硬骨魚類Keap1-Nrf2/ARE 信號通路研究進展

周俊豪，劉念，楊映

（佛山科學技術學院生命科學與工程學院，廣東 佛山 528231）

早在1985 年就提出了氧化應激，即氧化還原生物學和醫學中的一個概念[1]，它指機體遭受外界刺激時，細胞中呈現的氧化應激反應。在此過程中生物機體內的活性氧簇（Reactive Oxygen Species，ROS）是最為重要的指標之一。生物體內ROS 產生的量過高，自身抗氧化清除能力不足時，機體內脂質過氧化水平就會明顯升高[2]，損傷氨基酸、線粒體、蛋白質、核酸和染色體，誘導多種細胞凋亡[3，4]，使得氧化－抗氧化系統失衡，使機體氧化損傷[5]。

諸多外界環境因素都可能對硬骨魚類造成氧化應激并影響健康。例如，短期饑餓可導致翹嘴鱖Siniperca chuatsi 腸道氧化應激及細胞自噬[6]；長時間的運輸會破壞斑馬魚Brachydanio rerio var 抗氧化平衡[7]；高密度養殖會導致團頭魴Megalobrama amblycephala 腸道氧化應激損傷，影響其正常生長[8]。水環境中重金屬含量過多會引起大黃魚Larimichthys crocea 氧化應激和免疫反應[9]、水體鎘的暴露可導致黃顙魚Pelteobagrus fulvidraco 組織損傷、氧化應激[10]；一些過度用藥的畜禽代謝物排到水環境中也可能誘發成年斑馬魚的嚴重氧化應激和組織損傷[11]；飼料產品中常見的霉菌毒素可引起草魚Ctenopharyngodon idella 的氧化損傷、細胞凋亡[12]；飼料中澤瀉烯酮也可導致草魚幼魚氧化損傷、細胞凋亡[13]。

Keap1-Nrf2/ARE 是近年來研究發現的關鍵抗氧化應激通路，具有多個激活途徑來維持細胞的氧化還原平衡及代謝，可調節生物體1%～10%的基因[14]。該通路可通過調控機體的下游靶蛋白（Ⅱ相代謝酶、抗氧化蛋白/酶、蛋白酶體、抗炎因子及Ⅲ相代謝酶等），誘導谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-PX）、谷胱甘肽-S-轉移酶（Gultathione S transferases，GST）、血紅素加氧酶-1（Heme oxygenase 1，HO-1）、NADPH 醌氧化還原酶-1（NQO1）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）等保護性基因的表達，減輕機體氧化應激損傷。研究表明：魚體內存在轉錄因子NF_E2 相因關子2（NF-E2-related factor 2,Nrf2），且高度保守，在抗氧化應激反應中發揮重要作用。在正常生理狀態下，Keap1 和Nrf2 結合而發生泛素化和蛋白酶體降解，使細胞核內Nrf2 的含量維持在相對較低水平。在氧化應激條件下，Keap1 對Nrf2 的作用機制主要有兩種，一個是Keap1 中半胱氨酸殘基的修飾，另一個是Keap1 和Nrf2 之間蛋白質-蛋白質相互作用的中斷。泛素化和降解能力減弱，細核中Nrf2 積聚，Nrf2 與抗氧化反應元件ARE 結合后啟動下游一系列保護性基因的表達，使機體從氧化應激狀態恢復到正常的生理狀態。Keap1-Nrf2/ARE 信號通路對硬骨魚類的健康生長非常重要。

1 Keap1、Nrf2 和ARE 的分子基礎

1.1 Keap1 的分子結構

Itoh 等[15]最早研究發現，Keap1 存在于從低等無脊椎動物到靈長類動物等多種物種中。Keap1 相對分子質量為6 900，是一個與胞漿肌動蛋白結合的編碼624 個氨基酸的多肽，其包含5 個結構域[16]：N 端結構域（NTR）、干預區（IVR）、BTB 區、雙甘氨酸重復區（DGR）和C 端結構域（CTR）[17,18]。IVR 區富含半胱氨酸殘基，是Keap1 與氧化劑、親電子性物質等發生反應的區域[19]，因此IVR 區在一定程度上決定著Nrf2 的穩定[17]。Keap1 二聚體化與BTB 區有關。該域內某些Ser 位點的突變可影響Keap1 二聚化，干擾Keap1 與Nrf2 的結合[20]。該區的核心位點是Ser-104，其發生突變將影響Keap1 的二聚化[14]；DGR 區含有6 個雙甘氨酸重復序列是Keap1與Nrf2 的結合區。

與哺乳動物不同的是，在魚類中發現了兩種Keap1：Keap1a 和Keap1b。斑馬魚Keap1a 和Keap1b分別在288、273 位點有一個功能性半胱氨酸殘基[21,22]。魚類兩種類型的Keap1（Keap1a 與Keap1b）在Keap1-Nrf2/ARE 通路中都顯示了它們的功能[23]。這兩者結構與功能的差異有待進一步研究。Nguyen等[24]分別敲除了斑馬魚Keap1a 和Keap1b 這兩種基因，并用H2O2處理使兩組斑馬魚氧化損傷，然后再使用蘿卜硫素處理。結果發現，蘿卜硫素僅能提高敲除Keap1a 斑馬魚組的存活率，Keap1b 比Keap1a 更能感知蘿卜硫素。目前可以確定的是：兩種Keap1 都可與Nrf2 結合并抑制Nrf2 的活性[25]，然而應答能力卻有所區別[26]。膽堿能顯著降低肌肉中Keap1a 和Keap1b 兩者的mRNA 水平，提高Nrf2 水平[27]，膳食丁酸鈉能提高腸道中Nrf2 的mRNA 水平時，只能降低腸道中Keap1b（而非Keap1a）的mRNA 水平[28]；黃曲霉素則是通過上調Keap1a（而不是Keap1b）來抑制Nrf2 信號，降低Nrf2 信號的水平和相關抗氧化酶的活性[29]。

1.2 Nrf2 的分子結構

Nrf2 是一種含亮氨酸拉鏈（Basic leucine zipper，b Zip）結構的轉錄因子，相對分子質量為66 000，屬CNC（Cap-n-collar，CNC）調節蛋白家族。人類的Nrf2 基因有7 個功能結構域[30]，而在魚類目前已報道的Nrf2 基因功能結構域是前6 個，依次命名為Neh1 到Neh6[15,31]。Neh1 結構域包含1 個堿性亮氨酸拉鏈結構，與sMaf 蛋白（small MAF proteins）發生相互作用[32,33]，促進DNA 與其形成異二聚體后識別并結合ARE，啟動目標基因的轉錄。Neh1 結構域還參與調控Nrf2 的核轉位和降解[34]；Neh2 域是與Keap1 的Kelch 區相結合的結構域，其在調節Nrf2活性中非常關鍵[15]；Neh3 域既具活化轉錄的功能，也能夠影響蛋白質的穩定性[35]；Neh4 與Neh5 是兩個轉錄激活域，都具有大量的酸性氨基酸殘基。這兩個結構域都能與轉錄激活因子CBP（CREB-binding protein）結合，促進下游靶基因轉錄[36,37]；Neh6 域具有大量絲氨酸殘基，可在氧化應激時促進Nrf2 的降解，但具體機制有待進一步研究[38]。

1.3 ARE 基因序列

ARE 是一個特異的DNA－啟動子結合區域。不同ARE 的堿基序列不同[39]，但越來越多的研究表明，具有典型功能活性ARE 的長度為16 個核苷酸序列，其中5 個核苷酸是可變的，因此基因組中ARE 具有多樣性。

ARE 是重要的抗氧化反應元件。在正常狀態時，ARE 的轉錄抑制因子Bach1（CNC 類似物）與小分子蛋白Maf 結合形成二聚體，防止Nrf2 與ARE結合；機體受到氧化應激后，Nrf2 解離進入胞核，與Maf 或Jun 蛋白、Fos 蛋白形成異二聚體，然后再與ARE 特異性結合，激活相應靶基因[40,41]。

2 Keap1-Nrf2/ARE 通路的激活機制

目前關于Nrf2 激活機制的研究已經取得了很大進展（圖1）。Keap1 是一種直接與Nrf2 結合并負向調節Nrf2 轉錄活性的蛋白質[15]。Nrf2 活化后可與ARE 結合激活多種抗氧化基因，但Nrf2 的持續激活也會導致細胞組織氧化應激損傷[42]。Keap1 是泛素連接酶的銜接蛋白，Keap1 依靠E3 泛素連接酶促使Nrf2 以Keap1 依賴的方式泛素化，被蛋白酶體系統降解[43,44]，這使得Nrf2 蛋白水平在非應激條件下較低。Nrf2 激活化合物，攻擊高活性半胱氨酸殘基來抑制Keap1 的功能，并穩定Keap1-Nrf2 結合。因此在非應激條件下Nrf2 以Keap1-Nrf2 復合體的形式存在[45]。

Nrf2 的活化主要是Keap1 介導的泛素化對其降解作用減弱。Keap1 的Cys273 和Cys288 殘基會抑制Nrf2 核積聚，但用親電試劑可將半胱氨酸殘基突變為丙氨酸，可使依賴于Keap1 的泛素化降低。位于BTB 區的Cys151 被氧化或共價修飾時，可使Keap1 對Nrf2 的抑制和泛素化減少[46]。除了Keap1依賴的降解，磷酸也可調節Nrf2 蛋白化。Nrf2 作為胰腺內質網激酶（Protein kinase RNAlike ER kinase，PERK）的底物，可被其直接磷酸化觸發Nrf2-Keap1復合物的解離；磷脂酰肌醇3 激酶（Phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PIK3）可通過重排絲狀肌動蛋白的方式來改變Nrf2 的結構進而激活Nrf2；蛋白激酶C（Protein kinase C，PKC）、絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen activated protein kinases，MAPKs）和細胞外信號調節激酶（Extracellular signal regulated kinase，ERK）可以直接磷酸化Neh2 的Ser-40 來激活Nrf2[47]（圖1）。

3 Keap1-Nrf2/ARE 信號通路在魚類中的抗氧化功能

3.1 抗氧化作用

魚類的生長與飼料營養成分的比例息息相關。如膽堿缺乏可引起肝臟和腸道的氧化損傷[48,49]，導致多種疾病。Pei 等[50]給建鯉Cyprinus curpiovar Jian幼魚飼喂不同含量膽堿的飼料65 d，然后測定肝胰腺和腸組織的抗氧化酶活性及相關基因表達，發現膳食膽堿缺乏下調了肝胰腺中錳超氧化物歧化酶（MnSOD）、血漿谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）以及Keap1b、GST 的mRNA 水平和腸道Nrf2 蛋白水平，同時上調了肝胰腺中GPx、Keap1a 和PKC 的mRNA 水平，證明膽堿缺乏引起的氧化損傷與肝細胞和小腸中抗氧化酶的Nrf2-Keap1 信號分子的轉錄變化有關。色氨酸是魚類必需的氨基酸，對魚類的生長具有重要意義[51]。Ke 等[52]用不同含量的色氨酸飼料飼養團頭魴，以了解色氨酸對機體抗氧化能力和免疫應答的影響使。結果表明，一定色氨酸含量的飼料可升高團頭魴體內SOD、過氧化氫酶（CAT）、總抗氧化能力（T-AOC）和GSH 的活性，顯著改善了團頭魴機體內Nrf2 水平，顯著降低Keap1的mRNA 水平；Liang 等[53]則評估了精氨酸對團頭魴幼魚腸道抗氧化狀態和免疫功能的影響，發現精氨酸可有效提高GPX、銅鋅超氧化物歧化酶（Cu/Zn SOD）活性，T-AOC 活性和GSH 活性，顯著提高總超氧化物歧化酶（T-SOD）活性和CAT 活性。精氨酸提高了團頭魴幼魚Nrf2 的mRNA 水平，降低了Keap1 的mRNA 水平；Zhen 等[54]研究了在池塘滾道養殖系統（IPR）中放養密度對團頭魴引起的氧化應激，評估了高密度脅迫對團頭魴生長性能、抗氧化參數和Nrf2 的影響，發現高密度誘導了抗氧化防御涉及修飾Nrf2-Keap1 信號分子的酶和轉錄調控。

上述研究表明：無論是膳食營養或環境因素導致的硬骨魚類抗氧化活性的增強或抑制，其途徑都是通過調控Keap1-Nrf2/ARE 信號通路。因此，可認為以Keap1-Nrf2/ARE 信號通路介導II 相解毒酶和抗氧化基因的轉錄是細胞抗氧化機制中的關鍵通路。

3.2 抗炎癥反應

HO-1 可抑制NF-κB（Nuclear Factor Kappa B）依賴的TNF-α 的生成，這種抗炎作用可能與Nrf2抑制NF-κB 活性有關。Jia 等[55]用H2O2作為活性氧誘導羅非魚Oreochroms mossambcus 氧化應激造成肝損傷，評估潛在的分子機制。結果表明，72 h 內高水平的H2O2顯著提高了GPT、GOT 和AKP 活性和丙二醛（MDA）含量，顯著降低了SOD、GSH、CAT、GST 和T-AOC 活性。抑制了Nrf2/keap1 途徑、HO-1、NQO1 和GST 等下游基因，通過上調NF-κB、腫瘤壞死因子α（TNF-α）等mRNA 的表達而引起免疫毒性，激活炎癥反應。這說明Nrf2/Keap1 和NF-κB信號通路在魚類氧化應激性肝損傷中起重要作用；Jia 等[56]還研究了抗氧化藥物白藜蘆醇對羅非魚氧化應激性肝損傷的保護作用及其機制。結果表明，白藜蘆醇的調控機制主要是通過增強HO-1 等的mRNA 水平，激活了Nrf2 信號通路，抑制NF-κB 信號通路，降低IL-1β、TNF-α 等水平，從而降低H2O2所致肝損傷的炎癥反應；Zhang 等[57]探討了左旋肉堿在拉氏Rhynchocypris lagowskii Dybowski 體內外的作用，測定了Keap1、Nrf2、Maf 和HO-1 的mRNA 水平發現，左旋肉堿可以調控Nrf2/Keap1 通路的活化，抑制拉氏體內的NF-κB 信號通路來治療由膳食氧化魚油引起的拉氏炎癥反應。這些結果說明：氧化應激與炎癥有關，炎癥過程可誘導氧化應激，氧化應激也可通過激活多種途徑刺激炎癥反應，其機制都與Keap1-Nrf2/ARE 信號通路密切相關，今后可以此為方向做進一步的研究。

4 硬骨魚類Keap1-Nrf2/ARE 通路激活劑

Keap1-Nrf2/ARE 相關通路的激活劑可以有效地抑制由氧化應激誘導產生的一系列疾病。目前已開發出許多Nrf2 激活劑；一些天然及合成的小分子已被認定為ARE 系統的誘導劑，如上文提到過的膽堿、蘿卜硫素等。Li 等[58]對二萜類化合物進行了quinone reductase（QR）分析，新發現了16 種二萜類化合物是Nrf2 介導防御反應的潛在激活劑，其中異海松烷類二萜類化合物（Spopelopsiin A，SA）被認為是最有效的二萜類Keap1-Nrf2/ARE 信號通路激活劑，效價約是蘿卜硫素的5 倍。

除了一些化合物類激活劑外，中藥低污染、低副作用等優點，植物中藥有效成分對氧化應激作用的研究也越來越多。例如姜黃素是從植物姜黃中提取的黃色色素[59]。目前已證實，它可以通過修飾Keap1 上的半胱氨酸巰基，激活Keap1-Nrf2-ARE信號通路[60]。已有研究表明：姜黃素可有效抑制有機磷農藥毒死蜱（CPF）對鯉Cyprinus carpio 造成的氧化應激[61]；中藥腺毛菊苣（Cichorium glandulosum Boiss.et Huet）具有抗氧化活性和保護肝臟的作用[62,63]。JMa 等[64]則研究了腺毛菊苣提取物菊苣酸（Cichoric acid CRA）是否可以通過抗氧化調節對斑馬魚幼魚提供保護作用。其結果表明，CRA 激活了Keap1-Nfr2 和HO-1 通路，提高了斑馬魚體內SOD和GSH-Px 的活性；Yu 等[65]研究了一種胡蘆巴種子提取物（Fenugreek seed extracts FSE）對團頭魴幼魚的影響。結果表明，一定膳食比例的FSE 顯著上調了Nrf2 的mRNA 水平，下調了Keap1 的mRNA 水平，促進幼齡團頭魴的Nrf2 抗氧化能力和免疫應答；大黃素來源于許多廣泛使用的中藥材[66]。Son等[67]研究證明，大黃素增強了血清免疫和抗氧化酶活性，通過Nrf2-Keap1 信號增強了團頭魴的抗氧化能力，大黃素可作為一種有效的免疫刺激劑，用于保護生物體由氧化脂質引起的氧化應激。植物提取物不僅低污染、低副作用，有些甚至成本很低，非常適用于一些硬骨魚類的大規模養殖，今后可以此為方向進行Keap1-Nrf2/ ARE 信號通路激活劑的研究。

5 結語

Keap1-Nrf2/ARE 通路在抗氧化應激損傷中扮演著重要角色，但是有關魚類Keap1-Nrf2/ARE 信號通路的報道并不多見。有關魚類Keap1-Nrf2/ARE通路與其他信號通路之間交互作用、魚類和陸生動物Keap1-Nrf2 之間差異的研究更是少見。與陸生動物不同，硬骨魚類的Keap1 分為Keap1a 和Keap1b兩種，但具體的功能與作用機制還尚未定論，今后可以此為切入點進行更深一步的相關研究。目前在水產養殖中已發現越來越多具有抗氧化活性的天然植物提取物可調控Keap1-Nrf2/ARE 通路以預防或有效解決硬骨魚類的氧化應激問題，這為解決水產養殖業中出現的氧化應激和炎癥問題提供了新的思路。