化妝品中三種致敏香料GC-MS 檢測方法的研究與建立

李杰，吉偉佳，楊婷婷，易路遙

江西省藥品檢驗檢測研究院，國家藥品監督管理局中成藥質量評價重點實驗室，江西省藥品與醫療器械質量工程技術研究中心，江西 南昌 330029

市場上化妝品產品推陳出新，琳瑯滿目，每種化妝品所含的化學組分更是種類繁多［1］，其中香料是化妝品使用較多較廣的一類添加劑，然而隨著近年來化妝品的廣泛使用，化妝品的不良反應報道也隨之增加［2］，據不完全統計，因為使用化妝品的原因而產生的各種不良反應至少有35%是因為香料導致的［3］。

隨著大量試驗數據和過敏案例的積累，香料中的新鈴蘭醛、苔黑醛及氯化苔黑醛［4-6］這三種物質逐漸被列入各個國家和地區的化妝品禁用物質目錄，歐盟委員會在2017 年8 月2 日發布了（EU）2017/1410 號法規［7］，以及我國國家藥品監督管理局在2021 年5 月28 日發布公告（2021 年第74號）［8］，均將新鈴蘭醛、苔黑醛、氯化苔黑醛列為化妝品禁用物質。

目前國內僅剛剛出臺了新鈴蘭醛的檢驗標準，現有國內文獻［9-13］中有用氣質聯用法檢測塑料玩具中致敏性芳香劑、氣質聯用法檢測化妝品中苔黑醛及氯化苔黑醛，HPLC-MS 法測定香料類過敏原物質殘留量等可供參考，但同時檢測這三種香料的方法暫無；國外檢測標準有［14-16］歐盟CEN/TC 347 EN 16274:2012 消費品中香料過敏原的氣質聯用檢測方法，包括新鈴蘭醛Ⅰ（CAS 31906-04-4），但未包括新鈴蘭醛Ⅱ（CAS 51414-25-6）以及苔黑醛及氯化苔黑醛。

本研究改進了相關標準和文獻方法的樣品提取，采用新型通過式SPE 柱作為凈化手段，對方法提取溶劑，凈化過程等進行改進優化，并對方法的基質效應，回收率，線性關系，檢出限，定量限等方法學指標進行評價，結合通用廣且能確證的氣相色譜-串聯質譜法（GC-MS）技術［13］，建立適用于化妝品基質檢測三種致敏香料新鈴蘭醛、苔黑醛及氯化苔黑醛含量的定性定量方法。

1 試驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 7890A/5975 氣相色譜質譜聯用儀（Agilent 公司，美國），XS205DU 電子天平（METTLER TOLEDO，瑞士），ML204 電子天平（METTLER TOLEDO，瑞士）；DB-17MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm，Agilent 公司，美國）；離心機（Thermo Fisher公司，美國）；渦旋混合器（IKA 公司，德國）。

新鈴蘭醛對照品（批號：111528，新鈴蘭醛Ⅰ∶新鈴蘭醛Ⅱ=72∶28），來源：德國Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司；苔黑醛對照品（批號：D494613），來源：上海洽姆儀器科技有限公司；氯化苔黑醛對照品（批號：BCBW0256），來源：Sigma 公司；甲醇（色譜純），來源：Sigma；無水Na2SO4（分析純），來源：國藥集團；SHIMSEN Qvet-HP（2 g/6 mL），來源：日本島津。

8 批嬰幼兒護膚類化妝品（護膚霜4 批、潤膚乳4 批），8 批面膜類化妝品（保濕面膜、美白面膜等），爽膚水2 批（控油爽膚水等），均為市售所得。

1.2 方法

1.2.1 標準儲備溶液的制備精密稱取新鈴蘭醛標準物質0.1 g（精確至0.1 mg，均為新鈴蘭醛同分異構體的混合對照品，按照歸一化法新鈴蘭醛Ⅰ∶新鈴蘭醛Ⅱ=72∶28 換算各自的濃度，樣品中測得新鈴蘭醛總量以新鈴蘭醛Ⅰ和新鈴蘭醛Ⅱ之和計），苔黑醛標準品0.1 g（精確至0.1 mg），氯化苔黑醛標準品0.1 g（精確至0.1 mg）至10 mL 棕色容量瓶中，甲醇定容，得到濃度為新鈴蘭醛Ⅰ7.2 mg/mL 和新鈴蘭醛Ⅱ2.8 mg/mL、苔黑醛7.66 mg/mL、氯化苔黑醛10 mg/mL 的標準儲備溶液，置于4 ℃避光保存。臨用時分別取上述標準儲備溶液適量，用甲醇稀釋成標準曲線溶液。

1.2.2 樣品前處理精密稱取1.0 g 試樣置于10 mL容量瓶中，加入約5 mL 甲醇溶液，于超聲波清洗儀上超聲20 min，再用甲醇定容至10 mL，混勻，轉移至離心管中以8 000 r/min 高速離心10 min，取適量上清液通過2 g 無水Na2SO4脫水，取脫水后的溶液2 mL 置通過式SPE 小柱，直接收集流出液，經0.22 μm 濾膜過濾,濾液作為待測溶液。

陰性樣品基質溶液：取陰性樣品按上述方法制備。

1.2.3 色譜-質譜條件色譜柱DB-17MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm），色譜條件：初始溫度為100 ℃，保持1 min 后以10 ℃/min 速率升至200 ℃；然后以5℃/min 速率升至260 ℃；再以10 ℃/min 速率升至280 ℃，保持5 min。載氣：高純氦氣，流速為1.0 mL/min；進樣口溫度為280 ℃；進樣模式為分流進樣，分流比5∶1。質譜條件均為：離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃，傳輸線溫度280 ℃ ；離子化方式為EI；電離能量為70 eV。

新鈴蘭醛Ⅰ定量離子136，定性離子192、105；新鈴蘭醛Ⅱ定量離105，定性離子118、163；苔黑醛定量離子151，定性離子106、152；氯化苔黑醛定量離子 185，定性離子186。

2 結果

2.1 方法學驗證

2.1.1 基質工作標準曲線精密量取適量“1.2.1”中各標準物質儲備溶液，用甲醇稀釋至適當濃度的標準物質中間使用溶液，再用按照“1.2.2”的制備方法得到的陰性樣品基質溶液配制對應的基質工作標準曲線，標準物質新鈴蘭醛Ⅰ的濃度范圍為0.36 μg/mL～10.80 μg/mL，新鈴蘭醛Ⅱ為0.14 μg/mL～4.20 μg/mL，苔黑醛為0.19 μg/mL～5.75 μg/mL，氯化苔黑醛為0.50 μg/mL～15.00 μg/mL。以目標化合物的定量離子色譜峰峰面積為縱坐標，對應的標準物質濃度為橫坐標作圖，繪制標準曲線。三種物質在其標準曲線范圍內，峰面積與濃度值呈現的線性關系良好，相關系數均大于0.990 0，線性范圍和相關系數見表1。

表1 基質標準曲線的回歸方程、線性范圍和相關系數

2.1.2 精密度取標準曲線溶液中新鈴蘭醛Ⅰ0.36 μg/mL、新鈴蘭醛Ⅱ0.14 μg/mL、苔黑醛0.19 μg/mL、氯化苔黑醛0.50 μg/mL 溶液與新鈴蘭醛Ⅰ10.80 μg/mL、新鈴蘭醛Ⅱ4.20 μg/mL、苔黑醛5.75 μg/mL、氯化苔黑醛15.00 μg/mL 溶液，各連續進樣6 次，計算峰面積的RSD 作為低、高濃度標準溶液的日內精密度。計算結果RSD 均小于10%，滿足實驗要求。

2.1.3 回收率及重復性試驗實驗選取了霜、乳液、粉劑和液體劑4 種典型的化妝品樣品作為基質本底，分別添加了1 倍定量限（低）、2 倍定量限（中）、10 倍定量限（高）3 個添加濃度，按前述“1.2.2”處理，分別平行制備5 份，經測定并計算結果可知，方法對于不同化妝品基質，霜劑的回收率在72.5%～99.5%之間，乳劑的回收率在72.3%～98.7%之間，粉劑的回收率在70.5%～125.4%之間，液體劑的回收率在85.6%～111.7%之間，RSD 均小于10%。

2.1.4 方法的檢出濃度和最低定量濃度向霜劑、乳液、粉劑和液體的空白基質中定量添加三種待測組分，按“1.2.2”處理后，測定信噪比為3∶1 時，添加的化合物的量為方法檢出濃度；測定信噪比為10∶1 時，添加的化合物的量為方法最低定量濃度。經測定，檢出濃度為新鈴蘭醛Ⅰ1.1 mg/kg、新鈴蘭醛Ⅱ 0.4 mg/kg、苔黑醛0.6 mg/kg、氯化苔黑醛1.5 mg/kg；最低定量濃度為新鈴蘭醛Ⅰ3.6 mg/kg、新鈴蘭醛Ⅱ1.4 mg/kg、苔黑醛1.9 mg/kg、氯化苔黑醛5.0 mg/kg。

2.2 樣品測定

采用上述方法對8 批嬰幼兒護膚類化妝品，8批面膜類化妝品、爽膚水2 批開展了分析。樣品按“1.2.2”處理并測定，結果顯示，其中1 批嬰幼兒護膚霜類化妝品檢出新鈴蘭醛34.3 mg/kg。兒童嬰幼兒護膚類化妝品中存在添加致敏香料情況，需引起重視，嬰幼兒一直都是高風險人群［17］，是安全問題的易發區，鑒于我國剛剛于今年5 月更新《化妝品禁用原料目錄》［8］，嬰幼兒護膚類化妝品的香料添加使用情況需要重點關注。

3 討論

3.1 色譜質譜條件的選擇和優化

在色譜條件優化過程中，我們針對氣相毛細管色譜柱的極性強弱進行了對比，選擇了不同液膜厚度的HP-5MS 毛細管柱（0.25 μm、1.0 μm），DB-17MS 毛細管柱，DB-WAX 毛細管柱及HP-FFAP毛細管柱對三種標準品溶液進行分析，其中HP-5MS 和DB-17MS 對三個目標化合物分離最為合適，且出峰峰形較好，HP-5MS 液膜厚1.0 μm 比0.25 μm 的分離度更好，而針對三種致敏香料的分離時長來看，HP-5MS 毛細管柱對其分離耗時較DB-17MS 毛細管柱更長，故最終將DB-17MS 作為分離色譜柱。

在升溫條件優化過程中，我們比較了多個文獻［14-21］的方法：若選擇起始溫度為60 ℃，會導致三個目標物分離度不好且出峰時間較長，因此，我們通過抬高色譜柱DB-17MS 的初始的溫度，優化升溫程序，使目標物在12 min 內即可出峰完全，且分離度良好，最后快速抬高溫度至280 ℃進行雜質掃尾，三個目標物的總離子流圖詳見圖1。

圖1 GC/MS儀器條件下3種香料的總離子流圖

質譜條件的優化通過GC-MS 在SCAN 模式下對新鈴蘭醛、苔黑醛及氯化苔黑醛標準儲備溶液進行掃描，確定了各自的定性定量離子。

3.2 樣品提取溶劑的選擇

化妝品前處理提取溶劑常用的有甲醇和乙腈，綜合考慮適用范圍和氣相色譜分離手段，甲醇極性大，基質的適用性更好一些，且乙腈在氣相色譜分析中一般較少使用，加之甲醇毒性稍弱一點，因此最后選擇了甲醇作為提取溶劑，同時增加無水硫酸鈉脫水處理步驟，最后為保護氣相毛細管色譜柱避免甲醇的溶解損傷，設置了分流比進樣［17］。

3.3 凈化方案的優化

3.3.1 SPE 柱的選擇為了快速且有效地凈化樣品提取液，結合文獻［17］采用通過式SPE 小柱來進行凈化，為了選擇合適的固相萃取柱建立專屬性好的前處理凈化方案，我們選擇了不同品牌不同填料的SPE 柱，PRiME HLB（200 mg/6 mL）、PRiME MCX（200 mg/6 mL）、SHIMSEN Qvet-NM（2 g/6 mL）及SHIMSEN Qvet-HP（2 g/6 mL）。分別進行4 種設計分析：標準物質溶液直接過柱、樣品基質溶液直接過柱、樣品基質溶液過柱后添加標準物質、樣品基質溶液添加標準物質后再過柱。實驗選用霜劑、乳劑、粉劑和液體4 類化妝品作為考察基質，標準物質過柱前和過柱后的添加量均使得最后標準物質上機溶液濃度為5 μg/mL。結果顯示，標準物質溶液直接過柱實驗中，三個目標物SHIMSEN Qvet-HP平均回收率為95.1%、SHIMSEN Qvet-NM 平均回收率為81.7%、PRiME MCX 平均回收率為43.5%、PRiME HLB 平均回收率為43.5%。樣品基質溶液直接過柱實驗中，SHIMSEN Qvet-NM 和SHIMSEN Qvet-HP 去除干擾效果較好，PRiME HLB、PRiME MCX 次之，液體基質的3 款柱子雜峰去除干擾效果SHIMSEN Qvet-HP 要優于SHIMSEN Qvet-NM，PRiME HLB、PRiME MCX 效果次之。樣品基質溶液過柱后添加標準物質和樣品基質溶液添加標準物質后再過柱的實驗中，通過樣品基質溶液添加標準物質再過柱測得的目標物峰面積與樣品基質溶液過柱后添加標準物質測得的目標物峰面積之比計算回收率，通過計算，SHIMSEN Qvet-HP 回收率為85.0%～95.0%、SHIMSEN Qvet-NM 回收率為78.0%～86.0%、PRiME HLB 回收率為80.0%～90.0%，PRiME MCX 回收率為40.5%～46.0%。

綜上，可選擇SHIMSEN Qvet-HP（2 g/6 mL）作為凈化柱。同時進一步結合基質效應實驗結果綜合選擇最優的凈化柱。

3.3.2 基質效應實驗基質效應（ME）的計算［17］等于“3.3.1”方案設計中樣品基質添加標準物質過柱后測得目標物的峰面積與對應濃度的標準物質溶液的峰面積的百分比再減去100%，若計算結果為負，則為基質效應抑制，若計算結果為正，則為基質效應增強。實驗結果顯示，PRiMEMCX對霜劑和乳劑的基質效應有較強抑制（-68.1%～-45.0%），SHIMSEN Qvet-HP 有略微基質效應增強（21.0%～9.0%），PRiME MCX 對粉劑和液體的基質效應為一般抑制，PRiME HLB 和SHIMSEN Qvet-HP 為略微增強。

綜上，最終選擇SHIMSEN Qvet-HP（2 g/6 mL）作為凈化柱。

4 結論

香料是化妝品中常見的配料之一，香料過敏會引起包括過敏性接觸性皮炎，刺激性接觸性皮炎等各種過敏反應，導致皮膚紅腫、脫屑和角質化等，長期還會引起皮膚皸裂、苔蘚化和角質化過度等嚴重癥狀。部分商家為吸引消費者而添加的各種香料會帶來潛在的過敏風險，因此有必要針對化妝品中常見致敏香料物質進行風險評估。

本研究建立了化妝品中三種致敏香料新鈴蘭醛、苔黑醛和氯化苔黑醛的GC-MS 測定方法。對色譜、質譜條件及樣品提取凈化方案進行了改進優化，完成了基質效應及方法學驗證等評價，該分析方法前處理簡單，高效準確，選擇性好，可用于化妝品中三種致敏香料含量的測定分析。