Na+、K+、Ca2+、Mg2+、葡萄糖和甘油濃度對擬赤梢魚精子活力的影響

王雨，楊建，耿龍武，張宇婷，徐偉，叢艷鋒，杜汝君

（1.中國水產科學研究院黑龍江水產研究所，黑龍江 哈爾濱 150070；2.黑龍江省冷水性魚類種質資源及增養殖重點開放實驗室，黑龍江 哈爾濱 150070；3.上海海洋大學水產科學國家級實驗教學示范中心，上海 201306；4.杜爾伯特蒙古族自治縣水產總站，黑龍江 大慶 166200）

擬赤梢魚（Pseudaspius leptocephalus）隸屬鯉科（Cyprinidae）、雅羅魚亞科（Leuciscinae）、擬赤梢魚屬（Pseudapius）的唯一種[1]，在我國僅分布于黑龍江流域，是肉質細膩、味道鮮美的黑龍江流域名貴淡水經濟魚類[2]。近年來，環境污染、產卵場破環、過渡捕撈等導致擬赤梢魚資源明顯衰退，亟需保護。目前，關于擬赤梢魚的研究僅見核型分析[3]、肌肉營養成分[4]和人工繁育[5]等。

魚類精子活力與其受精能力密切相關，提高精子活力有利于提高人工繁殖的受精率[6]。精子活力主要通過精子激活率、精子運動激烈程度和運動時間等指標來反映，是檢測精子質量的重要指標[7]。研究表明，滲透壓、pH、溫度、離子等環境因子對魚類精子活力的影響顯著[8]，其中，滲透壓是影響大多數魚類精子運動能力的主要因素。Na+、K+、Ca2+、Mg2+是維持魚類精漿滲透壓的主要離子，不同種離子對同種魚類精子活力的影響及同種離子對不同種魚類精子活力的影響均存在差異[9]。如K+能抑制鮭鱒魚類精子的活動，而在鯉科魚類中能夠提高精子運動速度[10-12]。近年來，隨著魚類配子和胚胎冷凍保存研究的進一步深入，糖類物質、磷脂作為冷凍稀釋液中基礎溶液的重要組分，在形成滲透壓、提供外源營養中起著不可替代的作用[13]。葡萄糖可顯著延長凹目白鮭（Coregonus autumnalis）精子壽命[14]。本研究通過分析對比不同濃度無機離子Na+、K+、Ca2+、Mg2+和葡萄糖、甘油有機溶劑中擬赤梢魚精子活力變化規律，旨在闡明不同環境因子對擬赤梢魚精子活力的影響，并為擬赤梢魚精子生理學研究和人工繁殖提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗魚為隨機采取的6 尾5 齡成熟度好、健康無傷的擬赤梢雄魚，平均體長為（26.86±0.85）cm，體質量為（194.03±18.27）g，取自中國水產科學研究院黑龍江水產研究所呼蘭試驗站。用促黃體生成激素釋放激素類似物（LRH-A2）2.0 μg·kg-1和馬來酸地歐酮（DOM）0.5 mg·kg-1對雄魚樣本進行人工催產，胸腔注射1 次，28 h 后，用干燥潔凈的毛巾擦去魚體表面及生殖孔附近的水分，輕壓魚腹部流出精液，滴入干燥潔凈的2 mL 離心管中，立即置于4℃環境中保存備用。精液采集過程中應避免尿液、血液和糞便污染精液。

用去離子水和分析純氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂、葡萄糖和甘油分別配制不同濃度梯度的NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2、葡萄糖及甘油激活液，不同激活液濃度設計見表1，以去離子水作為對照組。

表1 不同梯度激活溶液設計Tab.1 The design of different gradient activation solutions

1.2 精子活力觀察與測定

移液槍吸取2 μL 新鮮精液于載玻片上，再吸取精子激活液20 μL 加至精液中，迅速用槍頭將其攪勻，無需加蓋蓋玻片，同時用秒表計時，于10×10倍顯微鏡（BX1 OlyMpus Microscope）下觀察。觀察過程以一個視野為準。精子活力觀察標準參照喬志剛等[15]、蘇德學等[16]劃分的等級標準：精子激活率（Activation rate）以激活起始時給定視野內被激活精子數量占全部精子數量的百分數計算；精子快速運動時間（Fast Movement period，FMP）以精子激活開始至70%的精子能看清運動軌跡的時間計算；精子運動時間（Moving duration，MD）以精子激活開始至90%的精子原地顫動為止的時間計算；精子壽命（Life span，LS）以精子激活開始至90%的精子停止運動為止的時間計算。精子活力觀察與測定由同一人用相同方法完成，不同實驗處理組各樣品測定3次，取平均值。

1.3 數據分析

結果以平均值±標準差（Mean±SD）表示，用SPSS22.0 統計軟件進行單因素方差分析（One-Way ANOVA），用Duncan 法進行多重比較，顯著性水平設為0.05。

2 結果與分析

2.1 Na+對精子活力的影響

在0.02～0.14 mol·L-1的Na+激活液中，擬赤梢魚精子激活率在0.02～0.06 mol·L-1時差異不顯著（P>0.05），在0.08 mol·L-1時雖顯著降低，但仍維持在80%以上。隨著Na+濃度的升高，擬赤梢魚精子的FMP、MD 和LS 均先增加后減少，其中0.14 mol·L-1濃度組擬赤梢魚精子的FMP、MD 和LS 小于對照組。而在0.08 mol·L-1濃度組激活液中，擬赤梢魚精子的FMP、MD 和LS 均大于其他組，FMP、MD 和LS分別為（26.87±0.69）s、（74.49±7.19）s 和（446.48±21.96）s（表2）。

表2 擬赤梢魚精子在不同濃度NaCl 溶液中的活力Tab.2 Motility of sperm of flathead asp Pseudaspius leptocephalus in different concentrations of NaCl solution

2.2 K+對精子活力的影響

在K+濃度為0.02～0.14 mol·L-1范圍內，隨K+濃度的升高擬赤梢魚精子的激活率降低，濃度為0.08 mol·L-1時，擬赤梢魚精子的激活率顯著降低（P<0.05）。在K+濃度為0.02～0.14 mol·L-1范圍內，精子FMP、MD 和LS 隨K+濃度的升高先增加后降低，濃度為0.10 mol·L-1組時，精子FMP、MD 和LS達到峰值，分別為（25.73±0.44）s、（55.53±4.38）s和（183.19±11.80）s。在K+為0.14 mol·L-1組中，擬赤梢魚精子的FMP、MD 和LS 顯著小于對照組（P<0.05）（表3）。

表3 不同濃度KCl 溶液中擬赤梢魚的精子活力Tab.3 Motility of sperm of flathead asp Pseudaspius leptocephalus in different concentrations of KCl solution

2.3 Ca2+對精子活力的影響

在Ca2+濃度為0.003～0.021 mol·L-1的范圍內，擬赤梢魚精子激活率、FMP、MD 和LS 均隨Ca2+濃度的增加而減少，精子聚集程度也不斷增加。實驗組精子激活率均顯著小于對照組（P<0.05），0.003 mol·L-1時精子激活率已降至（56.68±5.77）%；而精子的FMP、MD 和LS 僅在Ca2+為0.003 mol·L-1組的激活液中與對照組水平無顯著差異（P>0.05），分別為（15.97±0.56）s、（31.63±1.93）s、（48.12±1.74）s（表4）。

表4 不同濃度CaCl2 溶液中擬赤梢魚的精子活力Tab.4 Motility of sperm of flathead asp Pseudaspius leptocephalus in different concentrations of CaCl2 solution

2.4 Mg2+對精子活力的影響

隨著溶液中Mg2+濃度的升高，擬赤梢魚精子的激活率、FMP、MD 和LS 均隨著Mg2+濃度的升高而逐漸降低。其實驗組的精子激活率均顯著小于對照組（P<0.05），且在Mg2+為0.021 mol·L-1組激活率為0%，而精子的FMP、MD 和LS 在0.003～0.009 mol·L-1濃度范圍內均高于對照組。在0.002 mol·L-1組的激活液中，精子的激活率、FMP、MD 和LS 分別為（57.21±2.72）%、（17.65±0.68）s、（35.74±1.61）s和（66.31±5.19）s（表5）。

表5 不同濃度MgCl2 溶液中擬赤梢魚的精子活力Tab.5 Motility of sperm of flathead asp Pseudaspius leptocephalus in different concentrations of MgCl2 solution

2.5 葡萄糖對精子活力的影響

在葡萄糖濃度為0.22 mol·L-1組中，擬赤梢魚精子的激活率為（83.33±2.78）%，小于對照組擬赤梢魚精子的激活率；而葡萄糖濃度為0.30 mol·L-1組的激活液中，精子的激活率降為0%。在葡萄糖濃度為0.06～0.22 mol·L-1的范圍內，擬赤梢魚精子的FMP、MD 和LS 隨著葡萄糖濃度的升高而增加，在濃度為0.22 mol·L-1組中達最大值，分別為（25.51±1.84）s、（52.14±3.93）s、（76.74±4.05）s（表6）。

表6 不同濃度葡萄糖溶液中擬赤梢魚的精子活力Tab.6 Motility of sperm of flathead asp Pseudaspius leptocephalus in different concentrations of Glu solution

2.6 甘油對精子活力的影響

在不同濃度甘油激活液中，精子的激活率顯著小于對照組（P<0.05），在甘油濃度為0.30 mol·L-1組中，精子的激活率為0%。在甘油濃度為0.06～0.22 mol·L-1范圍內，擬赤梢魚精子的運動能力同在葡萄糖激活液中變化一致，均隨濃度的升高而增加，精子的FMP、MD 和LS 均在濃度為0.22 mol·L-1的激活液中達最大值，分別為（27.01±1.34）s、（48.16±7.41）s 和（90.54±2.75）s（表7）。

表7 不同濃度甘油溶液中擬赤梢魚的精子活力Tab.7 Sperm motility of flathead asp Pseudaspius leptocephalus in different concentrations of Gly solution

3 討論

3.1 無機離子對精子活力的影響

魚類精子釋放到外界環境時，其所處的環境滲透壓發生變化，立即被激活[17]。激活后的精子大部分能量用于滲透壓調節[18]。當精細胞內外滲透壓差逐漸減小時，用于自身滲透壓的能量消耗隨之減少，能量多用于維持精子的運動[6]。

Na+、K+是維持精漿滲透壓的主要離子，在影響精子活力方面發揮重要作用。Na+可以通過誘發細胞膜去極化產生動作電位，引起細胞內Ca2+濃度的變化，間接激活精子運動，也使運動強烈程度增大[19]。本研究中，在Na+、K+濃度為0.02～0.12 mol·L-1的范圍內擬赤梢魚精子的運動狀態均不同程度提高，而在0.14 mol·L-1時受到抑制，這說明一定濃度的Na+、K+對擬赤梢魚精子活力具有促進作用，當超過某一限制濃度時就會出現抑制。這一結果與對馬口魚（Opsariicjthys bidens）[20]、高白鮭（Coregouns peled）[21]和四川裂腹魚（Schizothorax kozlovi）[22]等魚類精子活力的研究結果一致。

本研究中，Na+、K+激活液濃度為0.02～0.12 mol·L-1時，其均對擬赤梢魚的精子活力具有促進作用，其中最適Na+濃度為0.08 mol·L-1。在該濃度下擬赤梢魚精子運動狀態最佳，尤其是精子壽命顯著延長。研究證實，大鱗鲃（Barbus capito）、稀有鯽（Gobiocypris rarus）等魚類的精子激活劑中Na+的最適濃度與本研究中擬赤梢魚的最適Na+濃度較為接近，分別為0.085 mol·L-1和0.09 mol·L-1[23,24]，而高體雅羅魚（Leuciscus idus）精子最適Na+濃度則為0.135 mol·L-1[25]，這表明不同種魚類精子激活液中Na+濃度不同。擬赤梢魚精子活力的三個運動指標均在濃度為0.10 mol·L-1的K+激活液中為最高，但此時其精子的激活率低于80%，不利于實際生產應用。本研究中，擬赤梢魚精子最適K+濃度為0.08 mol·L-1，低于同屬鯉科魚類大鱗鲃精子的最適K+濃度0.13 mol·L-1[23]，而中華鱘（Acipenser sinensis Gray）精子的最適K+濃度僅為0.005‰[26]。可見，不同種魚類精子的最適K+濃度差異較大。

本研究中，精液激活劑中Ca2+、Mg2+對擬赤梢魚精子活力的作用方式與Na+、K+不同。其中，高Ca2+、Mg2+濃度的激活液顯著抑制精子的激活率，而精子快速運動時間、運動時間及壽命也隨著Ca2+、Mg2+濃度的升高逐漸降低。翹嘴鲌（Erythroculter ilishaeformis）精子在Ca2+、Mg2+濃度為0.001～0.003 mol·L-1范圍內，其激活率高于對照組[27]，是否在更低濃度范圍內同樣存在擬赤梢魚精子最適濃度，尚需進一步的實驗來證明。與白斑狗魚（Esox lucius）[28]、薩羅羅非魚（Sarotherodon melanotheron Rüppell）[29]等研究結果一樣，本研究中Ca2+、Mg2+也可引起擬赤梢魚精子的聚集。蘇德學等[28]認為，精子聚集不是由于滲透壓作用，而是Ca2+本身影響精子的生理生化過程。羅明坤等[29]還推測Ca2+能損傷精子內部結構，引起精子聚集，導致活力下降。本研究顯示，Mg2+對擬赤梢魚精子運動狀態的抑制作用不及Ca2+，龔進玲等[30]的研究同樣報道了達氏鱘（Acipenser dabryanus Dumeril）精子對Ca2+、Mg2+敏感性不一。

3.2 葡萄糖、甘油對精子活力的影響

本研究發現，葡萄糖與甘油對擬赤梢魚精子活力的影響作用相似，在一定濃度范圍內，均可顯著延長精子的運動時間及壽命。目前關于葡萄糖、甘油顯著延長魚類精子運動時間及壽命的調控機制尚未明確。Gardiner[31]推測，體外受精魚類精子具有三羧酸循環代謝的能力，可以通過氧化作用利用細胞外源性碳水化合物，延長精子壽命。

不同魚類精子最適葡萄糖、甘油濃度差異較大。澳洲鱈鱸（Maccullochella peelii peelii）精子在0.27 mol·L-1的葡萄糖濃度下活力及存活時間顯著延長[32]，而厚唇裂腹魚（Schizothorax irregularis）最適葡萄糖濃度為0.17 mol·L-1、最適甘油濃度為0.13 mol·L-1[33]。在本研究中，在0.22 mol·L-1的葡萄糖、甘油激活液中擬赤梢魚精子運動狀態顯著延長，但在之后的0.30 mol·L-1激活液中精子活力驟降，是否在0.22～0.30 mol·L-1濃度范圍內存在更佳適宜的濃度，還需進一步驗證[34]。擬赤梢魚繁殖期短，其精液質量及精子活力在繁殖期后期顯著下降，本研究尚未做進一步驗證。

3.3 結論

綜上所述，激活劑中Na+、K+濃度范圍為0.02～0.12 mol·L-1時可提高擬赤梢魚精子活力，0.14 mol·L-1時則出現抑制作用。其中，擬赤梢魚精液激活劑中精子活力最適的Na+、K+濃度均為0.08 mol·L-1；與Na+、K+的激活作用不同，低濃度的Ca2+、Mg2+（0.003～0.021 mol·L-1）明顯抑制擬赤梢魚精子的激活，因此在生產中應避免使用高Ca2+、Mg2+含量的水體，以免抑制精子發揮作用。葡萄糖和甘油濃度為0.22 mol·L-1的激活劑中，擬赤梢魚精子運動時間及壽命顯著延長，為擬赤梢魚人工繁殖中提高精子活力以及精子冷凍保存液的配制提供了基礎數據。