Myo1h基因敲除小鼠模型的建立與初步觀察

溫士強,孫榕榕,時 函，李永明

Ⅰ類肌球蛋白基因(Myo1h)作為非常規型肌球蛋白1H的調控基因，對頜骨的生長發育尤為重要，成為近年來的研究熱點[1-2]。首先，Tassopoulou-Fishell等通過研究發現位于12q24.1的Myo1h基因與下頜前突相關，其中rs10850110的G等位基因在下頜前突病例中顯著多于對照組，且于不同種族背景中無差異，為Myo1h基因可能有助于下頜前突提供了遺傳證據[3]。Cruz等通過主成分分析的研究發現Myo1h(rs10850110 AT，p.Pro1001 Leu與下頜前突顯著相關，推測Myo1h為下頜前突易感基因，驗證了以往研究的結果。

目前已知人Myo1h基因第3、25、30號外顯子與小鼠存在高度同源性，且有研究表明小鼠Myo1h同源基因第3號、25號外顯子的突變能夠導致一種罕見的隱性先天性通氣不足，并具有明顯的致死效應[6]，但小鼠Myo1h同源基因對頜骨生長發育有何影響仍未知。而Myo1h基因第30號外顯子rs3825393多態位點的突變能夠增加漢族人群中下頜后縮的風險[7]，也進一步說明了位于Myo1h基因尾域結構的第30號外顯子對顱頜面骨生長發育中發揮著重要作用。

研究表明Myo1h基因是頜骨生長發育畸形的易感基因，本課題組前期研究也證實Myo1h基因為下頜前突的易感基因，并發現Myo1h基因可能通過對下頜軟骨發育和形態形成產生影響，進而參與下頜前突等顱頜面發育異常的發生。為進一步研究Myo1h基因對哺乳動物顱頜面骨骼發育的影響，構建Myo1h基因敲除實驗動物模型十分必要，目前國內外對此部分的研究尚處于起步階段。基于Cripr/Cas9技術的諸多優勢[8-10]，本研究采用Cripr/Cas9技術構建Myo1h-/-小鼠模型，為進一步探索Myo1h基因對骨生長發育中的影響，尤其是為探究位于哺乳小鼠Myo1h同源基因尾域結構的第30號外顯子對于顱頜面骨生長發育的作用提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

3～4周齡SPF級C57BL/6JMyo1h基因敲除的嵌合體F0小鼠3只，雄鼠1只雌鼠2只，均由同濟大學生科院提供。所有小鼠均飼養在同濟大學醫學院實驗動物中心SPF級動物房，溫度控制在25 ℃左右，濕度保持在70%左右，明暗循環12 h/d，自由飲水和進食。小鼠籠盒、墊料、飼料、飲用水均經高溫高壓消毒滅菌處理。飼養過程中，每2 d進入動物房觀察和記錄小鼠的生長情況。每3～4 d更換1次小鼠墊料，每天補充飼料和飲用水。所有操作均符合同濟大學實驗動物倫理學要求(倫理號：TJLAC-019-150)。

1.2 主要儀器與試劑

多聚甲醛(上海碧云天科技有限公司，中國)；乙二胺四乙酸鈉脫鈣液(上海碧云天科技有限公司，中國)；瓊脂糖粉末(上海博晗生物科技有限公司，中國)；TBE粉末(上海碧云天科技有限公司，中國)；DNA聚合酶(南京諾唯贊生物科技股份有限公司，中國)；DL1000 marker(寶日醫生物技術(北京)有限公司，中國)；6X DNA凝膠加樣緩沖液(寶日醫生物技術(北京)有限公司，中國)；核酸染色劑Gold View(白鯊生物科技有限公司，中國)；PCR逆轉錄試劑盒(寶日醫生物技術(北京)有限公司，中國)；熒光定量PCR SYBR Green(翌圣生物科技(上海)股份有限公司，中國)；PCR擴增儀(伯樂生命醫學產品(上海)有限公司，中國)；熒光定量PCR儀(瑞士羅氏公司，瑞士)；凝膠成像系統(伯樂生命醫學產品(上海)有限公司，中國)；電泳儀(天津賽力斯自動化科技有限公司，中國)；DAPI染色液(上海碧云天生物技術有限公司，中國)；電子天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司，中國)；高速冷凍離心機 (賽默飛世爾科技(中國)有限公司，中國)；低速離心機(日本TOMY公司，日本)；純水儀(威立雅水處理技術(上海)有限公司，中國)；正置熒光顯微鏡(Nikon，日本)

1.3 Crispr/Cas9技術構建Myo1h基因敲除小鼠

1.3.1Myo1h基因敲除位點的設計及sgRNA的獲取 通過NCBI和Ensembl網站查詢小鼠Myo1h基因信息(NCBI Gene ID：231646；Ensembl，Gene:Myo1hENSMUSG00000066952)，確定敲除序列片段為第30號外顯子后設計向導RNA(gRNA)，利用Cas9/gRNA靶點效率檢測試劑盒將設計的gRNA靶點體外轉錄成單向導RNA(sgRNA)并檢測轉錄產物活性，為了防止脫靶效應，分別在30號外顯子前后緊鄰的內含子上設計獲得兩對有效的sgRNA，序列如下，sgRNA-1:5′-CGAGGGAGTTTCTCTCGCAG-3′，sgRNA-2:5′-TTACAGTTCTACGTCAGTCC-3′，sgRNA-3:5′-GTGGTAAGTGGTGCGTGCGG-3′，sgRNA-4:5′-AAATCGACCACTCCTAGCCG-3′。

1.3.2 體外獲取受精卵 向預先準備好的4周齡左右C57BL/6雌鼠腹腔注射血促性素與人絨毛膜促性腺激素誘導排卵，另備一只8周齡左右C57L/6雄鼠采精子。將在體外獲取的精子與卵細胞結合，顯微鏡下收集受精卵。

1.3.3 顯微注射與胚胎移植 通過顯微鏡注射的方式，將Cas9 mRNA與sgRNA導入到小鼠受精卵中，之后將存活狀態良好的受精卵移植到與結扎雄鼠合籠后陰道見栓的代孕雌鼠生殖系統，傷口縫合后飼養于獨立通氣籠盒環境中。

1.3.4 F0代小鼠獲得與后續繁殖策略 代孕雌鼠產下的仔鼠1周齡后剪下腳趾并編號，提取腳趾DNA，經基因型鑒定及測序后篩選出Myo1h突變小鼠F0代嵌合體小鼠。之后利用篩選出的F0(The founder)代Myo1h基因敲除小鼠與野生型小鼠進行繁殖，獲得雜合F1(the first filial generation，子1代)代，利用F1代雌雄小鼠進行交配，經過基因型鑒定后獲得純合F2(the second filial generation，子2代)代小鼠(Myo1h-/-)作為實驗鼠，并以野生型小鼠(基因型為Myo1h+/+)作為對照。

1.4 Myo1h基因敲除小鼠的基因型鑒定

待F2代仔鼠10 d齡時，將小鼠對應腳趾剪取于經高溫高壓消毒滅菌的1.5 mL EP管中，在EP管中加入100 μL Buffer A(0.04 mmol/L NaOH溶液)，輕輕渦旋混勻。恒溫金屬浴100 ℃處理30 min，離心(12 000 r/min、5 min)，轉移上清液至新的EP管中，加入9 μL Buffer B(pH=6.8的Tris-HCl)，混勻，4 ℃或-20 ℃放置備用或者直接用于PCR擴增。基因型鑒定引物設計如下，Myo1h正向：5′-AGGGTAGAGAGAGCAGGTGG-3′；Myo1h反向：5′-ATCTTGGCTGGGTTCTGAGC-3′。按PCR說明書Vzyme Mix(10 μL)、引物Myo1h正向(1 μL)、引物Myo1h反向(1 μL)、ddH2O(7.5 μL)、DNA模板(0.5 μL)的體系依次加樣，置于PCR反應儀，開啟預設程序。配制2%濃度的瓊脂糖凝膠，電壓設定120 V，時間30 min，電泳鑒定。

1.4.1 肺組織及腦組織的提取 分別取F2代基因型為Myo1h+/+和Myo1h-/-的實驗小鼠(n≥3)，1%戊巴比妥鈉(80 mg/kg)麻醉下，打開胸腔，暴露左心尖，行PBS灌流后，解剖提取肺部組織；解剖顱頂部皮膚及軟組織，小心剔除顱骨，提取腦部組織，并置于焦碳酸二乙酯處理水(diethylpyro-carbonate-treated water, DEPC)(上海碧云天生物技術有限公司)預浸泡的RNA free研磨碗中，倒入液氮速冷，研磨棒充分研磨。

1.4.2 實時定量PCR檢測Myo1h基因的表達 研磨后的肺及腦組織細粉末加1 mL Trizol，消化1 min，轉移至1.5 mL RNA free EP管中，加入200 μL氯仿，搖勻后靜置10 min， 4 ℃離心(12 000 r/min，20 min)。小心吸取最上層無色水相液，加入等量異丙醇，搖勻后靜置10 min，4 ℃離心(12 000 r/min、20 min)。棄上清，加入適量75%乙醇(DEPC水配制)，4 ℃離心(8 000 r/min、5 min)，重復洗滌2次棄上清，無香紙上干燥。用10 μL DEPC水充分溶解沉淀，在超微量紫外分光計上機測定RNA濃度，反轉錄至cDNA。RT-qPCR引物設計如下，Myo1h正向：5′-TTCACATCTCACCAGCGGAC-3′，Myo1h反向：5′-TAACTGGAGGGGTCCATGCT-3′。按qPCR酶5 μL，引物Myo1h正向(0.5 μL)，引物Myo1h反向(0.5 μL)，cDNA模板(0.5 μL)，DEPC水(3.5 μL)的體系依次加樣，每樣設3個復孔，離心后置熒光定量PCR儀，開啟預設程序，分析數據。

1.4.3 免疫印跡(Western Blot，WB)檢測Myo1h蛋白的表達 兩組蛋白樣品在濃度為7.5%的SDS-PAGE膠孔中加樣，接通電源，濃縮膠恒定電壓80 V電泳 30 min，分離膠恒定電壓100 V電泳60 min，恒定電流200 mA濕法轉膜120 min，置于5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，TBST洗膜后，Anti-Myo1h antibody-C-terminal一抗(艾博抗上海貿易有限公司)稀釋液4 ℃過夜孵育；TBST洗膜后，加入辣根過氧化物酶標記的驢抗山羊IgG(H+L)二抗(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)稀釋液室溫孵育2 h，TBST洗膜后，運用ECL化學發光試劑盒顯影(內參蛋白為β-actin)。

1.4.4 不同組織中Myo1h陽性細胞免疫熒光染色 ①組織處理：實驗組和對照組小鼠提取下頜髁突組織后，經4%多聚甲醛固定48 h、10%乙二胺四乙酸鈉脫鈣21 d、組織脫水、石蠟包埋，以4 μm的厚度進行切片，60 ℃烘烤30 min。實驗組和對照組小鼠腦組織與肺組織取樣后行常規4%多聚甲醛固定48 h，組織脫水、石蠟包埋，以4 μm的厚度進行切片，60 ℃烘烤30 min。②組織染色：將切片脫蠟、浸水，95 ℃抗原修復，兔抗-Myo1h 多克隆抗體一抗(北京博奧森生物技術有限公司)4 ℃過夜孵育；PBS清洗后，孵育辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(H+L)二抗1 h(上海碧云天生物技術有限公司)；PBS 清洗后，滴加DAPI染色液，洗去后封片。在正置熒光顯微鏡下拍照，隨機選取每只小鼠第一磨牙根分叉區域牙槽骨、腦及肺組織3個高倍鏡下視野，計數Myo1h陽性細胞數。

1.5 Myo1h基因敲除小鼠的生長發育變化觀察

1.5.1 小鼠下頜骨Micro-CT掃描分析 分別取F2代基因型為Myo1h+/+和Myo1h-/-的實驗小鼠(n≥3)，1%戊巴比妥鈉(80 mg/kg)麻醉下解剖提取雙側下頜骨，4%多聚甲醛固定24 h，剔除下頜骨附著的肌肉等軟組織，選取合適的裝管方向，用泡沫塑料固定，掃描精度10 μm，開機掃描。選取下頜第一磨牙根分叉的頜骨，連續30層作為骨密度分析的感興趣區(ROI)；經三維重建后的下頜骨，用Image J軟件測量下頜中切牙與牙槽骨交界處至髁突頂的直線距離，測量3次后取平均值作為有效下頜骨長度。

1.5.2 小鼠有效身長的測量 實驗組與對照組分別取4周齡小鼠(n≥3)，經1%戊巴比妥鈉(80 mg/kg)麻醉，在小鼠全身放松的情況下，以左手食指、中指與無名指輕壓小鼠使其全身舒展開仰臥于實驗臺，用直尺測量小鼠鼻尖部到肛門的距離為身長。

1.6 統計學方法

2 結 果

2.1 小鼠培育與基因型鑒定

經繁殖培育的F2代小鼠PCR擴增后，瓊脂糖凝膠電泳基因型片段分3種：①擴增長度為430 bp左右，為純合敲除型(Myo1h-/-)小鼠；②擴增長度為650 bp左右，為野生型(Myo1h+/+)小鼠；③擴增長度介于430 bp和650 bp之間且存在兩個電泳條帶的為雜合(Myo1h+/-)小鼠。經過瓊脂糖凝膠電泳實驗鑒定，本研究成功獲得Myo1h+/+，Myo1h+/-，Myo1h-/-三種基因型的F2代小鼠(圖1 )，其中基因型Myo1h-/-小鼠為實驗鼠(圖1 箭頭所示)。

箭頭示基因型Myo1h-/-

2.2 mRNA表達水平比較

為了進一步確認PCR結果的可靠性，選取經PCR鑒定獲得的Myo1h+/+小鼠和Myo1h-/-小鼠，經實時定量PCR的方法檢測其大腦及肺部組織Myo1h基因的表達情況，結果如圖2示，相較于Myo1h+/+小鼠的正常表達，Myo1h-/-小鼠腦及肺部組織mRNA表達水平顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)，結果與PCR方法鑒定結果一致，驗證了Myo1h基因的敲除效果。

A：腦組織實時定量PCR結果；B：肺組織實時量定PCR結果；**：P<0.01，****：P<0.000 1

2.3 腦組織Myo1h蛋白表達水平對比

分別提取兩種基因型小鼠的腦組織蛋白，Western Blot實驗結果顯示，在保持β-Actin內參蛋白基本一致的情況下，Myo1h+/+小鼠腦組織的Myo1h蛋白表達正常，而Myo1h-/-小鼠腦組織的Myo1h蛋白表達降低(圖3)，說明經基因敲除后的小鼠在蛋白水平上可實現Myo1h的敲除。

圖 3 Myo1h基因敲除后，Myo1h蛋白表達情況

2.4 敲除后組織中Myo1h基因表達降低

Myo1h+/+小鼠與Myo1h-/-兩組小鼠的Myo1h基因免疫熒光染色結果顯示基因敲除小鼠髁突軟骨層中的Myo1h表達降低(圖4 A、D)；同時觀察到Myo1h基因主要表達在髁突軟骨表層及肥大細胞層(圖4 A)。Myo1h-/-小鼠腦組織中的Myo1h表達降低(圖4 B、E示)；Myo1h-/-小鼠肺組織中的Myo1h表達也降低(圖4 C、F)。該結果表明，構建的Myo1h基因敲除小鼠的敲除效果實現了體內驗證。

A：下頜髁突組織( ×200)； B：腦組織( ×200)； C：肺組織( ×200)；D：髁突組織Myo1h陽性細胞表達比例； E：腦組織Myo1h陽性細胞表達比例；F：肺組織Myo1h陽性細胞表達比例；**：P<0.01，***：P<0.001

2.5 下頜骨Micro-CT骨密度分析

利用Micro-CT對4周齡Myo1h+/+小鼠與Myo1h-/-小鼠右側第一磨牙根分叉處頜骨掃描分析，并對BV/TV、BS/BV、Tb.N以及Tb.Th等骨密度相關參數進行統計學分析后發現Myo1h基因第30號外顯子的敲除并未引起下頜骨密度的改變(圖5)。

A：Myo1h+/+小鼠下頜骨Micro-CT掃描結果；B：Myo1h-/-小鼠下頜骨Micro-CT掃描結果；C：骨體積分數BV/TV分析；D：單位體積骨組織面積BS/BV分析；E：骨小梁數目Tb.N分析；F：骨小梁平均厚度Tb.Th分析；ns：無顯著差異

2.6 有效下頜骨長度及身長的測量

利用Micro-CT對4周齡Myo1h+/+小鼠與Myo1h-/-小鼠右側下頜骨進行掃描重建，并對下頜骨的有效頜骨長度(EfML)進行測量后發現野生型小鼠有效下頜骨長度為(8.980±0.605)mm，純合敲除型小鼠有效下頜骨長度為(9.436±0.314)mm，經獨立樣本t檢驗統計學分析組間差異得知，Myo1h基因第30號外顯子的敲除并未引起有效下頜骨長度差異性改變(圖6 A、B)；但測量4周齡小鼠的有效身長后發現野生型小鼠身長為(8.033±0.146)cm，純合敲除型小鼠身長為(7.610±0.139)cm，經獨立樣本t檢驗統計學分析組間差異得知，Myo1h基因的突變能夠導致純合Myo1h小鼠身長的下降(圖6 C，D)。

A：Micro-CT三維重建后有效下頜骨長度測量；B：有效下頜骨長度分析；C：有效身長測量；D：有效身長統計學分析結果；*：P<0.05，ns：無顯著差異

3 討 論

3.1 Myo1h基因與頜骨發育

肌球蛋白(Myosin)是骨骼肌中重要的結構功能蛋白，由頭部、頸部以及尾部三部分共同構成，作為細胞骨架的分子馬達，通過水解ATP酶產生能量為肌肉收縮提供動力[11]。根據其來源不同，可分為常規型肌球蛋白與非常規型肌球蛋白兩大類[12]，由于非常規型肌球蛋白在肌肉細胞中含量極低，故又稱非肌肉蛋白[11]，并且Myo1h基因在接受過正頜外科手術患者的咬肌中表達極低也被證實[13]。非常規型肌球蛋白在生物體中扮演著重要的角色，尤其在細胞運動、細胞器運輸和信號轉導過程中發揮著至關重要的作用[14-15]。非常規型肌球蛋白Ⅰ(Myosin 1H蛋白)只有一條重鏈，尾部較短，但它尾部結構域的多樣性卻提升了人們對該類肌球蛋白的認知[16]。而Myosin 1H蛋白屬于Ⅰ類非常規型肌球蛋白同工酶之一[17]，其在視覺、聽覺以及平衡功能中有重要作用[15,18]。

研究表明，Ⅰ類肌球蛋白基因(Myo1h)的突變能夠在生物體內引起不同的生長發育結果，比如Myo1h基因突變能夠導致下頜后縮[7,19]，其12q24位點的突變卻能夠造成下頜前突[3]。da Fontoura等[20]通過對269例受試對象的基因型-表型關聯主成分分析研究發現PC2(principle component 2)與Myo1h上游SNP rs11066446相關聯，揭示了在骨性錯牙合畸形患者中，遺傳因素在頜骨矢狀位和垂直位發育中發揮重要作用。此外，Cruz等[4]在對54例骨性Ⅲ類患者和120例對照組的10個候選位點進行研究后發現，Myo1h(rs10850110 A

3.2 Myo1h基因敲除小鼠

Crispr/Cas9技術是通過sgRNA的序列保證基因編輯的特異性，該技術可應用于基因敲除、插入、堿基編輯等操作，免疫原性較低[23]，與其他基因編輯方法相比較，Crispr/Cas9技術具有效率高、安全性可靠、適用范圍廣等優勢，是構建基因敲除動物模型的有效工具[24]。基于Crispr/Cas9技術的諸多優點以及Myo1h基因的研究現狀，本課題組采用Crispr/Cas9技術構建Myo1h基因敲除F0代嵌合體小鼠，利用F0與純合野生型小鼠配籠繁殖得到F1代Myo1h雜合小鼠，再利用F1代雜合小鼠進行自交得到F2代Myo1h純合子小鼠，并按照SPF級標準進行飼養繁殖，隨后采用較為簡便易操作的瓊脂糖凝膠電泳的方法進行基因型鑒定，并對基因敲除后小鼠的下頜骨密度、有效下頜骨長度及有效身長等表型進行初步評估。

經過本研究體內、體外的驗證，發現：①構建小鼠Myo1h同源基因第30號外顯子全敲除模式動物后，能夠獲得基因型為Myo1h-/-的純合小鼠，并能正常存活、繁殖且無明顯致死性；②經提取肺組織、腦組織經熒光定量PCR實驗，驗證了純合敲除型小鼠組織中Myo1h表達降低；③經髁突組織、腦組織以及肺組織免疫熒光染色表明純合敲除型小鼠各組織中Myo1h表達降低；且在蛋白水平上也驗證了純合敲除型小鼠腦組織的Myo1h蛋白降低，實現了體內驗證。以上三點證明本研究成功構建了Myo1h基因敲除小鼠。

3.3 Myo1h基因敲除小鼠的生長發育特點

本研究從頜骨長度、身長、下頜骨生長中心髁突中基因表達等方面，觀察了Myo1h基因敲除后小鼠的生長發育特點。具體有以下幾點：①經髁突組織、腦組織以及肺組織免疫熒光染色表明純合敲除型小鼠各組織中Myo1h表達降低，本實驗也首次在哺乳動物小鼠髁突軟中內觀察到Myo1h基因主要表達在軟骨表層及肥大細胞層，推測該基因可能與髁突軟骨發育相關；②Myo1h基因第30號外顯子敲除后，F2代野生型小鼠與純合敲除型小鼠下頜骨密度及有效下頜骨長度并未出現差異性改變，推測Myo1h基因對下頜骨的生長發育可能存在協同基因，具體的作用途徑與機制有待進一步的研究；③Myo1h基因第30號外顯子敲除后，純合敲除小鼠的有效身長出現減少。

綜上所述，本課題組獲得能夠正常存活、繁殖且穩定遺傳的Myo1h基因敲除的模式小鼠。基于觀察時間的限制，盡管暫未發現Myo1h基因敲除小鼠與野生型小鼠在下頜骨密度與有效頜骨長度方面有明顯差別，但本研究發現構建的Myo1h突變小鼠的有效身長出現減少，提示Myo1h基因可能在軀干骨的生長發育中發揮著重要作用，同時觀察到Myo1h基因主要在髁突軟骨表層及肥大細胞層表達，推測該基因可能與髁突軟骨發育相關，具體的作用機制還有待進一步研究，本研究填補了Myo1h基因位于尾域結構的第30號外顯子在頜骨發育中的研究空白，并期進一步完善Myo1h基因在哺乳動物顱頜面骨骼生長發育中的作用，為后續對Myo1h基因的相關研究提供了穩定且可靠的小鼠動物模型。