骨髓間充質干細胞對大鼠BRONJ治療的研究

龔 雪，錢文昊，蘇儉生

雙膦酸鹽(bisphosphonates, BPs)為無機焦磷酸鹽類似物，能夠特異性地與骨基質中的羥磷灰石結合，抑制破骨細胞活性，發揮抑制骨吸收作用，是治療骨質疏松癥、佩吉特骨病以及惡性腫瘤引起的骨轉移和高鈣血癥等疾病的一線藥物。它可通過延緩骨破壞提高骨密度，增強骨骼強度以及降低骨折風險，極大地改善患者的生活質量。然而，近年來臨床研究發現，長期應用雙膦酸鹽類藥物可引起頜骨壞死(bisphosphonate-related osteonecrosis of the jaw, BRONJ)，相關病例報道逐漸增多[1-4], 給雙膦酸鹽的臨床安全應用提出了極大的挑戰。

流行病學資料顯示，BRONJ的發生在不同治療人群中存在較大差異。靜脈用藥患者BRONJ的累積發病率為0.8%～12.0%，口服用藥患者BRONJ發病率較低，為0.01%～0.04%，但當加入牙槽創傷這一危險因素后，發病率呈數量級的上升[5-7]。有回顧性文獻統計發現，60%～70%的BRONJ患者具有拔牙等創傷史，拔牙被認為是BRONJ發生最重要的危險因素[8-9]，而伴有口腔炎性疾病在一定程度上又增加了罹患BRONJ的風險[10-12]。BRONJ多發生于拔牙等口腔侵入性治療后，臨床表現為拔牙創經久不愈，黏膜大面積潰爛，頜面部劇烈疼痛，骨面長時間暴露壞死，這些癥狀嚴重影響患者的生活質量，但BRONJ的致病機制迄今不明，亦無確切有效的治療方法。

目前，BRONJ的治療多主張以保守治療為主，包括使用抗生素、外用灌洗劑、鎮痛藥等，但通常療效不佳[5,13]。手術治療應用于保守治療無效以及病情嚴重、頜骨壞死面積較大的患者，但爭議較大[14-15]。雙膦酸鹽引起的骨組織改變是全身性的，很難確定清創的可行性骨邊緣，有時無法完全去除壞死骨組織，而施行手術可能導致毗鄰骨更多的暴露，增加壞死風險，使病情進一步惡化[16]。高壓氧治療用于輔助治療BRONJ，可增加組織的氧儲量，促進創面愈合，但此種治療方法效果通常不明顯[17-18]。除此之外，還有伴富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)治療、激光治療、臭氧治療等[19-20]，治療策略相似，但療效需進一步研究。因此，探尋一種有效的BRONJ治療方法，顯得非常緊迫和必要。

骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)具有多向分化和組織修復潛能，是骨組織工程最為常用的種子細胞。目前關于BRONJ的干細胞治療策略多以預防為主[21-22]，少量的BRONJ治療研究也多采用系統性方式來移植BMSCs，全身免疫因素影響較大[23]，采用局部方式移植BMSCs較少，且多加入一些有機或無機骨誘導物質[24-25]，不能特異性說明BMSCs對BRONJ的治療作用。

在前期工作中，我們成功構建了BRONJ大鼠模型，模擬了人類發生BRONJ的基本臨床癥狀，包括軟組織缺損、炎癥反應、暴露壞死骨形成以及不同程度的骨質硬化等[26]。本實驗將外周骨BMSCs與Bio-Oss骨粉在體外復合培養構建細胞支架復合體，然后植入到BRONJ大鼠局部清創后的骨缺損處，評估外周骨BMSCs對BRONJ大鼠的治療效果，為探索BRONJ治療方法提供一個新的方向。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

新生和8～10周齡雌性SD大鼠，SPF級，由上海市斯萊克實驗動物中心提供。該項目所涉及的動物實驗已獲得相關倫理委員會的批準，倫理許可證編號：滬徐牙防科倫審[2019]5號。

1.2 主要試劑和儀器

唑來膦酸、β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸、地塞米松(Sigma，美國)；DMEM培養基、青/鏈霉素、0.25%胰蛋白酶、PBS(Hyclone，美國)；胎牛血清(Gibco，美國)；Bio-Oss骨粉(Geistlich，瑞士)；多聚甲醛、利多卡因、EDTA、二甲苯、乙醇、石蠟(上海國藥，中國)；蘇木精-伊紅染色試劑盒(南京建成，中國)；大鼠RANKL ELISA試劑盒、大鼠OPG ELISA試劑盒(武漢中美，中國)；BCA蛋白檢測試劑盒(康為生物，中國)；CO2培養箱(Thermo Fisher，美國)；倒置相差顯微鏡(Nikon，日本)；移液器(Eppendorf，德國)；微電子計算機斷層掃描、石蠟包埋機、石蠟切片機、石蠟展片機、石蠟烘片機(Leica，德國)；離心機(Thermo，美國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 外周骨BMSCs的分離和培養[26]將新生SD大鼠斷頸處死后，置入75%乙醇中浸泡5 min。無菌條件下分離髂骨以及脛骨，剔除附著的肌肉等軟組織，反復PBS沖洗。然后用低糖DMEM完全培養液常規反復沖洗骨髓腔，收集細胞懸液于培養皿。BMSCs細胞置于5%CO2、37 ℃條件下培養48 h后首次半量換液，之后每3 d更換新鮮培養液。

1.3.2 細胞支架復合體的體外構建 取適量Bio-Oss骨粉置入96孔板中，均勻鋪開，厚度約2 mm，并用DMEM完全培養液預濕支架材料。將第3代大鼠外周骨BMSCs常規消化后以1×106個/mL的密度接種于支架鋪底的孔板中，使細胞液被材料飽和吸入，再置于培養箱中孵育4 h，待細胞大量貼壁后，輕輕加入足量培養液至完全浸沒支架材料，置于培養箱中繼續培養以備用。

1.3.3 動物模型構建和手術 SD大鼠48只，每周給予尾靜脈注射唑來膦酸(80 μg/kg)，用藥2周后，在全身麻醉加局部浸潤麻醉下，牙齦分離器分離牙齦，微創拔除兩側上頜第一磨牙(圖1A)。之后繼續用藥至術后12周，構建大鼠BRONJ模型[26]。將BRONJ大鼠隨機分為4組，對照組不做處理，其余3組在全麻下對BRONJ大鼠局部去骨清創(圖1B)，設立清創組,其他2組(細胞支架組、支架組)分別移植入細胞支架、單純支架(圖1C)，最后縫合創口。移植術后4周和8周，大鼠分批處死后，分離并收集頜骨組織。

A：藍色圓圈所示上頜第一磨牙拔牙窩，右上角圖所示拔除的上頜第一磨牙；B：藍色圓圈所示清創后的骨缺損創口；C：藍色圓圈所示細胞支架復合體植入

1.3.4 Micro-CT(micro computed tomography，Micro-CT)檢測 收集的骨組織樣本進行Micro-CT檢測，分析各組骨缺損區新骨形成情況。將樣本置于標本檢測槽上并牢固固定，注意保持牙體長軸與掃描切面垂直，掃描參數設置為電壓45 kV，電流550 μA，分辨率10 μm，并利用Dateviewer Pro和CTvol Software軟件分析處理數據。

1.3.5 組織學分析 收集的骨組織樣本用4%多聚甲醛固定完全后沖水過夜，然后在室溫下用10% EDTA脫鈣，每3 d更換1次脫鈣液，至樣本變軟后沖水過夜，之后用脫水機梯度脫水、二甲苯透明、浸蠟，然后包埋機包埋。最后，用切片機以5 μm的厚度切片、展片、烘片，進行HE染色。

1.3.6 骨組織NF-κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB，RANKL)和骨保護素(osteoprotegerin，OPG)檢測 頜骨樣本離體后即刻置入液氮進行低溫冷凍，然后用無菌研缽對冷凍的骨組織進行充分研磨。之后用T-PER裂解液進行組織裂解，離心后得到組織裂解液。然后采用ELISA對骨組織樣本中的RANKL、OPG蛋白含量進行定量檢測，并以測得的總蛋白實際濃度來對其含量進行標準化處理。

1.4 統計學方法

以上各個實驗定量數據使用SPSS 16.0軟件包進行統計分析，并以平均值±標準差形式呈現。采用單因素方差分析檢驗組間差異，P<0.05表示具有統計學意義，P<0.01表示具有顯著統計學意義。

2 結 果

2.1 Micro-CT掃描分析

Micro-CT三維重建后各組樣本的矢狀切面圖如圖2。術后4周，細胞支架組缺損區的成骨修復效果最佳，新骨生成較多，已無明顯的缺損邊界，但清創區新骨形成表面高低不平。支架組缺損區的成骨修復效果居其次，新骨生成較少，中央可見較大凹陷。對照組缺損區的新骨形成表面高低不平，中央有淺碟狀凹陷，可見游離的死骨片。清創組成骨修復效果最差，新骨生成最少，凹坑狀骨缺損最深，表面骨質高低不平。術后8周，細胞支架組新骨形成區域與周邊骨質均勻連接，新骨表面光滑平整，骨改建已基本完成，成骨修復效果最佳。支架組成骨情況較4周時有明顯增加，新骨形成表面變得相對平滑，缺損區已無明顯的缺損邊界，局部骨表面有一些小的凹陷。對照組與4周時基本相似，缺損區表面仍高低不平，中央淺凹處可見大量的游離死骨片，骨壞死呈現加劇趨勢。清創組的成骨情況較4周時無明顯增加，表面仍高低不平，凹坑狀骨缺損范圍呈擴大趨勢。

圖2 移植術后大鼠頜骨Micro-CT矢狀切面圖

各組樣本術區骨礦化密度分析結果如圖3。隨時間延長，細胞支架組和支架組8周時的骨礦化密度均較4周時明顯增加。細胞支架組在所有組別中骨礦化修復速度最快，術后8周骨密度最高(P<0.05)，支架組骨礦化密度居其次，8周時較對照組明顯增加(P<0.05)。對照組和清創組4周和8周骨密度變化不大，其中清創組骨密度最低(P<0.05)，新骨形成最少。

*：與各自對照組相比較，差異有統計學意義

2.2 組織學結果

HE染色結果如圖4～5。術后4周，細胞支架組和支架組均有明顯成骨現象。細胞支架組創口黏膜已基本愈合，在高倍鏡下，可見大量纖維組織充盈細胞支架復合體內部，支架降解吸收明顯，有的區域已無明顯支架，殘存的支架周圍新生類骨質樣物質形成較多，結締組織中還可見少量多核巨細胞分布。支架組創口亦已基本愈合，上皮組織完全覆蓋創面，在高倍鏡下，可見支架材料部分降解吸收，支架周圍纖維組織包繞，有部分新生類骨質樣物質形成，降解的支架周圍纖維組織中亦可見少量多核巨細胞。對照組頜骨拔牙創仍未愈合，創區黏膜潰爛，骨面暴露，死骨形成，在高倍鏡下，病變骨質骨細胞細胞核固縮或消失，出現許多空的骨陷窩，而骨小梁排列緊密、增生明顯，骨質出現不同程度的硬化，且周圍伴有明顯的炎性細胞浸潤，為典型的BRONJ組織病理表現。清創組上皮未愈合，凹坑狀骨缺損最明顯，創區骨面大量暴露，死骨形成，在高倍鏡下，可見明顯的病變壞死骨質，無明顯新骨形成。

骨組織(B)、壞死骨(NB)、炎性細胞浸潤(IF)、結締組織(CT)、上皮(E);黑色箭頭所示移植術后未降解支架；標尺：200 μm

術后8周，細胞支架組和支架組上皮組織正常愈合覆蓋創面，黏膜下骨組織已無明顯的缺損邊界，骨組織完整連續，上皮、上皮下結締組織和骨組織之間界限分明。在高倍鏡下，這兩組創區已無明顯的支架材料，骨改建已基本完成，亦未見骨細胞細胞核缺失的壞死骨質。其中，細胞支架組成熟的板層骨連接成片，骨小梁形態規則、排列緊密，密度較支架組高，而支架組改建后的骨組織中可見較多長裂隙，骨小梁結構稍紊亂無序。對照組部分樣本上皮組織雖覆蓋創面，但在高倍鏡下，骨壞死卻呈現加劇趨勢，空骨陷窩明顯增多，死骨面積明顯增大，壞死骨周圍炎癥浸潤亦更為嚴重。清創組上皮未能完全愈合，但軟組織缺損較4周時有所減少，新骨形成則較4周時基本無增加，凹坑狀骨缺損仍很明顯，可見游離的死骨片。

骨組織(B)、壞死骨(NB)、炎性細胞浸潤(IF)、結締組織(CT)、上皮(E);黑色箭頭所示移植術后未降解支架；藍色箭頭所示骨組織無序的新骨結構，可見長裂隙；標尺：50 μm

2.3 細胞因子檢測

RANKL和OPG表達結果如圖6。術后4周，細胞支架組、支架組和清創組RANKL表達均較對照組下降(P<0.05)。術后8周，清創組RANKL表達較對照組上升(P<0.05)，而細胞支架組、支架組RANKL表達則較對照組下降(P<0.05)。術后4周，細胞支架組OPG表達最高(P<0.05)，支架組和清創組則較對照組下降(P<0.05)。術后8周，支架組和清創組OPG表達較對照組下降(P<0.05)。

A：RANKL的表達；B：OPG的表達；C：RANKL/OPG比值；*：與各自對照組相比較，差異有統計學意義

術后4周和8周，細胞支架組、支架組和清創組RANKL/OPG比值依次增高，細胞支架組和支架組較對照組下降(P<0.05)，清創組較對照組明顯上升(P<0.05)。

3 討 論

BMSCs具有多向分化和組織修復潛能，是目前骨組織工程研究最多且最為常用的種子細胞，BMSCs相關的骨組織工程技術，為BRONJ治療提供了新方向。目前關于BRONJ的干細胞治療的研究，多采用系統性方式來移植外周骨BMSCs，全身免疫因素影響較大[23]，采用局部方式移植較少，且多加入血纖蛋白、富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)、β-磷酸三鈣(β-tricalcium phosphate, β-TCP)、脫鈣骨基質(demineralized bone matrix, DBM)等一些有機或無機骨誘導物質[24-25]，不能特異性說明BMSCs對BRONJ的治療作用。因此，在本實驗中，我們在對BRONJ模型大鼠局部清創后，將細胞支架復合體植入局部骨缺損處，還同時設立支架組和清創組來排除全身因素和骨誘導物質的影響。

Micro-CT和組織學分析是目前骨組織工程體內動物實驗最為常用的檢測方法。Micro-CT掃描是一種非侵入、超高分辨的3D顯微成像技術，可以在不破壞組織樣本的情況下清楚分辨其內部顯微結構，其分辨率可達到微米級別。本實驗Micro-CT和組織學結果顯示，細胞支架組的成骨修復效果最佳，促進了BRONJ大鼠清創后的黏膜愈合和骨缺損修復，對BRONJ大鼠具有較好的治療效果。支架組修復效果居其次，具有一定的成骨修復效果，說明Bio-Oss材料本身具有一定的成骨誘導作用。清創組成骨修復效果最差，新骨生成少，凹坑狀骨缺損明顯，且缺損范圍呈現擴大趨勢。說明對BRONJ大鼠進行局部清創手術，不僅沒能起到封閉創口、促進愈合的作用，反而引起骨缺損范圍擴大，致病情進一步惡化。這與一些學者的研究結果相一致[16]。因此，實施外科清創手術以及骨移植修復重建操作應相當謹慎，診斷性手術或擴大性治療手術亦應盡量避免。

組織學結果顯示，支架組新生骨組織中可見較多裂隙，骨小梁結構紊亂，而細胞支架組板層骨改建正常，新生骨組織連接成片，骨小梁結構規則，排列緊密。骨組織中的唑來膦酸可抑制骨痂組織向板層骨改建過程中成骨細胞的終末分化[27]，使得新生的骨組織結構紊亂，板層骨中存有較多裂隙。有文獻報道[28]，頜骨中出現的微裂隙與BRONJ發生有著重要關系，提示我們，支架組中的骨裂隙可能增加BRONJ復發的風險。由此可見，細胞支架組的成骨修復效果較支架組更佳，不僅促進了BRONJ大鼠清創后骨缺損修復，且改建后的骨組織結構規則，與正常骨組織無明顯差異。

RANKL/RANK/OPG信號通路在調節骨吸收與骨生成動態平衡，保證正常的骨改建中起著重要作用。正常的骨重建和骨量的穩定依賴于RANKL和OPG平衡。RANKL/OPG比例上升時，破骨細胞的數量和活性將增加，骨吸收增強；RANKL/OPG比例下降時，破骨細胞的數量和活性將降低，骨吸收抑制。術后4周和8周，細胞支架組、支架組和清創組RANKL/OPG比值依次增高，細胞支架組和支架組較對照組減少，清創組較對照組明顯增高。說明細胞支架組和支架組該信號通路都受到一定程度的下調，其中，細胞支架組較支架組更為明顯。當細胞支架復合體植入BRONJ大鼠清創后骨缺損處后，頜骨中局部微環境得到一定程度改善，RANKL/OPG比值的下調，可能抑制破骨細胞的分化和功能，進而抑制骨吸收。而支架組RANKL/OPG比值的下調較細胞支架組幅度小，骨吸收減少沒有細胞支架組明顯，因而對骨缺損修復效果沒有細胞支架效果好。清創組RANKL/OPG比值顯著上調，破骨細胞數量和活性的顯著增加促使骨吸收加劇，造成骨質嚴重破壞。這與本實驗中Micro-CT和組織學結果一致，骨缺損創口不僅未能愈合，且骨缺損范圍呈現擴大趨勢。

4 結 論

外周骨來源BMSCs對BRONJ具有一定的治療效果，促進BRONJ大鼠清創后的骨缺損修復。RANKL/RANK/OPG信號通路可能在BRONJ病程發展中起重要作用。