發(fā)育良好、根系發(fā)達(dá)的擬南芥幼苗移栽到營(yíng)養(yǎng)土中繼續(xù)觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)GpmiR156a轉(zhuǎn)基因擬南芥的蓮座葉數(shù)量明顯多于野生型（圖5-D-a，b；圖6-A），其分枝也比野生型擬南芥顯著增多（圖5-D-d，e；圖6-B）。GpmiR166b轉(zhuǎn)基因擬南芥較野生型植株矮小，葉片數(shù)量減少（圖5-D-a，c；圖6-C），而且其莖上毛狀體較野生型明顯增多（圖5-D-d，f）。

圖5 轉(zhuǎn)基因植株的檢測(cè)與表型分析Fig.5 Detection and phenotype analysis of positive transgenic plants

圖6 轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型擬南芥的葉片及分枝數(shù)量Fig.6 Number of rosette leaves and branches in transgenic A.thaliana and WT

為了進(jìn)一步研究GpmiR156a和GpmiR166b過表達(dá)對(duì)擬南芥種子萌發(fā)及根長(zhǎng)的影響，我們將獲得的GpmiR156a和GpmiR166b轉(zhuǎn)基因擬南芥T2代種子種植于含Kan抗性的1/2 MS培養(yǎng)基上，以野生型為對(duì)照觀察、分析了GpmiR156a和GpmiR166b過表達(dá)株系種子萌發(fā)及根長(zhǎng)的變化規(guī)律（圖7）。GpmiR156a轉(zhuǎn)基因株系的種子比野生型萌發(fā)速度快（圖7-A），而GpmiR166b過表達(dá)株系的種子萌發(fā)速度比野生型慢（圖7-B），說明GpmiR156a的過表達(dá)可以加速擬南芥種子的萌發(fā)，但GpmiR166b表達(dá)水平的上調(diào)則會(huì)減緩種子的萌發(fā)。GpmiR156a和GpmiR166b過表達(dá)對(duì)擬南芥種子萌發(fā)的速度有影響，但對(duì)最終的種子萌發(fā)率沒有影響。此外，GpmiR156a和GpmiR166b過表達(dá)植株的根長(zhǎng)均長(zhǎng)于野生型（圖7-C，D）

圖7 過表達(dá)GpmiR156a、GpmiR166b擬南芥與野生型擬南芥種子的萌發(fā)與根長(zhǎng)Fig.7 Seed germination and root length of overexpressing GpmiR156a and GpmiR166b and wild-type A.thaliana

3 討論

遺傳轉(zhuǎn)化是開展植物基因功能研究的重要方法。由于絞股藍(lán)的全基因組尚未測(cè)序和絞股藍(lán)的遺傳轉(zhuǎn)化體系尚未建立，本實(shí)驗(yàn)采用設(shè)計(jì)兼并引物的方法克隆了絞股藍(lán)GpmiR156a和GpmiR166b的前體序列，通過轉(zhuǎn)化擬南芥研究其生理功能，以拓寬miRNAs對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識(shí)。

本實(shí)驗(yàn)通過在線軟件預(yù)測(cè)的GpmiR156a靶基因主要包括SPL家族成員，SPL編碼植物特異性轉(zhuǎn)錄因子，控制著植物生長(zhǎng)和發(fā)育的許多方面，包括營(yíng)養(yǎng)相變、分枝和葉片數(shù)量等［12-13］。研究表明，功能缺失的spl13突變體增加了擬南芥幼苗的蓮座葉數(shù)目［14］。在紫花苜蓿中，SPL13的沉默導(dǎo)致植株分枝增多［15］。這些研究揭示SPL能夠抑制分枝和葉片的發(fā)育。在本研究中，過表達(dá)GpmiR156a的轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片數(shù)量和分枝數(shù)量明顯多于野生型，推測(cè)GpmiR156a很可能通過抑制SPL的表達(dá)促進(jìn)了植株葉片和分枝的增多，延長(zhǎng)童期，從而抑制了童期向成年期發(fā)育的轉(zhuǎn)變。此外，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與野生型相比過表達(dá)GpmiR156a轉(zhuǎn)基因植株的種子萌發(fā)加速且根長(zhǎng)增加。近幾年也有研究發(fā)現(xiàn)，在赤霉素途徑中miR156的表達(dá)上調(diào)解除了水稻種子的休眠，促進(jìn)了種子的萌發(fā)［16］；在擬南芥中，miR156的過表達(dá)顯著增加了擬南芥幼苗的根長(zhǎng)［17］，這些發(fā)現(xiàn)與我們的研究結(jié)果基本一致。在擬南芥中，miR156a的過表達(dá)使根中的生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)體PIN表達(dá)上調(diào)，PIN表達(dá)水平的上調(diào)促進(jìn)了幼苗根的伸長(zhǎng)［18］。因此，我們推斷GpmiR156a可能通過對(duì)其靶基因SPL的調(diào)節(jié)參與了植物發(fā)育轉(zhuǎn)變的調(diào)控，還可能通過赤霉素途徑加速種子萌發(fā)及通過影響根中生長(zhǎng)素的運(yùn)輸促進(jìn)根的伸長(zhǎng)。

GpmiR166b靶基因的預(yù)測(cè)結(jié)果指出，其靶基因主要包括HDZIP III家族成員。前人研究發(fā)現(xiàn)，miR166a的過表達(dá)通過抑制HDZIP III類靶基因的表達(dá)，導(dǎo)致擬南芥植株矮化和SAM缺失［10］。在本研究中，我們觀察到過表達(dá)GpmiR166b的擬南芥植株矮小、幼苗葉片數(shù)量減少，這與前人的研究結(jié)果基本一致。同時(shí)，本研究首次發(fā)現(xiàn)GpmiR166b轉(zhuǎn)基因植株花序莖上毛狀體數(shù)量增多。在擬南芥中，葉背面毛狀體的產(chǎn)生常被視作童期向成熟期發(fā)育轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵標(biāo)志［19］。我們認(rèn)為植株矮小，幼苗葉片數(shù)量減少也是童期縮短、加速向成熟期轉(zhuǎn)變的現(xiàn)象，綜合考慮GpmiR166b過表達(dá)植株的表型，推測(cè)GpmiR166b不僅促進(jìn)了植物童期向成熟期的發(fā)育轉(zhuǎn)變，而且影響器官的正常發(fā)育。本研究還發(fā)現(xiàn)GpmiR166b會(huì)影響種子萌發(fā)，GpmiR166b過表達(dá)植株與野生型相比種子萌發(fā)速度受到抑制。前人研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥miR166的特異性缺失激活了種子萌發(fā)相關(guān)基因，促進(jìn)了種子萌發(fā)［20］。這些研究表明miR166表達(dá)上調(diào)延緩萌發(fā)而表達(dá)下調(diào)促進(jìn)萌發(fā)。但也有相反的報(bào)道，在落葉松中miR166a過表達(dá)促進(jìn)了種子的萌發(fā)［21］。推測(cè)miR166存在這種相反的調(diào)節(jié)作用可能是由于該基因家族中的不同成員在種子萌發(fā)階段具有不同的調(diào)節(jié)作用，因?yàn)橛醒芯勘砻魍粋€(gè)miRNA家族成員的前體序列存在差異會(huì)出現(xiàn)一定的功能分化［22-23］。本研究中，GpmiR166b過表達(dá)促進(jìn)了根長(zhǎng)，在煙草中也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象［24］。最近，研究發(fā)現(xiàn)miR166通過影響生長(zhǎng)素分布和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來促進(jìn)根的伸長(zhǎng)［25］。綜合前人的研究和本研究結(jié)果，推測(cè)生長(zhǎng)素的合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在轉(zhuǎn)基因GpmiR166b植株根的伸長(zhǎng)方面可能發(fā)揮了一定的作用。綜上，GpmiR166b促進(jìn)了植株童期向成熟期發(fā)育的轉(zhuǎn)變和根的伸長(zhǎng)，但影響器官的正常發(fā)育并延緩種子的萌發(fā)。

關(guān)于miRNAs調(diào)節(jié)植物發(fā)育轉(zhuǎn)變和器官形成的分子機(jī)制仍有待研究，這將是通過基因調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要分子基礎(chǔ)。值得注意的是，盡管基因過表達(dá)可以幫助了解目的基因在植物尤其是非模型植物中的生理功能，但基因的過表達(dá)可以表現(xiàn)出多效性表型，有時(shí)可能無法很好地闡明其功能。因此，更多的突變分析和基因編輯技術(shù)的應(yīng)用，如CRISPR-Cas9，可為將來由miRNAs及其靶基因調(diào)控的植物發(fā)育調(diào)節(jié)機(jī)制提供新的見解。

4 結(jié)論

本研究克隆了GpMIR156a和GpMIR166b兩個(gè)miRNAs基因，進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。GpMIR156a的過表達(dá)導(dǎo)致擬南芥幼苗葉片數(shù)量和分枝的增多，而GpMIR166b的過表達(dá)導(dǎo)致擬南芥植株早熟和矮化，并首次發(fā)現(xiàn)了花序莖上毛狀體數(shù)量增多，揭示GpmiR156a能夠促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)器官的發(fā)育、抑制童期向成熟期發(fā)育的轉(zhuǎn)變，而GpmiR166b雖影響器官的正常發(fā)育但促進(jìn)童期向成熟期發(fā)育的轉(zhuǎn)變。GpMIR156a過表達(dá)加速種子的萌發(fā)并促進(jìn)根的伸長(zhǎng)，GpMIR166b過表達(dá)延緩種子萌發(fā)但促進(jìn)根的伸長(zhǎng)。