微衛星不穩定型胃癌的研究進展

李立立，王艷軍，安有志

聊城市第二人民醫院腫瘤內科，山東 臨清 252600

胃癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，其預后不僅取決于分期，還取決于特定的分子分型和組織病理學特征。胃癌是一種復雜的異質性疾病，根據癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA），胃癌可分為4種亞型：①EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）陽性型；②高度微衛星不穩定（microsatellite instability-high，MSI-H）型；③基因組穩定（genomically stable，GS）型；④染色體不穩定（chromosomal instability，CIN）型[1]。MSI-H是其中獨立的亞型，盡管MSI-H在結直腸癌中作為預后的預測因素已得到充分證實，但微衛星不穩定（microsatellite instability，MSI）與胃癌臨床病理特征之間的關系仍然不明確。本文主要對MSI型胃癌的研究進展進行綜述并重點關注MSI-H型胃癌。

1 MSI的定義

錯配修復系統與腫瘤的發生密切相關。微衛星又稱短串聯重復序列，是DNA基因組中小于10個核苷酸的簡單重復序列，約占人類基因的10%，核心序列為16 bp[2]。MSI是指重復序列的插入和缺失導致微衛星長度發生改變，出現新的等位基因，其首次于1993年由Altonen等在遺傳性非息肉性直腸癌中發現，然后在多種惡性腫瘤如胃癌、子宮內膜癌、乳腺癌、前列腺癌和胰腺癌中均發現MSI。Bethesda標準通過對常用的5個微衛星位點（BAT25、BAT26、D2S123、D5S346、D17S250）進行聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測，2個或2個以上位點不穩定判定為MSI-H，1個位點不穩定判定為低度微衛星不穩定（microsatellite instability-low，MSI-L），無位點不穩定判定為微衛星穩定（microsatellite stable，MSS）。當錯配修復基因缺陷時，堿基錯配不能被修復進而產生突變，尤其是在微衛星這種具有重復序列的區域，從而產生MSI表型，錯配修復基因產物主要包括mutL同源物1（mutL homolog 1，MLH1）、PMS1同源物2（PMS1 homolog 2，PMS2）、mutS同源物2（mutS homolog 2，MSH2）、mutS同源物 6（mutS homolog 6，MSH6）4種錯配修復蛋白（mismatch repair protein，MMRP）。其中MLH1和MSH2最為重要，其主要功能是負責對錯配位點進行識別和切除。目前認為MSI的發生機制主要是DNA多聚酶滑動從而導致重復序列中的1個或多個堿基發生錯配，或微衛星同源重組時導致不對等性堿基插入或丟失。

2 MSI在胃癌中的發生率

關于MSI在胃癌中的發生率，各文獻報道并不一致（2.7%～45.0%）[3-4]。MSI-H型胃癌的發病率因地區、國家和種族而異，在西方國家中，MSI型胃癌的發病率為22.0%[5]，亞洲為11.7%～33.8%[6]，歐洲為16.3%～25.2%[6]。日本報告的胃癌患者中，MSI-H型胃癌占10.0%；世界衛生組織報告的胃癌患者中，MSI-H型胃癌占13.0%；TCGA報告的胃癌患者中，MSI-H型胃癌占21.6%[7]。韓國一個研究小組報告了胃癌中MSI-H的發生率，在所有胃癌患者中，MSI-H的發生率為3.2%；在早期胃癌患者中，MSI-H的發生率為10.3%；在晚期胃癌患者中，MSI-H的發生率為19.7%[8]。胃腺瘤逐漸發展至胃癌的過程中，MSI-H的發生率逐漸升高，這可能提示MSI-H型胃癌是通過胃腺瘤逐漸發展而來的[7]。有研究納入120例胃腺癌患者，其中MSI/錯配修復缺陷（mismatch repair deficiency，dMMR）型胃腺癌占11.7%[9]。

MSI-H型胃癌中hMLH1和hMSH2突變率較低，分別為15%和12%，因hMLH1啟動子甲基化所致的MSI-H占比超過50%[10]。有研究者對60例胃癌患者進行微衛星分析，結果發現10例（16.7%）MSI陽性患者免疫組織化學染色（immunohistochemistry staining，IHC）顯示，僅6例（10%）患者缺乏 MLH1（n=3）或 MSH2（n=3）蛋白表達，MSI陽性患者中最常見的微衛星標記是BAT26（90%）[11]。

綜合國內外相關文獻，MSI-H型胃癌的發病率并不一致，但整體而言，MSI-H型胃癌在臨床不常見，其發病率并不高[3-4,12]。MSI-H型胃癌的發病率因國家和種族的不同而不同，除此之外，MSI-H的診斷缺乏統一的標準也是導致發病率不同的原因[5-7,12-13]。

3 MSI的檢測方法

MSI的檢測方法主要包括PCR和IHC。PCR被認為是檢測MSI的金標準，其主要是從腫瘤組織中提取DNA，對其常用的5個微衛星位點（BAT25、BAT26、D2S123、D5S346、D17S250）進行擴增，將擴增的片段進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，以檢測微衛星位點的不穩定性[2]。其缺點是無法顯示4種修復蛋白中哪種蛋白功能缺陷，且實驗時間較長，大約需2周，而且對實驗室的條件要求高，價格昂貴。IHC通過檢查腫瘤組織中錯配修復蛋白的缺失情況以確定微衛星狀態，具有費用低廉、耗時短、操作簡便、對實驗儀器要求不高以及便于臨床推廣等優點，具有較高的臨床應用價值。目前認為PCR與IHC評估腫瘤MSI狀態具有高度一致性，近90%[14]；也有研究報道兩者的一致性高達97.6%[15]。IHC檢測腫瘤微衛星狀態的靈敏度為91.1%，特異度為98.5%，可根據IHC結果決定是否進一步進行PCR檢測，若4種修復蛋白均未表達，則可以判定為MSS，不需要進一步進行PCR檢測，任一蛋白表達缺失則提示MSI[2]。另外，利用外周血進行基因測序也可以明確腫瘤患者的微衛星狀態，但因價格昂貴，目前不作為常用的檢測方法[14]。

4 MSI型胃癌的發生機制

散發胃癌和家族聚集性胃癌患者MSI的發生機制并不相同，大多數散發的MSI-H型胃癌中可觀察到MLH1啟動子區CpG島的超甲基化[7,16-17]，在有胃癌家族史的患者中，遺傳性dMMR可能是重要的MSI發生機制[4]。

在散發胃癌中，MSI-H與表觀遺傳調控有關。眾所周知，微小RNA（microRNA，miRNA）在表觀遺傳調控中具有重要作用，研究發現，MSI-H和MSS均與miRNA的表達水平顯著相關 ，包 括 miRNA-210、miRNA-196b、miRNA-203、miRNA-429、miRNA-200a、miRNA-105、miRNA-99a和has-let-7c[18-21]。miRNA-210和 miRNA-196b均是通過破壞DNA損傷修復基因的功能，導致MSI形成。miRNA-203可能通過定位毛細血管擴張性共濟失調癥突變基因（ataxia telangiectasia mutated，ATM）促進MSI-H的形成，而ATM在誘導DNA損傷信號和啟動細胞周期檢查點信號方面具有至關重要的作用[18]。miRNA-429和miRNA-200a是miRNA-200家族成員，在MSI-H型胃癌患者胃癌組織中的表達水平明顯高于MSS型胃癌患者[18]，miRNA-200家族在促進胃癌細胞生長方面可能發揮重要作用[22]。與MSS型胃癌相比，miRNA-105、miRNA-99a和has-let-7c是在MSI-H型胃癌中表達下調最多的3個miRNA。很少有研究報道miRNA-105、miRNA-99a和has-let-7cs在胃癌中的作用。miRNA-99家族在胃癌中可能通過SNF2H來調節DNA損傷反應，其過表達可以抑制SNF2H的表達，降低DNA損傷修復率和整體修復效率[18]。

散發胃癌患者MSI的主要發生機制是MLH1基因啟動子區域高甲基化，MLH1基因rs1800734G等位基因具有更高的轉錄因子結合活性和更低的MLH1基因啟動子區域甲基化水平，該等位基因攜帶者具有更高的MLH1蛋白表達水平和更低的MSI發生率，相反MSH2基因rs2303428CC基因型具有增加MSI發生率的趨勢。也有研究表明，rs1800734G等位基因在有胃癌家族史的患者中反而增加MSI的發生率，提示該等位基因的作用與胃癌家族史有關，其可能通過遺傳性dMMR導致MSI的發生[4]。

還有研究表明，MSI型胃癌還可能與激活素A受體 2A（activin A receptor type 2A，ACVR2A）突變、磷酸酶和張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）突變有關[23-24]。ACVR2A蛋白是一種跨膜受體，是轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）的超級家庭成員，參與不同的生物過程，其活性信號通路在調節各種腫瘤細胞的分化、增殖和凋亡方面發揮了重要作用。ACVR2A基因位于2號染色體上，由11個外顯子組成，在外顯子3和外顯子10上包含兩個八聚腺苷DNA微衛星位點，這使得它極易在MSI-H型胃癌中發生突變。ACVR2A是MSI-H型胃癌中最常突變的基因，突變的ACVR2A與MSI-H具有顯著關系[23]。PTEN突變導致MSI型胃癌發生的機制目前暫不明確，PTEN突變是MSI-H型胃癌中普遍的基因突變，PTEN突變可能導致DNA損傷修復失敗，進而引起 MSI的發生[24]。

5 MSI型胃癌與飲食的關系

MSI型胃癌的發生風險與紅肉和肉醬的消耗量呈正相關，與白肉的消耗量呈負相關，與總蛋白質和亞硝酸鹽的攝入量也呈正相關，而與微量營養素的攝入量無關[25-26]。有學者提出吸煙和飲酒均與MLH1基因啟動子高甲基化的胃癌有關，可能會影響MSI型胃癌的發展，蔬菜攝入量高、馬鈴薯攝入量低、hMLH1基因啟動子高甲基化導致胃癌的發生風險增加[27]。谷胱甘肽S轉移酶mu1（glutathione S-transferase mu 1，GSTM1）、谷胱甘肽S轉移酶 θ1（glutathione S-transferase theta 1，GSTT1）、細胞色素P450家族成員1A1（cytochrome P450 fami-ly 1 subfamily A member 1，CYP1A1）、細胞色素P450家族成員2E1（cytochrome P450 family 2 subfamily E member 1，CYP2E1）、醛脫氫酶2家族成員（aldehyde dehydrogenase 2 family member，ALDH2）、L-myc基因的多態性和大多數飲食因素不是MLH1啟動子高甲基化胃癌的獨立危險因素[2]。

6 MSI型胃癌與幽門螺桿菌（helicobacter pylori，HP）感染的關系

與非MSI型胃癌相比，MSI-H型胃癌患者中HP感染更為常見，HP陽性與MSI-H型胃癌的發生有關，這預示著HP在MSI-H型胃癌中可能影響了錯配修復系統[9,11]。有研究在60例胃癌患者中發現了13例（21.7%）HP感染，包括3例MSI型胃癌患者[11]。HP感染會導致慢性淺表性胃炎、萎縮性胃炎、腸化生、異型增生，最終誘導CIN型或MSI型胃癌形成，且HP感染會導致錯配修復基因及蛋白表達下調，損害DNA錯配修復途徑[10]。將胃癌細胞與HP一起培養，發現錯配修復蛋白及其mRNA水平降低，說明HP感染可能是通過降低錯配修復蛋白的mRNA水平影響錯配修復蛋白的表達，進而使胃黏膜細胞中突變累積，促進胃癌的發生。MLH1啟動子甲基化可能與HP感染的持續時間有關，在HP根除后，胃黏膜中的錯配修復蛋白表達增加，HP感染對錯配修復蛋白表達的影響在其根除后部分可逆[10]。

7 MSI型胃癌與程序性死亡受體配體1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，也稱PD-L1）的關系

MSI-H是針對程序性死亡受體1（programmed cell death 1，PDCD1，也稱PD-1）或其配體PD-L1的免疫治療反應的潛在預測因素。PD-L1表達與MSI-H狀態之間的關系仍然鮮為人知。大多數研究認為胃癌中MSI-H狀態與PD-L1的高表達密切相關[13,16,28-30]。有研究調查了MSI-H型胃癌患者中PD-L1的表達情況，該研究分析78例MSI-H型胃癌患者胃癌組織中PD-L1的表達情況，PD-L1表達分為腫瘤細胞和免疫細胞上的表達，在48例（61.5%）胃癌患者的胃癌組織中觀察到PD-L1表達，包括7例（9.0%）腫瘤細胞PD-L1表達和47例（60.3%）免疫細胞PD-L1表達[31]。另一項研究將腫瘤細胞中PD-L1的表達標記為PD-L1[T]，將腫瘤浸潤免疫細胞中PD-1和PD-L1的表達分別標記為PD-1和PD-L1，結果發現，PD-1、PD-L1[T]和PD-L1在46例MSI型胃癌患者中的陽性表達率分別為59%、35%和57%，在169例MSS型胃癌患者中的陽性表達率分別為45%、22%和40%。統計分析表明，MSI型胃癌患者中PD-L1的陽性表達率高于MSS型胃癌患者（P=0.044）[30]。MSI型胃癌患者中T細胞和巨噬細胞高密度滲透，其中T細胞滲透占30%～50%，巨噬細胞滲透占20%，70%的MSI型胃癌患者表達PD-L1[22]。PD-L1表達與胃癌中高密度的腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）和dMMR密切相關，dMMR導致腫瘤細胞積累頻繁的基因突變，由于突變負荷過重，腫瘤細胞產生多種新抗原，引發T細胞活化和募集，表現出活躍的免疫微環境，導致多個免疫檢查點蛋白（包括PD-1和PD-L1）表達顯著增加[13,29-30]。另外，在MSI-H型胃癌中，觀察到頻繁的框移突變，包括ARID1A、RNF43、NF1、MSH6、BRD3、NCOA3、BCORL1、TNKS2和NPM1，框移突變的數量與PD-L1的表達也顯著相關[32]。

8 MSI型胃癌與人端粒酶逆轉錄酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）蛋白表達的關系

hTERT作為端粒酶的調節亞單位，不僅對端粒酶的活性有一定的依賴和限制作用，而且對腫瘤的發展也具有重要作用。hTERT基因表達決定端粒酶的活性。端粒酶以自身的RNA為模板，可以連續合成新的端粒DNA序列（TTAG重復序列），這些序列被添加到染色體的末端，以補償端粒損失并防止端粒縮短，從而保持基因穩定性。端粒功能障礙與各種腫瘤相關。胃癌和癌前病變患者中hTERT的表達水平隨著端粒酶活性的增加而增加，且與腫瘤的分化程度有關，在分化不良的腫瘤中，hTERT表達水平較高。研究表明，hTERT和端粒酶活性增加可能與胃癌的發展有關，MSI與hTERT的表達呈負相關，在hTERT陽性患者中，MSS占71.9%（41/57），在hTERT陰性患者中，MSI占72.2%（13/18），MSS 占27.8%（5/18）[33]。該研究中，hTERT未在正常胃黏膜中表達，而在腸上皮化生、異型增生和胃癌中的表達逐漸增加。

9 MSI型胃癌的臨床特點及預后

MSI型胃癌與老年、女性、遠端位置、印戒細胞型、腸型、無神經浸潤、無或少見淋巴結轉移、浸潤較淺、早期、脈管癌栓陽性、淋巴血管侵犯（lymphovascular invasion，LVI）、黏膜下浸潤、腫瘤較大、腹膜受侵有關，且其復發率較低，預后良好，患者的生存率高[34-49]。

10 MSI對胃癌臨床治療的指導作用

目前胃癌的治療方法包括手術、放療、化療、免疫檢查點抑制劑治療和靶向治療等，而MSI狀態對胃癌臨床治療的指導作用主要涉及手術、化療和免疫檢查點抑制劑治療3個方面。

通過復習文獻發現，MSI-H型胃癌患者能夠從免疫檢查點抑制劑治療中受益，原因可能是MSI-H型胃癌患者的體細胞突變頻率增加、腫瘤抗原擴增、免疫原性增強，從而吸引大量TIL，表現出活躍的免疫微環境，加之免疫檢查點分子普遍表達，因此使MSI-H型胃癌更易從免疫治療中獲益[50-54]。此外，遺傳性MSI型胃癌較散發MSI型胃癌有更利于抗腫瘤免疫反應的腫瘤微環境，可能是因為前者的腫瘤微環境有助于3'-核酸修復外切酶1（three prime repair exonuclease 1，TREX1）基因發生突變，而該基因突變能夠增強T淋巴細胞對腫瘤細胞的殺傷作用[4]。基于此，MSI-H型進展期胃癌適合免疫治療，甚至有研究提出輔助免疫治療可能是比常規化療更好的策略[52]。對于可切除的胃癌，MSI狀態對早期胃癌的影響尚未得到徹底評估，MSI狀態無法預測早期胃癌的預后，然而，早期MSI-H型胃癌中頻繁出現LVI可能有助于指導患者的治療，如內鏡治療或有限的淋巴結清掃。MSI狀態對胃癌圍手術期是否聯合化療的指導意義尚未達成一致看法，絕大多數研究認為，MSI-H型胃癌患者可能無法從圍手術期化療中受益（或可能獲得不利影響），僅僅手術即可獲益，可能的機制如下：MSI-H型胃癌的某些分子變化可能導致患者對化療產生耐藥，表觀遺傳變化[如骨形態發生蛋白 4（bone morphogenetic protein 4，BMP4）的甲基化]與鉑類耐藥有關，MLH1啟動子甲基化與接受奧沙利鉑輔助化療的胃癌患者的生存率低有關[35,48]。DNA靶向細胞毒性化療會增加MSI型腫瘤的治療抵抗，導致dMMR腫瘤的獲得性耐藥，這種情況可能會增加遺傳的不穩定性，導致腫瘤細胞的異質性和侵襲性增強，因此，MSI-H/dMMR型胃癌患者的輔助化療可在不降低腫瘤復發風險的情況下引起化療抵抗，一旦復發則預后不佳[52]。MSI-H/dMMR型腫瘤與豐富的免疫細胞有關，這些細胞可能會在手術后抑制殘留微轉移，但是輔助化療可誘導免疫抑制[51-52]。MSI型腫瘤具有淋巴細胞浸

潤的特征，這有助于抗腫瘤免疫反應，而化療的免疫抑制作用削弱了MSI型腫瘤的這一作用，完整的錯配修復系統可以確保5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）在干擾DNA代謝之前有效地從DNA中消除，這也增加了藥物的細胞內濃度，從而增加了MSS型患者的細胞毒性，而缺陷的錯配修復系統可能減少了DNA修復，從而削弱了5-FU在MSI患者中的作用[9]。多數研究認為Ⅱ期和Ⅲ期MSI-H型胃癌預后良好，僅單獨接受手術治療即可[6,9,52,55]，也有研究認為Ⅲ期MSI-H型胃癌的圍手術期化療可使患者獲得更好的生存獲益[39-40]。因此，MSI與胃癌的關系仍有待討論，需要更多的前瞻性研究來確定MRI狀態對胃癌化療反應的預測作用。

11 MSI表達的異質性

由于腫瘤的異質性，有研究者在同一胃癌患者中檢測到MSI與MSS并存，約85%的原發腫瘤區域MSH2缺失表達，表現為MSI；5%～23%的原發腫瘤區域MSH2表達，表現為MSS；所檢測的10個轉移淋巴結中MSH2均表達，表現為MSS。MSS占原發腫瘤的5%～23%，只有這部分腫瘤擴散并轉移到淋巴結[48]。這一結論進一步支持了MSI型胃癌的惡性程度較低并具有更好的生存預后的觀點。微衛星狀態異質性的原因尚不清楚，腫瘤細胞亞克隆中參與DNA甲基化調控和維持的基因突變是否可能助成這一現象，需要進一步研究[10]。

12 小結

綜上所述，MSI型胃癌在臨床中并不常見，患者多存在胃癌家族史，其發生機制與MLH1啟動子區域CpG的超甲基化及dMMR有關，臨床預后較好，Ⅱ期和Ⅲ期MSI-H型胃癌僅單獨接受手術治療即可，圍手術期化療可能不能給患者帶來生存獲益，甚至可能增加不必要的不良反應，MSI-H型胃癌因其獨特的免疫微環境而能夠從免疫檢查點抑制劑治療中獲益，免疫檢查點抑制劑有望成為MSI-H型胃癌圍手術期治療的新手段。