子宮內膜癌患者血清誘導型一氧化氮合酶、可溶性腫瘤壞死因子受體水平及臨床意義

買衛紅，吳寧，張曉慧

周口市人民醫院婦產科，河南 周口 466000

子宮內膜癌（endometrial cancer，EC）是常見的生殖系統惡性腫瘤之一，最常見的病理類型為內膜樣腺癌，約70%以上發生于絕經老年女性，近年來EC發病趨于年輕化[1-2]。目前EC的診斷無特異性腫瘤標志物，越來越多的學者致力于探索對EC診斷及嚴重程度預判等價值較高的血清學指標，以期及早診斷疾病并及時予以相應治療，進而改善患者預后。一氧化氮是人體內重要的細胞間信號傳遞因子，具有誘導腫瘤細胞凋亡的作用，其由一氧化氮合酶（nitricoxide synthase，NOS）催化合成[3]。其中，誘導型一氧化氮合酶（inducible NOS，iNOS）在正常組織中很少表達，在腫瘤組織或參與病理過程的炎性細胞中表達，已有研究表明其與淋巴瘤、肺癌、肝癌等發生發展密切相關[4-6]。可溶性腫瘤壞死因子受體（soluble tumor necrosis factor receptor，sTNFR）分為sTNF-RⅠ、sTNF-RⅡ兩種，分別來源于腫瘤壞死因子受體p55和p75的膜外段[7]。sTNFR與腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）結合后阻斷了TNF與膜受體的結合，進而抑制TNF功能，保護機體抵抗TNF的病理損傷，已有研究發現sTNFR水平變化在喉癌、宮頸癌等臨床診療中具有重要意義[8-9]。然而，針對iNOS及sTNFR與EC發生發展的相關研究較為少見。本研究探討EC患者血清iNOS、sTNFR的水平及臨床意義，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2017年1月至2020年1月周口市人民醫院收治的55例首診為EC的患者作為EC組。納入標準：①符合《2015年NCCN子宮內膜癌臨床實踐指南解讀》[10]中EC診斷標準；②病理檢查結果為EC；③初診EC；④術前未行放化療、生物免疫治療等抗腫瘤治療。排除標準：①有其他部位腫瘤未治愈；②有嚴重的心腦肝腎或其他疾病；③合并自身免疫性疾病。55例EC患者，年齡24～65歲，平均（48.66±10.32）歲；子宮內膜樣腺癌51例，其他4例；淋巴結轉移10例；Ⅰ～Ⅱ期26例，Ⅲ～Ⅳ期29例。選取55例同期子宮良性病變患者作為子宮良性病變組。納入標準：①因子宮肌瘤等良性病變行子宮全切術；②病理檢查結果為良性；③術前未接受生物免疫療法。排除標準：①有其他部位腫瘤未治愈；②有嚴重的心腦肝腎或其他疾病；③合并自身免疫性疾病。55例子宮良性病變患者，年齡31～64歲，平均（49.31±11.46）歲；子宮肌瘤33例，子宮內膜息肉12例，子宮肥大癥6例，子宮腺肌病4例。另選取55例同期同年齡段健康體檢的女性作為健康組，年齡 29～65歲，平均（49.14±10.58）歲。EC組、子宮良性病變組及健康組研究對象的年齡比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經醫院倫理委員會批準通過，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 檢測方法

取3組研究對象晨起空腹靜脈血3 ml，離心（3000 r/min，10 min，離心半徑12 cm）分離出血清后置于-20℃冰箱中保存待檢。

iNOS檢測[11]：采取雙抗體酶聯免疫吸附法，采用抗人iNOS抗體包被微孔板，制成固相抗體，包被單抗的微孔中依次加入iNOS，再與辣根過氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）標記的iNOS抗體相結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，加入酶底物四甲基聯苯胺（tetramethylbenzidine，TMB），出現黃色時加入硫酸終止，用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度（optical density，OD）值，以空白孔調零，450 nm波長依序測量各孔OD值，通過標準曲線計算樣品中iNOS濃度。

sTNFR檢測[12]：包括sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ，采取雙抗體夾心酶聯免疫吸附法，采用抗人sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ單抗包被于酶標板上，標準品與樣品中的sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ和單抗結合，加入生物素化的sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ抗體，形成免疫復合物，HRP標記的鏈霉抗生素蛋白與生物素相結合，加入酶底物鄰苯二胺（o-phenylenediamine，OPD），出現黃色時加入硫酸終止，在492 nm處測得OD值，sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ值與OD值呈正比，通過繪制標準曲線計算標本中的sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ濃度。

1.3 觀察指標

比較EC組、子宮良性病變組及健康組研究對象血清iNOS及sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ水平，比較Ⅰ～Ⅱ期與Ⅲ～Ⅳ期EC患者血清iNOS及sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ水平。對手術切除的子宮內膜標本進行免疫組化檢測，分析EC患者血清iNOS及sTNFR異常表達與臨床特征的關系及影響因素。以iNOS≥1.23 U/ml、sTNF-R Ⅰ≥1.18 ng/ml、sTNF-R Ⅱ≥3.93 ng/ml為高表達[13]。

1.4 統計學方法

采用SPSS 20.0軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析；計數資料以例數及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法；影響因素分析采用多因素Logistic回歸分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血清iNOS及sTNFR水平的比較

EC組患者血清iNOS、sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ水平均高于子宮良性病變組及健康組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；子宮良性病變組與健康組血清iNOS、sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ水平比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（表1）

表1 EC組、子宮良性病變組及健康組研究對象血清iNOS及sTNFR水平的比較（±s）

表1 EC組、子宮良性病變組及健康組研究對象血清iNOS及sTNFR水平的比較（±s）

注：a與健康組比較，P＜0.05；b與子宮良性病變組比較，P＜0.05

組別EC組（n=55）子宮良性病變組（n=55）健康組（n=55）F值P值1.33±0.38a b 0.86±0.25 0.81±0.21 54.102 0.000 1.54±0.41a b 0.84±0.26 0.78±0.20 106.848 0.000 4.36±0.71a b 2.79±0.64 2.71±0.61 111.082 0.000 iNOS（U/ml）sTNFR（ng/ml）sTNF-RⅠsTNF-RⅡ

2.2 不同病理分期EC患者血清iNOS及sTNFR水平的比較

Ⅰ～Ⅱ期EC患者血清iNOS、sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ水平均低于Ⅲ～Ⅳ期患者，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表2）

表2 不同病理分期EC患者血清iNOS及sTNFR水平的比較（±s）

表2 不同病理分期EC患者血清iNOS及sTNFR水平的比較（±s）

病理分期Ⅰ～Ⅱ（n=26）Ⅲ～Ⅳ（n=29）t值P值1.12±0.29 1.52±0.43 3.996 0.000 1.40±0.36 1.67±0.52 2.213 0.031 4.12±0.66 4.58±0.74 2.421 0.019 iNOS（U/ml）sTNFR（ng/ml）sTNF-RⅠsTNF-RⅡ

2.3 不同臨床特征EC患者血清iNOS及sTNFR高表達情況的比較

不同病理分期、分化程度及子宮肌層浸潤深度EC患者iNOS、sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ高表達情況比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；不同年齡、病理類型及淋巴結轉移情況EC患者iNOS、sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ高表達情況比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（表3）

表3 不同臨床特征EC患者血清iNOS及sTNFR高表達情況的比較（n=55）

2.4 EC患者血清iNOS及sTNFR高表達影響因素的多因素分析

病理分期為Ⅲ～Ⅳ期、低分化、子宮肌層浸潤深度＞1/2均為EC患者血清iNOS、sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ高表達的獨立危險因素（P＜0.05）。（表4）

表4 EC患者血清iNOS及sTNFR高表達影響因素的多因素分析

3 討論

EC是危害女性生命安全的常見惡性腫瘤之一，主要發生于子宮內膜腺體，以腺癌最常見[14]。EC好發于絕經老年女性，惡性程度較高，由于早期癥狀不足以引起重視，大多數患者就診時已至中晚期，預后相對較差[15]。因此，將EC早期篩查與診斷、有助于治療方案制訂的分子標志物尋找出來，并探索其中的關系具有重要的臨床價值。

本研究發現，EC組患者血清iNOS、sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ水平均高于子宮良性病變組及健康組，子宮良性病變組患者血清iNOS、sTNF-R Ⅰ、sTNFR Ⅱ水平與健康組無明顯差異，這一結果與姜臘元和謝暉[16]、陸林和陸志剛[17]研究結果具有一定相似性，提示iNOS與sTNFR在EC的發生中起到一定促進作用。國外也早有研究報道與本研究結果相似，Li等[18]證實iNOS與EC的發生發展密切相關，Gadducci等[19]發現sTNFR在EC患者血清中水平顯著升高。iNOS主要存在于白細胞等炎性細胞的細胞質中，正常情況下不表達，在病理條件下大量表達，而iNOS催化產生的高濃度NO則參與腫瘤的形成[20]。機體內NO的半衰期較短，因此可通過檢測iNOS水平間接反映NO的生成情況。另一方面，正常人體內的TNF和sTNFR處于平衡狀態，低濃度sTNFR具有運載TNF的作用，協助抑制腫瘤細胞增殖和破壞細胞，高濃度sTNFR則與TNF結合后阻止TNF與TNFR的結合，進而抑制TNF的多種生理功能。當EC發生后，腫瘤組織刺激機體產生TNF以阻止腫瘤的發展，與此同時腫瘤本身也在刺激作用下產生膜TNFR，其中部分脫落至細胞間質，形成了可溶形式，即sTNFR，與TNFR競爭性結合TNF，降低TNF的抗腫瘤作用，進而發揮腫瘤免疫逃逸的作用[21]。本研究中Ⅰ～Ⅱ期EC患者血清iNOS、sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ水平均低于Ⅲ～Ⅳ期患者，這一結果提示iNOS、sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ水平與病理分期有一定聯系，各指標水平越高，腫瘤惡性程度越高。

本研究表明，不同病理分期、分化程度及子宮肌層浸潤深度EC患者iNOS、sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ高表達情況比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；不同年齡、病理類型及淋巴結轉移情況EC患者iNOS、sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ高表達情況比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。病理分期為Ⅲ～Ⅳ期、低分化、子宮肌層浸潤深度＞1/2均為EC患者血清iNOS、sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ高表達的獨立危險因素（P＜0.05）。這說明iNOS、sTNFR的高表達與EC嚴重程度密切相關，提示腫瘤惡性程度較高，也意味著預后可能相對不佳。這對EC的治療也有一定的提示意義，iNOS、sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ高表達表明腫瘤惡性程度高，術后需進一步行放化療，反之腫瘤惡性程度低，考慮術后輔助內分泌治療即可[22]。淋巴結轉移也是評判EC嚴重程度的指標之一，本研究中iNOS、sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ的高表達與是否存在淋巴結轉移無明顯關系，這一結果可能受研究納入病例數較少等因素影響而存在偏倚。

綜上所述，EC患者血清中iNOS、sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ水平均升高，且晚期患者iNOS、sTNF-R Ⅰ、sTNF-R Ⅱ水平均高于早期患者，各指標高表達與病理分期、分化程度、子宮肌層浸潤深度密切相關，這提示iNOS與sTNFR等分子的檢測對早期診斷EC、制訂合理的治療方案、判斷疾病嚴重程度及預后具有重要的臨床意義，未來還需更多的臨床研究和數據加以探索證實。